紫外吸收法测定-过氧化氢酶的活性(准确,无误)

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法 【原理】 H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 【仪器与用具】 研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计； 【试剂】 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 【方法】 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。 2.酶活性测定 取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按2-14-1顺序加入试剂。 表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管 号 S1 S2 S3 管号 S0 S1 S2 粗酶液(ml) 0.2 0.2 0.2 蒸馏水/ml 1.0 1.0 1.0 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5                         将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 式中    A240 = AS0－ AS0为加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2为样品管吸光值； Vt为粗酶提取液总体积（ml）； V1为测定用粗酶液体积（ml）； FW为样品鲜重（g）； 0.1为A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t为加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 【注意事项】  凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。 【注】 所用H2O2溶液及KMnO4一溶液临用前需重新标定。