重组DNA 转化原理、步骤

重组DNA 转化原理、步骤 体外连接的重组DNA分子导入合适的受体细胞才能进行大量复制，增殖和达，其首要目的是获得大量的克隆基因。虽然PCR技术，体外转录及翻译系统能部分达到大量扩增的目的，但毕竟受到体外操作的许多限制。重组质粒导入宿主细胞最常用的方法之一就是转化(transformation)。转化这一概念来源于遗传学:细菌细胞的生物学由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。很多细菌如杆菌，链霉菌属能自然发生转化，其它菌属包括大肠杆菌自然状态下无法发生转化，但可以通过人工诱导使其处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态(competence)，从而使转化得以高效率地进行。大肠杆菌的转化简便易行，它在分子克隆中占据极为重要的地位。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内，这项技术始于Mandel 和Higa 1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2 溶液处理短暂热休克后，容易被噬菌体感染，随后Cohn 于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。其原理是细菌处于0?，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘付于细胞表面，经42?短时间的热激处理，促进细胞吸收复合物。在富裕培养基中生长一小时后，质粒拷贝数增加，抗性基因得以表达，球形的感受态细胞得以复原。最后通过含抗生素的抗性平板筛选转化菌落。其过程图5所示。[ 图5 质粒转化大肠杆菌的过程 Ca 2+处理的感受态细胞，一般转化率为105-106/ug DNA。环化重组质粒愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线状DNA分子的转化率高。在Ca2+的基础上，联合其他金属离子( 如 Mn2+、Co2+)，DMSO或还原剂等物质处理细菌，使转化率提高数百倍。 除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高达到109-10/ug DNA，因操作简便愈来愈为人们所接受。 基因克隆的最后一道工序就是从众多的转化菌中筛选出目的阳性克隆并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得目的基因的大量拷贝，进一步研究该基因的结构、功能或表达产物。从大量的菌落或噬菌斑中鉴定出重组子有许多方法，如插入失活法、抗性筛选、蓝白筛选、杂交筛选、免疫学筛选、酶切图谱鉴定、PCR鉴定等。而蓝白筛选常用在重组子和非重组子的初步筛选中，它是通过载体和宿主菌之间基因内互补来实现。许多载体(如pUC,pBS等)都是带有包括乳糖操纵子的调控序列和编码β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的基因序列。并在编码区中构建了多克隆位点，它不破坏读框，可使几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影响功能。若有外源基因插入多克隆位点则破坏编码读框产生没活性的α肽段。宿主菌为缺失产生α肽段的突变体，但能产生其余肽段。两者之间进行基因内互补就产生有活性的β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因在IPTG的诱导下产生肽段与宿主菌其余肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶 。此酶能使显色底物X-gal分解成蓝色化合物，从而使菌落发蓝。若有外源片段插入载体的多克隆位点，则使β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，形成白色菌落。利用此方法仅通过目测就轻而一举地筛选出重组菌落。 一、材料，试剂和仪器 1 材料: 受体菌DH5α ，含lacZ`的重组质粒。 2 试剂: 1)LB固体培养基 2)LB液体培养基 4)0.1mol/L CaCl2 5)抗生素母液 6) 0.5mol/L IPTG 7) 100mg/mL X-gal 3仪器: 恒温摇床， 冰冻离心机，恒温培养箱， CaCl2转化法 (1) 划线复壮宿主菌37?过夜。挑一单菌落于30mL LB液体培养基中，37?，200rpm摇至OD600=0.2-0.4，取出置于冰上10-15min。 (2) 取1mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中。4?,5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干残存培养基，加500μl冰预冷的0.1M CaCl2,重悬菌体，置冰浴15-30min。 4?,5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干水，加100μl冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体。放置于4?用于转化，若不用则加30%甘油置-70?备存。 (3) 加入10μl连接产物到100ul感受态细胞中，轻旋以混和内含物，置于冰上30min。 (4) 42?热休克90sec，不要摇动试管。置冰上1-2min。 (5) 加400ul 液体培养基，37?150rpm摇培45-60min。 (6) 微波炉融化LB固体培养基，待冷却至50?左右时，根据载体的抗性加入相应的抗生素，如Km 母液至终浓度50ug/mL或Amp母液至终浓度60ug/mL ，摇匀。趁热倒平板，每板20mL左右，室温下凝固10-15min。 (7) 取适量菌液(体积别超过200 ul，如果想多涂菌可以先室温下5000rpm离心5min回收细胞，弃去一部分培养基后，重悬细菌后再涂)，加入5ul IPTG(0.5M)和30ul X-gal (100mg/mL) ，混匀，加到抗性平板上，用烧过灭菌的涂布器涂布器涂匀，涂布器应凉下来用，否则容易烫死细菌。 (8) 培养皿用石蜡膜封好后，37?倒置培养过夜。待出现蓝色时取出放在4?冰箱中，使其颜色更加明显。 注意: 1 )质粒DNA要纯 2 )受体细菌的OD600nm=0.3-0.4 3) 重组质粒的体积小于转化菌液体积的1/10。 三、结果与分析 若抗性平板上出现白色菌落，连接的重组质粒被转化。根据蓝白的比例可以判断重组率，根据菌落数目可以计算出转化率。一般来说采用定向连接的重组质粒的重组率较高，而平末端或单一酶切位点连接的重组率较低。 转化是一定设不加质粒只含感受态宿主菌的负对照和加入已知抗性的质粒的正对照，以便分析结果。如果负对照长出菌落说明感受态宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正对照没出来，说明感受态细胞有问或加错抗生素或操作过程中造成细菌死亡(如涂布时烫死)。