【doc】胆固醇结石、胆囊黏膜和胆汁细菌DNA的检测
胆固醇结石、胆囊黏膜和胆汁细菌DNA的
检测
2004年11月第24卷第11规ci』ig.Q:!
胆固醇结石,胆囊黏膜和胆汁细菌DNA的
检测
蔡端朱雷明吕元刘维薇张延龄
【摘要】目的探讨胆固醇结石中细菌DNA的意义.
用半定量PCR和16SrRNA序列分
析法检测胆囊黏膜,胆汁和胆石的细菌DNA,观察围手术期抗生素的使用对检测结果的影响.结果
(1)结石核心,外周,胆汁和胆囊黏膜细菌DNA阳性率分别为79%,82%,77%和64%.胆石,胆汁和胆
囊黏膜间细菌DNA阳性率无相关性.(2)结石核心,外周,胆汁和胆囊黏膜细菌菌落数对数值(cfu)分
别为3.19?2.09,3.26?2.05,3.23?2.14和3.28?2.70.结石内外菌落数相关系数为0.822(P<
0.05).胆汁和胆囊黏膜菌落数不相关.胆石核心及外周与胆汁和胆囊黏膜菌落数均不相关.(3)术
前用与不用抗生素者胆汁,胆囊黏膜,胆石核心和外周的细菌DNA阳性率均差异无显着性.但用抗生
素者胆汁菌落数下降,与未用抗生素组比较差异有显着性(P<0.0I),
而胆囊黏膜,胆石核心和外周的
菌落数则差异无显着性.(4)胆石,胆汁,胆囊黏膜的细菌DNA序列并
不完全相同,胆石核心与外周部
位的DNA序列也不相同.结论胆固醇结石中细菌DNA可能并非胆
道环境细菌污染的结果.较之胆
汁和胆囊黏膜的细菌DNA,胆固醇结石中的细菌DNA与结石形成
的关系更密切.
【关键词】胆固醇结石;细菌
DeterminationofbacteriaDNAincholesterolgallstones,
Lei—ming,LUYuan,ela1.DepartmentoJ?Surgery,
FudanUniversity,Shanghai200040,China
gallbladderi~lucosaandbileCAIDuan,ZHU
HuashanHospital,ShahghaiMedicalCollegeof
【Abstract1ObjectiveToclarifythesignificanceofbacteriaDNAincholestero
lgallstone.Methods
Semi—quantitativePCRandcomparative16SrRNAanalysiswereusedtodetectbacteriaDNAingallbladder
mucosa,bileandcholesterolgallstones.Theinfluenceofperi—operativeuse
ofantibioticsolltheresultsofde—
tectionwasalsoobserved.Results(1)ThepositiverateofbacteriaDNAincore
andperipherypartofgall—
stones,bileandgallbladdermueosawas79%.82%,77%and64%respectively,withnopositivecorrelation
existedamongthem.(2)Thebacteriaconcentrationsincoreandperipherypartofgallstones,bileandgall—
bladdermuco~were3.19?2.09,3.26?2.05,3.23?2.14and3.28?2.70cfu(1ogvalue)respectively.
Thebacteriaconcentrationincorepartofgallstonecorrelatedwiththoseofperipheryones(r=0.822,P<
0.05).Nocorrelationexistedbetweenbileandmucosabacteriaconcentrations.Thebacteriaconcentrationsin
coreorperipherypartofgallstonedidnotcorrelatewiththoseofbileandmucosea.(3)Whetherornotusing
antibiotics,nodifferencesofbacteriaDNApositiveratewereobservedoncoreorperipherypartofgallstones,
bileandmuco~x3.Thebilebacteriaconcentrationsfellsignificantlyafterreceivingantibioticsinperi—operation
period,whilenochangesoncoreorperipherypartofgallstonesandmucosawereobserved.(4)Thebacteria
DNAsequencesingallstones,bileormucosawereoftendifferent.eventhesequencesbetweencoreandpe—
ripheryofgallstonewereheterogeneous.ConclusionsThebacteriaincholest
erolgallstonemaynotbethe
outcomeofcontaminationfrombiliarytract.Comparedwiththebacteriapres
entedinbileormucosa,thebac—
teriaincholesterolgallstonemayplayamoreimportantroleintheformationof
cholesterolgallstones.
【Keywords】Cholesterolgallstone:Bacterium
用PCR和16SrRNA序列
法在胆固醇结
研室
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070737)
作者单位:200040上海,复旦大学医学院附属华山医院外科教
——
647——
论着?
石中发现有丰富的细菌DNA,但这些细菌与胆固醇
结石形成的确切关系尚不明确一.本实验拟对胆
固醇结石患者的胆囊黏膜,胆汁和胆石的细菌DNA
检出率和细菌种类进行比较,并观察围手术期抗生
648华消化杂志2004年L县箜鲞筮塑』g:!:Q!!:,.
素使用对检测结果的影响,以探讨细菌在胆固醇结
石形成中的地位.
材料和方法
一
,病例及取材
2001年8月,2002年4月在复旦大学附属华
山医院接受择期胆囊切除术的胆固醇结石患者38
例,年龄21,82岁,平均50岁.诊断经病理证实.
患者术前3个月内无急性胆道感染症状.其中l6
例患者围手术期预防性应用抗生素.于术中切除胆
囊后抽取胆囊胆汁5ml,剪取胆囊组织1块.同时
收集胆囊结石,记录其大小,数目,用生理盐水冲洗
干净.标本放在无菌容器内一20?保存.
二,DNA提取
1.胆石:干燥至恒重后取150mg结石粉末用
1%SDS700l在5ml聚丙烯试管内室温培养过
夜.加氯化锂(7mol/L),最终浓度为1.5mol/L.
静置15min.震荡1min,12000g离心15min,取
上清液至Eppendorf(EP)管,用等体积饱和苯酚抽
提2次后,取上清液,加入等体积氯仿一异戊醇抽提1
次,12000g离心10min,取上清液,加1/10体积的
3mol/L醋酸钠.再加无水乙醇(终体积比80%),
一
70?静置2h,全部倒入收集管内的吸附柱中,离
心,将柱放入干净EP管中,加20ulTE洗脱液洗
脱,静置1min,12000g离心10min,洗脱液为提取
到的DNA,一20?保存.
2.胆汁:取500”l胆汁,DNA提取方法同上.
3.胆囊黏膜:15mg胆囊黏膜剪成碎块,DNA
提取方法同上,但省去氯化锂处理步骤.
三,PCR扩增
根据细菌16SrRNA序列
引物并由中国科
学院上海生化细菌所合成.pl:5一AGAGTTTGAT一
(c/t)(c/a)TGGCTCAG一3;p2:5一ACCGC(g/t)一(a/
g)CTGCTGGCAC一3.PCR反应体系50l包括
Taq酶(5U1)0.5ul,10×PCR缓冲液5t*l,MgC12
(25mmol/L)4ul,dNTP(2.5mmol/L)4ul,25
pmol/L引物pl,p2各1l,模板ll,灭菌蒸馏水
33.5I.各周期的变性,退火和延伸温度和时间分
别为起始循环95?3min,55lmin,74?l
min,然后95?3min,55?1min,74?1rain,进
行35个循环,完成循环后72?保温5min,4?冷
却后终止反应.每次PCR反应时设立一个不含
DNA模板的体系作为空白对照.
四,PCR产物的检测分析
PCR产物经溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶
电泳,紫外灯下观察500bp的特异性扩增条带,回
收纯化样品克隆至T载体,每个样品挑5个克隆测
序(联合基因公司).测序结果与细菌基因库数据进
行对比鉴定菌种.
五,
菌落计数曲线的建立
参照Swidsinski等l4j的方法,取E.coli质控菌
(ATCC25922)分别稀释至10,10cfu/ml,各浓度
菌液各取1ml,按照上述方法提取DNA并行PCR
扩增30个循环(此时反应曲线斜率最高).PCR产
物电泳照片用Tanon图像处理系统进行灰度扫描
并绘制菌落计数曲线.PCR35个循环结果为阳性
的样品,模板DNA均与不同浓度的E.coli质控菌
同时行30个循环PCR,通过灰度扫描比较进行菌
落计数.
六,结石胆固醇含量测定
参照Swidsinski等…1的方法,结石磨粉并取50
mg于105?干燥,用1ml甲基叔丁醚在震荡器上
提取5min,12000g离心5min,取50l上清液,用
乙腈(67%体积)和甲基叔丁醚的混合液稀释40倍
(1.95m1).用50mg纯胆固醇同法制备标准品,用
酶法测定.胆固醇含量大于70%者为胆固醇结石.
七,统计学检验
由复旦大学医学院卫生统计与社会医学教研室
协助完成.采用SPSS统计软件.计量指标若为正
态分布且方差齐性,用t检验,否则用非参数检验;
计数指标用Pearson卡方检验;计量指标与计数指
标关联性用非参数检验.P<0.05为差异有显
着性
结果
一
,细菌DNA检出率
细菌DNA阳性率在结石核心为79%(22/28),
结石外周为82%(23/28).结石内外细菌DNA阳
性率有显着关联性(P<0.01).胆汁细菌DNA阳
性率为77%(23/30),胆囊黏膜细菌DNA阳性率为
64%(23/36).胆石,胆汁和胆囊黏膜问细菌DNA
检出情况并不平行.胆石细菌I)NA阳性者中,胆
汁细菌DNA为阴性者占18.2%,黏膜细菌DNA为
阴性者占45.5%.胆石核心细菌DNA阴性者中,
胆汁细菌DNA为阳性者占50.0%,黏膜细菌DNA
为阳性者占83.3%.胆石外周细菌DNA阴性者
中,黏膜细菌DNA为阳性者占40%.统计学检验
显示,胆石,胆汁和胆囊黏膜间细菌DNA阳性率无
譬缝盘查【望I『望鲞望ll_J_L!J4V?24.
荚联性(胴汁口H囊黏膜比较.fl(II】.UU恢t
与胆汁和胆鬟黏膜比较,P值分别为[15981
0.673:胆石外周与汁和帆嵌i膜比较.P分别为
【I544干u1[1【1)
细茼菌落教(取刊数值?
I质控茼浓度梯度的建立:1屁示.对数稀
释的”“质控茼1)NA的Pt,R产物绦电泳l具
有怠好的线性关系1(JrfLR产物儿乎阴性
反应.10cfuI(„R产物旱弱阳肚,10,Ii)f?f?K
产物呈强阳性
托记物,III-lllI{Il_
手l=JIIl.cfu
图1f,目稀释侣城J
2标术的闰落计数:J)结干恢IL,简落数由
(319?209)c[u.结百外周f326士2(15,『ll,
两者差异无显着性ctLt3758)f2)ml汁细菌菌
落数为【323?2l4)cfu,胆囊黏膜蔺落敞为c328
?270)c3)内外曲落数中H关系数为
0822ft<I=J05)l汁和月日囊黏膜莳落数锕关
【fJ_,fl755).胆石核心_j月H汁和归踅稚膜茼蒲数
均不相关(P值分由l】_6I4晕?n166).外用
与胆汁和胆鞋黏噗菌落数亦均相关fJ值分别为
01【J和0.221))
,1术前使用抗牛素与细菌DNAm性 较差舁有显蓍cP<0叭).囊
稚心落数l1不百
核心和外周的卣落数也莘异无显着(P值分别2,J
03680600和(I477,
旧,P(„】产物测序结粜
标木细葡DNAm性者椰为泄合感,缚标
本f{t细茼1)NA序列2,5种不等.菌种主要包括
大肠杆菌,铜绿假单胞苗,金黄邑葡萄球茼,链球菌,
鞘氮醇胞菌,瞻弱类杆茼和癣疮阿仵茼.其一{I摊
幢丙酸杆菌的1)A在胆亓和肌汁IfI均有榆….另
有不动杆曲黄杆菌等临床少岫条件致病随,”段
柱院环境中榆驯到的细茼如
w?j川ki等川十H隔6I卜.r】后重新检测了原
魁细茼1)NA为性的结石.结果发现阳件率{Ill着
下降,细菌DNA序列的种类和数量发生变化:并
志2004年11月第24卷第11期ChinjDig,Nov.!..
认为这是因结石中的细菌DNA发生降解以及不同
细菌降解速度不同所致.揭示结石中检测出的细菌
DNA是细菌不断沉积的结果,而且较结石形成初期
的细菌谱发生巨大变化.然而Swidsinski等未研究
细菌在胆石中的分布情况.本实验将胆石剖为核心
和外周部分,分别检测细菌DNA和菌落数,发现两
者差异无显着性.提示细菌在结石中的沉积是均匀
的,胆石核心所代
的早期细菌DNA并不降解,也
不影响检测.另外,体外的降解实验可能不能代表
体内的情况.本研究中术前使用抗生素可使胆汁中
菌落数明显减少,但是对胆囊黏膜,胆石的核心部分
及外周的菌落数不产生影响.这可能与胆道中的细
菌具有一定的自我保护机制有关.目前已发现胆石
中的沙门菌能产生生物膜覆盖在结石表面抵御胆汁
和抗生素的破坏,而且能粘附在膜上并借此与其他
细菌连接』.另有报道,在慢性胆囊炎合并胆囊结
石患者的胆囊中,L型细菌的比例为64%,高于常
规细菌培养的阳性率.L型细菌是变异的细菌壁缺
陷型细菌,致病力不强,抗原性较弱,在机体中可逃
避免疫系统的攻击,又因其对抗生素不敏感,可在胆
汁中长期生存,在某些情况下又可以转变为细菌型
而致病j.细菌的自我保护功能与胆道感染以及
结石的关系值得关注.
三,细菌DNA序列分析
通过细菌DNA的序列测定,发现DNA阳性标
本均为混合感染,但是尚不能从细菌的种类比较上
发现与结石关系最密切的细菌.本组发现的大肠杆
菌,铜绿假单胞菌,芽胞杆菌,金黄色葡萄球菌,痤疮
丙酸杆菌等与文献报道结果一致_】.j.本组发现痤
疮丙酸杆菌不仅在胆固醇结石中检出,而且在胆汁
中亦存在,其在胆固醇结石形成中的地位值得关注.
肺炎克雷伯菌是胆汁细菌培养最多见的菌种之
一
,但是本实验和文献中用PCR方法在非急性
胆囊炎患者的标本中均未测出其DNA序列,提示
该菌在胆道中主要与急性炎症相关,符合”致石菌种
与引起感染的菌种不完全相同”的观点l1.幽门螺
杆菌是近年来受到瞩目的另一种细菌,通常不能在
胆汁环境中生长.有人认为在胆汁pH环境改变情
况下或细菌为耐胆汁酸盐菌株时,细菌可能在胆道
寄居.然而其与结石的关系文献中存在不同观
点[11.本组用细菌16SrRNA通用引物,未测出
耐胆汁酸盐菌株序列,与Swidsinski等l1j和Lee
等的结果一致,可能与该菌在胆囊中数量过低或
未用特异性引物有关.本实验发现有较多临床少见
的条件致病菌或医院环境的污染菌,如不动杆菌,鞘
氨醇单胞菌,阿菲波菌,其在胆固醇结石形成中的作
用值得关注.
胆固醇结石中细菌DNA的发现更新了我们对
细菌与胆固醇结石关系的认识,但是尚不足以肯定
细菌参与胆固醇结石的形成.本研究证实胆固醇结
石中的细菌与胆汁和胆石中细菌意义不同,因此有
必要进一步比较胆固醇结石患者与非胆石症患者胆
道细菌感染的差异,并对细菌与胆汁热力学,动力学
的关系进行探讨.
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(收稿日期:2003—0611)
(本文编辑:杨学文)