心肌细胞Na_Ca_2_交换电流

心肌细胞Na_Ca_2_交换电流 + 2 + 心肌细胞 Na 2Ca交换电流 ()梁 勇 王晓良 中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所 ,北京 100050 + 2 + + 2 + + 摘要 心肌细胞上存 在 Na 2Ca交 换 系 统 , 以 3Na : 1Ca方 式 交 换 , 产 生 Na 2 2 + + 2 + ( ) Ca交换电流 I。分子生物学实验证明 : Na 2Ca交换体有 11 个跨膜片段 ,其Na2Ca+ 2 + 功能受多种因素的调节 。膜片钳制技术研究明 Na 2Ca交换电流与心肌细胞动 + 2 + 作电位形成和心律失常的产生有关 。通过对 Na 2Ca交换系统的深入研究 ,将有助 + 2 + 于我们研制和开发作用于 Na 2Ca交换电流的特异性较强的药物 ,对治疗心律失常 和保护心肌细胞 ,减少心肌细胞的损伤有重要意义 。 + 2 + 关键词 Na 2Ca交换电流 ;心肌细胞 ;分子生物学 ;膜片钳制技术 + 2 + 2 + 2 + ( ) 近年来 ,Na 2Ca交换电流作为调节胞内 Ca浓度 Ca ]的重要机制之一 ,已经广泛 i2 + 受到研究人员的重视 。细胞内 Ca在几乎所有细胞的生理过程中都作为重要的第二信使 ,而 2 + + 2 + 2 + ( Ca ]的调控机制十分复杂 。除了许多已用于研究 Na 2Ca交换体 对调节 Ca ]起重 i i ) 要作用的一个转运系统的经典技术 ,新发展起来的电生理技术 ,荧光显示法和分子生物学方 + 2 + 法都已应用到 Na 2Ca交换体的研究中 ,对这个转运系统有了进一步的了解 。 + 2 + 一 、Na 2Ca交换电流的一般性质 + 2 + Na 2Ca交换电流首先是由 Reuter 和 Seitz 于 1966 年通过示踪流动实验在哺乳动物心 肌细胞上发现的 。与此稍早 ,Baker 等通过示踪流动实验在枪乌贼的巨大神经轴突上发现了 + 2 + 该电流 。1986 年 , Kimura 等首次描述了单个心肌细胞上 Na 2Ca交换电流的性质 ,并指出 2 + + 2 + 在调节心肌细胞胞质 Ca水平中 Na 2Ca交换电流具有至关重要的作用 。 + 2 + 1984 年 , Reeves 和 Hale 首次通过实验 ,改变跨膜 Na ]梯度使净 Ca跨膜流动为 0 ,得出2 + + + 2 + + 2 + Ca ]和 Na ]之间的立体关系 ,即 3Na :1Ca交换 ,因此 Na 2Ca交换是生电性的 ,每o o 2 + + 2 + ( ) 排出一个 Ca就有一个净电荷进入细胞 ,产生内向的 Na 2Ca交换电流 I。已经明确 Na2Ca + 2 + 的 Na 2Ca交 换 有 两 类 , 一 类 存 在 于 心 脏 , 枪 乌 贼 的 巨 大 轴 突 和 脑 的 大 部 分 细 胞 中 , 是 + 2 + + 2 + + ( ) McNaughto n . 1991; 3Na :1Ca转运 另一类是 Na 2Ca〃K 交换 ,存在于视觉细胞光受 + 2 + + ( ) 体的外层及中枢神经系统中的一些细胞 Cervet to , 通过 4Na : 1Ca〃1 K 交换 等 . 1989。 分子生物学已证明两种交换体的存在 ,它们的氨基酸顺序几乎没有同源性 ,但其空间结构具有 同源性 ,说明两类分子可能起源于一个共同的原始蛋白分子 。 + 2 + ( ) Na 2Ca交换体有两种不同的转运模式即“乒乓”模式 sequential mo del和“同步”模式 + 2 + ( ) () simultaneo us mo delBlaustein . 1977 , Ho dgkin 等 . 1987。在乒乓模式中 Na 和 Ca的转运 是两个分离的过程 ,即一侧的离子先与交换体结合 、转运 ,另一侧的离子再结合 、转运 。在同步 + 2 + 模式中 ,转运前膜两侧的离子独立结合 ,交换体结合 Na 和 Ca后同时转运两个离子 ,这种机 制中离子结合位点的亲和力不受膜另一侧的离子浓度的影响 。最近用膜片钳技术从心脏细胞 + 上获得的实验资料和通过测量交换体 Na 半循环的瞬时电荷运动得到的结果倾向于支持乒 + 2 + ( ) 乓模式 Khananshvili . 1991。但是 ,Na 和 Ca在交换体上具体的结合部位到目前还未见有 新的报道 。 + 2 + 2 + 2 + 2 + 细胞膜上的 Na 2Ca交换体与 A TP 驱动的 Ca泵 , Ca通道及胞内的 Ca摄取系统 2 + 2 + ( ) ( ) 一起调节 Ca ],交换体似乎更为重要 。因为它可以 1快速排出大量 Ca; 2调节胞内 i 2 + 2 + () Ca的贮存 ; 3当 Ca ]需要较长时间维持在一个相对较高的水平时起调节作用 。在心肌 i + 2 + 2 + + 细胞中 ,Na 2Ca交换 是 胞 膜 主 要 的 Ca排 出 系 统 , 哺 乳 动 物 心 肌 细 胞 上 存 在 很 多 Na 2 2 + - 2 - 1 μ Ca交换体 ,平均约有 250 个m ,其转换率约为 2500 s ,在一个心动周期中进入细胞的大 2 + + 2 + + ( ) 部分 Ca由交换体排出 Niggli 等 . 1991。Na 2Ca交换电流是双向的 ,通常以 Na 出入细 + 2 + 2 + + 胞的方向作为 Na 2Ca交换电流的方向 。正常状态下 ,通过胞内 Ca和胞外 Na 的交换而 2 + + 2 + + 2 + () 排出 Ca,这是 Na 2Ca交换体的主要方式 fo rward mo de;此外 Na 2Ca交换体还可以反 + 2 + 2 + ( ) 向转运 reverse mo de,即通过胞内 Na 和胞外 Ca的交换而使 Ca流入 。 + 2 + 心肌细胞上 Na 2Ca交换体的氨基酸顺序与其转运调节之间的关系已基本阐明 ,这与分 子生物学和膜片钳技术的应用是分不开的 。 + 2 + 二 、Na 2Ca交换体的分子生物学结构 + 2 + 1990 年 ,Nicoll 等首次从狗的心脏中克隆出 Na 2Ca交换体 ,这对于从事心肌细胞研究 ( ( ) 的生理学家来说无疑是一个重大发现 , 随后从人的心脏 Kof uji 等 . 1992, 牛的 心 脏 Aceto + 2 + ( ) ) 等 . 1992及兔的肾脏 Reilly 等 . 1992中也克隆出 Na 2Ca交换体 ,并且发现在不同种属和 组织中交换体的顺序和功能具有相似性 。 1 交换体的分子结构表明其有 12 个跨膜部分,第一个跨膜片段是前导肽 ,断裂后剩 下 11 个跨膜片段 ,氨基端在膜外 ,羧基端在膜内 。前五个片段在氨基端 ,片段 4,5 之间的区 + + 域与 Na 2K A TP 酶的相似区域有 48 %的同源性 。片段 5 和 6 之间是较长的疏水性片段 ,在 () 膜内形成一个很大的环 ,其氨基端 219,238 氨基酸残基包含许多碱性氨基酸散布在疏水性 氨基酸之间 ,氨基酸的这种分布与许多蛋白质上的钙调素结合区结构相似 ,而钙调素结合区已 () 被证实具有自动抑制 autoinhibito ry作用 ,即与结合区相应的一段肽链对整个蛋白质的功能 1 具有抑制作用。根据这个发现 ,合成了一段与 219,238 氨基酸残基相应的短肽 ,这段肽能 () 从胞内抑制交换体的功能 ,命名为 XIP exchange inhibito ry pep tide,是目前发现的特异性最 + 2 + ( 高的 Na 2Ca交 换 体 抑 制 剂 。内 源 性 XIP 区 域 具 有 这 种 自 动 抑 制 作 用 Mat suo ka 等 . ) 1997,它作用于片段 5 和 6 之间疏水性区域中的酸性氨基酸 。交换体羧基端 200 个氨基酸中 + 2 + 包含疏水性区域和余下的 6 个跨膜片段 。在 Na 2Ca交换过程中 ,离子必须跨膜 ,跨膜片段 中有许多带正电荷的氨基酸残基和含羟基的残基 ,大部分跨膜片段具有两性 ,一面是疏水的氨 基酸残基 ,另一面是具有亲水性的氨基酸残基 ,这些两性分子构成的螺旋或许在膜内形成了离 1 ( ) 子转运的通道。将完整的 cDNA 插入表达载体在人胚肾细胞 H E K 293 细胞中进行表达 , + 2 + 2 发现该细胞具有与天然 Na 2Ca交换体相似的电学和转运功能。 + 2 + 三 、Na 2Ca交换的调节 + 2 + 2 + Na 2Ca交换受胞内 A TP 和 Ca ],p H 值及胞外碱性金属阳离子等的调节 ,膜的脂质 i 成分也能调节交换体的活性 ,细胞内外的渗透压和氧自由基可影响 I的大小 。 Na2Ca 2 + 采用膜片钳技术的 inside2o ut 和 o ut side2o ut 方式研究了 A TP 和 Ca ]对 I的调节 。 i Na2Ca A TP 参与调节的具体机制还不很清楚 ,研究较多的是参与磷酸化过程 ,从心肌膜片获取的资 2 + 2 + + 2 + 交换体是主要的 Ca排出机制 ,在静息状态 , Ca ]很低 ,Na 2Ca交换体的转换速率受到 i 2 + 2 + + 2 + 2 + 很大限制 ,只排出很少的 Ca;当 Ca ]增加时 ,通过 Na 2Ca交换体排出的 Ca也相应i + 2 + 2 + 增加 ,而且 Na 2Ca交换体通过调节 Ca ]水平在心肌的兴奋2收缩偶联中发挥重要作用 。 i + + 2 + 2 + 3 + 胞外碱性金属阳离子 : Rb 、Li 、M n、Ni和 L a等都是作用较强的离子 ,可电压依赖性地 + 2 + + 2 + () 阻断 Na 2Ca交换电流 。Wright 等 1995发现胞外渗透压的变化影响 Na 2Ca交换 ,如豚 鼠心室肌细胞处在低渗溶液中 I变小 ,渗透压增加时 I增大 。心肌缺血时 ,细胞内外的 Na2CaNa2Ca + 渗透压发生变化 ,胞内渗透压随着缺血时间的延长而增加 。离体大鼠心脏在缺血期间 Na] i 2 + 不断增加 ,发生再灌注后的前两分钟迅速增加 ,与此同时 , Ca ]在短时间内也快速增加 ,此 i + 2 + 2 + 时 I的减小可能是为了减轻反向 Na 2Ca交换带来的 Ca超载 ,这个从整体器官得到的 Na2Ca 结果还有待于在单个细胞上得到证实 。 + 2 + + 2 + 当胞内 p H 从 7 . 4 降至 6 . 4 时 Na 2Ca交换被显著抑制 ,表明 Na 2Ca交换体对 p H 值 ( ) 非常敏感 Philip so n 等 . 1982。在胞内运用糜蛋白酶进行蛋白水解后发现 p H 值的这种作用 被消除 ,说明质子抑制作用的位点可能是蛋白质上易被蛋白水解作用的部位 ,即片段 5 和 6 之 2 + + 间的大的胞内环 ,这个环上还包含有 Ca ]、Na ]和 A TP 的调节位点 。 i i 2 + () 众所周知 ,氧自由基 O FR参与 Ca超载的病理过程和心肌再灌注引起的心律失常 。心 肌组织在经历长时间的缺血后发生再灌注时可导致收缩功能异常和室性心律失常 ,引起不可 2 + + 2 + 逆的损伤 。O FR 的产生和胞内 Ca超载密切相关 。正常条件下 ,Na 2Ca交换的主要功能 2 + + + 2 + 是使 Ca排出细胞 ,但在缺血再灌胞内 Na 水平升高时 , Na 2Ca交换体可反向转运 ,即使 + 2 + 2 + Na 流出 ,Ca流入 。这不仅加重 Ca超载 ,而且还产生病理性的外向电流 ,增加再灌注时心 + 2 + 3 2 + 律失常产生的机会 。O FR 可直接增强 Na 2Ca交换,从而进一步加重 Ca超载 。 + 2 + 四 、Na 2Ca交换电流的生理学和病理学意义 + 2 + 心肌细胞膜上的 Na 2Ca交换体对于兴奋后的心肌恢复到静息状态至关重要 。在兴奋 2 + 2 + 2 + 2 + ( ) 过程中 ,Ca通过 Ca通道进入细胞并诱导肌浆网 SR释放 Ca,此过程称为 Ca诱导的 2 + 4 2 + () Ca释放 calcium induced calcium release , C ICR。Ca与收缩蛋白相互作用引起细胞收 2 + 2 + 2 + 缩 ;在舒张过程中 ,Ca又被 SR 重新摄取 ,而且经过 Ca通道进入胞内的 Ca还可以排出细 + 2 + 2 + 胞 ,Na 2Ca交换是将过多的 Ca排出细胞的主要方式 。 2 + 2 + 在许多细胞中 ,胞膜上 A TP 驱 动 的 Ca泵 在 调 节 静 息 状 态 Ca ]中 起 主 要 作 用 , 而i + 2 + 2 + + 2 + 2 + Na 2Ca交换体可对 Ca ]进行更精细的调节 。通过 Na 2Ca交换体把内向电流与 Cai 2 + 2 + + 2 + 2 + 排出联系在一起 ,当 SR 释放 Ca和胞内 Ca开始升高时 ,Na 2Ca交换和 SR 上的 Ca泵 2 + + 2 + 将从胞质中移去 Ca。有两个重要的因素影响 Na 2Ca交换的时间过程 ,首先是胞内游离 2 + + 2 + 5 2 + Ca ; 其次是膜电位的变化 ,因为 Na 2Ca交换是电压敏感性的。如果胞内 Ca瞬变发 + 2 + 2 + 生在平台早期而此时的膜电位变化很慢 , Na 2Ca交换的时间过程则主要由 Ca瞬变的时 2 + + 2 + 2 + + 2 + 间过程来决定 , Ca ]升高时 , 激活 Na 2Ca交换 ; Ca ]降低时 , Na 2Ca交 换 失 活 , i i 2 + 2 + 2 + 2 + (I的大小与 Ca ]呈线性相关,Na 2Ca交换反映 Ca瞬变的时间过程 Barcenas 等 . Na2Cai ) 1987。 I与心肌细胞 A P 形成和心律失常的产生有关 。在 A P 平台期 , I在 12 ms 内被激Na2CaNa2Ca 4 + 2 + 6 活 ,200 ms 内完全失活。也有人报道 Na 2Ca交换电流在复极晚期被激活,这可能是快 速复极期间交换电流的持续或在一定程度上被重新激活 。室温下到的大鼠心室肌细胞 A P 较短 , I参与了 A P 的复极 ,在心房肌细胞也参与了 A P 的复极 。在一个心动周期中 , Na2Ca 2 + + 2 + + Na 2Ca交换电流的激活依赖于多种因素 ,胞内外的 Na ]和 Ca ,其它电流成分的平衡 , 6 SR 的作用等 ,所有这些因素在不同动物之间 ,不同的细胞类型和发展阶段表现不同。在大 + 2 + () 多数组织 兔心房 ,大鼠和豚鼠心室和人心房肌细胞中 ,Na 2Ca交换可产生一个去极化的 2 + 内向电流 ,因此除了 A P 复极起始期 ,在平台期的大部分期间 Ca是外流的 ;在其它一些组织 + 2 + 7 中 ,如兔心室肌细胞 ,在平台期的大部分时间 Na 2Ca交换产生一个外向的复极化电流。 + 2 + 8 近年 的 研 究 发 现 , 心 肌 病 可 增 强 Na 2Ca交 换 的 作 用。在 有 心 肌 病 的 叙 利 亚 仓 鼠 2 + 2 + () Bio 14 . 6中 ,L 型 Ca电流诱发的 Ca释放过程中可形成一个较大的 I,这可能是 SRNa2Ca 2 + + 2 + 摄取 Ca发生改变所致 。在心衰晚期病人的心室肌细胞中发现 Na 2Ca交换体的转录和翻 2 + + 2 + 2 + 译增加 ,与 SR 上 Ca泵活性下降相平行 ,这些发现说明 Na 2Ca交换可能是 SR 对 Ca摄 取的能力下降的一种代偿作用 。正如在各种心肌肥厚和心衰模型中表现的那样 ,心肌病过程 + 2 + () 中动作电位时程延长可能是由于 Na 2Ca交换作用增加所致 。I与 A P 迟后除极 DADNa2Ca 9 9 的形成有关。DADs 引起的触发活动一直被认为是心律失常产生的主要机制 ,在人 和豚 10鼠 心房肌细胞中 ,DADs 主要是由 I产生 。 Na2Ca + 2 + 总之 ,所有研究表明在不同种属 ,细胞类型和疾病之间 ,Na 2Ca交换在心肌电活动和收 + 2 + 缩过程中的作用差异很大 。因此 ,研究 Na 2Ca交换在人心脏中的具体作用尤为重要 。 参 考文献 1 Nicoll DA , Philip so n KD. Molecular st udies of t he ular myocytes of t he guinea pig st udied wit h actio n potential clamp . Pflugers Arch , 1990 , 416?230, cardiac sarcolemmal sodium2calcium exchanger . 237 . Ann N Y Acad Sci , 1991 , 639?181,188 . Hatem SN , Sweeten T , Vet ter V , et al . Evidence Schulze D , Kof uji P , Hadley R , et al . Sodium/ cal2 2 7 2 + 2 + for p resence of Ca2channel2gated Castores in cium exchanger in heart muscle. Cardiovasc Res , 1993 , 27?1726,1734 .neo natal at rial myocytes. Am J Physiol , 1995 , + 2 + Goldhaber J I. Free radicals enhance Na /Ca 3 268?H1195,1201 . + exchange in vent ricular myocytes. Am J Physiol , 8 Hatem SN , Sham J S , Morad M . Enhanced Na2 2 + 1996 , 271?H823, H833 .Caexchange activity in cardio myopat hic Syrian 2 + 4 Grant ham CJ , Cannell MB . Cainflux during t he hamster . Cirs Res , 1994 , 74?253,261 . cardiac actio n potential in guinea pig vent ricular Benardeau A , Hatem SN , Martin CR , et al . Co n2 9 + 2 + myocytes. Circ Res , 1996 , 79?194,200 . t ributio n of Na / Caexchange to actio n potential Bridge J HB , Smolley J , Spitzer KW , et al . Volt2 of human at rial myocytes. Am J Physiol , 1996 , 5 age dependence of sodium2calcium exchange and t he 271?H1151,1161 . Lipp P , Pot t L . Transient inward current in co nt rol of calcium ext rusio n in t he heart . Ann N Y 10 guinea pig at rial myocytes reflect s a change of Acad Sci , 1991 , 639?34,47 . sodium2calcium exchange current . J Physiol , Doerr T , Denger R , Doerr A , et al . Io nic current s 6 1988 , 397?601,630 .co nt ributing to t he actio n potential in single vent ric2