脐血与外周血来源CIK细胞表面标志物及其功能研究

脐血与外周血来源CIK细胞表面标志物及其功能研究 1 .: :. :2 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行 研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个 人和集体,均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者: 张霞 日期:力,年月习日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大 学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人 授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可 以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校 后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一 署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者:效甓 期:珈.年月可日3 摘要 目的 恶性肿瘤的发生率与致死率依然呈上升趋势,作为一种有可能治愈肿瘤 的新型方法,过继免疫治疗得到广泛关注,其中细胞因子诱导的杀伤细胞 .,免疫治疗己被广泛应用。目前,临床上 主要应用的是外周血来源的细胞,但外周血细胞免疫治疗存在一定 的缺陷性,如增殖速率低、体内存活时间短,抗凋亡能力差。本研究主要比 较了脐血与肿瘤患者外周血来源细胞的增殖、免疫表型、免疫原性、激 活型和抑制型表面标志物、耐药基因的表达及化疗药物处理后的抗 凋亡能力;并建立食管癌的移植瘤模型,比较两种细胞在体内杀伤肿 瘤 。细胞的能力。 方法 使用.淋巴分离液分离脐血单个核细胞 ,及肿瘤患者外周血单个核细胞 ,,重悬于培养基含%胎牛血清, 加入细胞因子,,抗单抗和..诱导 培养。使用流式细胞术检测脐血与外周血的增殖、免疫表型、免疫 原性、激活型表面标志物、和抑制型表面标志物.的 表达;采用 /双染法检测顺铂处理后细胞的凋亡情况;使用 检测耐药基因的表达;使用酶联免疫吸附试验 .,检测小.、一 .仪的分泌;使用流式细胞术检测细胞 的表达;另外,购买周龄的/裸鼠,随机分为组,每组只。裸鼠 皮下接种× 。个细胞,成瘤后,通过尾静脉分别输注磷酸盐缓冲 液 ,、脐血细胞、外周血细胞一次, 然后观察皮下肿瘤体积变化。 结果4 摘要 脐血培养第 时增殖指数 ,显著高于外 周血【....,.。脐血经诱导培养 后、的表达显著低于外周血..%凇. .,.士.%坩.:.%,.】,其中 、 和的表达较外周血低..% .士. %,..%..%,..%..%,尸 .】, 的表达无差异胗.。脐血中细胞比 例较外周血高 ..% ..%,.】;脐血中 激活型、和细胞比例较外周血中 高.土.%..%,..%..%, ..%.士.%,.或.;而抑制型. 细胞的含量明显较低..%..%,.】,两者中 、.细胞的含量无显著差异.。此外,脐血 高表达耐药基因。顺铂处理后的脐血细胞凋亡率显著低于 外周血细胞【.士.%..%,.】。检测 显示脐血分泌的、较外周血高.,.的分泌 无显著差异【../ .. /,.。脐血上 的表达显著高于外周血细胞【..%.士.%,氏 .。裸鼠体内试验表明,脐血杀肿瘤的能力显著高于外周血。 结论 与外周血相比,脐血增殖能力强、活化水平高、抗凋亡能力强、 细胞因子分泌水平高,并且对肿瘤的杀伤功能强、治疗效果好,具有较佳的 临床应用潜能。 关键词:细胞因子诱导杀伤细胞;脐血;外周血:表面标志物;耐药基因 彳:顺铂;细胞因子;裸鼠5 . ,.., ,,.,,,?.,./., ,.?..% ,.. .,,, , , /.,. 6 ,, .【 ../, . .. ×. ,, . ,,,....土.,.. ,【.士.%.士.,.士.% .士.%,. 】, ,【.士.%.士.%,.土.%.士.%,.士.% .士.%,.. .. 【.士.%..】%,.. ,,?【. .% .士.%, .士 .% ..%, .士.%.士.%,. ., 一?.士.%.士.%,.. ... ,, .7 【.:.%.士.%,... 尸. , 一【 【.士./ .土. /,尸.. .士.%.士.%,.. ,.,,.,, .:;;;;;;; 8 目录 目录 中英文缩略词表??. 引言.. 材料与方法. .标本来源.实验动物.主要仪器.主要试剂.主要试剂的配制?.. .脐血与外周血单个核细胞的提取. .脐血与外周血的诱导及扩增培养? .流式细胞术检测细胞的增殖 .流式细胞术检测细胞的免疫原性、免疫表型及表面激活型和抑 制型标志物??一 .检测细胞耐药基因的表达??.. ..总的提取??.. ..反转录? .. 扩增目的基因 ./双染法检测细胞抗凋亡情况 .检测细胞内因子分泌情况??.. .体外检测细胞对靶细胞的杀伤功能??. .体内裸鼠实验.统计学处理 结果?. .脐血与肿瘤患者外周血的体外增殖情况一 .脐血与外周血的免疫原性及免疫表型?一 .脐血与外周血表面激活型和抑制型表面标志物的表达. .脐血与外周血耐药基因的表达及细胞凋亡 .法检测脐血与外周血细胞内因子分泌水平??一 9 目录 .脐血与外周血的体外杀伤功能?.. .体内裸鼠实验??. 讨论?. 参考文献.. 综述??.. 脐血的研究进展? 引言脐血的生物学特性.脐血的体外扩增培养? .脐血的细胞表型 脐血的抗肿瘤能力.脐血的杀伤机制 .脐血体内外的抗肿瘤作用。脐血的研究现状 展望? 致谢??.. 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果10 中英文缩略词表 英文缩写 中英文缩略词表 英文全名 中文全名 细胞因子 诱导的杀伤细胞 脐血单个核细胞 外周血单个核细胞 树突状细胞 过继性细胞免疫治疗 抗原递呈细胞 一、/ .肿瘤浸润性淋巴细胞 淋巴因子激活的杀伤细胞 ..干扰素吖 白介素. 肿瘤坏死因子.【 异硫氰酸荧光素 自然杀伤细胞 磷酸盐缓冲液 胎牛血清 酶联免疫吸附试验引言 引言 近年来,我国的恶性肿瘤发病率及死亡率均呈现上升的趋势,因此提高 肿瘤治疗的效果,进一步改善肿瘤患者的生活质量,减少癌症患者的复发率、 降低癌症的死亡率等是目前肿瘤研究工作的当务之急。随着肿瘤的分子生物 治疗理论和技术的建立,肿瘤生物治疗成为继手术、放射治疗和化学治疗之 后的又一肿瘤治疗新方法。生物治疗是通过调节机体防御机制,调动机体自 身的免疫反应而发挥抗肿瘤作用的一类疗法,包括细胞因子治疗、单克隆抗 体治疗、过继细胞免疫治疗、肿瘤疫苗以及细胞因子疗法等,已经成为肿瘤 治疗的重要辅助手段,成为继放疗、化疗和手术治疗后,目前有可能治愈肿 瘤的一种新型的治疗手段。 过继性细胞免疫治疗 ,是通过体外 大量扩增具有抗肿瘤活性的免疫杀伤细胞并回输给患者,通过直接杀伤肿瘤 细胞或激发机体自身的免疫细胞来杀伤肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的。过 继性细胞免疫治疗主要包括四种,分别是淋巴因子激活的杀伤细胞 ,、肿瘤浸润淋巴细胞 ,以及细胞因子诱导的 ,、树突状细胞 ,等。过继性细胞免疫治疗在国 杀伤细胞. 内外已有多年的研究基础,被认为是最有望彻底治愈肿瘤的方法。 ,是一群增 细胞因子诱导的杀伤细胞. 殖能力强、杀瘤活性高的免疫效应细胞。细胞最早是由美国斯坦福大学 的生物学家 于年首次报道的,他们的研究表明细胞 是一群同时表达和两种膜蛋白分子的异质细胞,为样细 胞,兼具有细胞抗瘤活性和细胞的非限制性杀瘤优剧?。 细胞可直接杀伤肿瘤细胞,可能与靶细胞表面分子和效应细胞表面相应受体 结合有关。细胞活化后可分泌多种细胞因子,如白介素, 、干扰素吖,丫、肿瘤坏死因子.仪 .仪,.等,通过对机体免疫系统的调节杀伤肿瘤细胞。 细胞免疫治疗是在无菌条件下采集患者外周血,提取单个核细胞, 体外加入细胞因子和单克隆抗体诱导培养,使其数量急剧增加,然后回输到 引言 体内,增强患者的免疫功能,提高生活质量,延长患者生存期【】。在诱导 培养过程中首先加入,可降低.的用量;促使外周血单个核细胞,膜型白介素 受体. ,数量的增加,从而有效激活效应细胞。可维持细胞 在体外培养过程中长期增殖,静息期的细胞表面一般不表达,但受 到丝裂原或其它刺激物活化的细胞能够表达.,在的诱导下增加 细胞上的表达。李晓英等报道了在不同类型肿瘤患者如肺癌、肝癌、 胃癌、乳腺癌等,自体细胞治疗对机体免疫状态及临床症状改善的影响, 结果表明细胞治疗后患者细胞数量明显下降,、、 细胞数量明显增加,使患者免疫功能得到改善【】。张俊萍等进一步研究表明 将有功能的树突状细胞与自体细胞混合培养,产生抗肿瘤效应更强的 .细胞,促进.、的分泌,提高细胞毒性、增强对肿瘤细胞 的杀伤功能【。 细胞可来源于骨髓、外周血、脐带血等,其中骨髓来源的取材 较难、体外增殖活性较外周血差【】;外周血来源的方便采集,已被 广泛应用于临床,但外周血回输后在体内活性低、存活时间短,治疗效 果不是十分理想。而且由于肿瘤患者免疫功能低下且免疫抑制细胞数量增 多, 故抽取自体外周血体外诱导培养时不易获得足够数量的杀伤能力较强的 免疫效应细胞。对于晚期癌症患者,因体质虚弱、免疫功能低下不能耐受反 复抽血,而输注异体易引起免疫排斥反应。与外周血相比,脐带血 来源的具有以下优点:脐血来源广泛,前体细胞含量高,较易扩增 出大量细胞;淋巴细胞绝对数量高,具有较强的增殖潜力;脐 血对肿瘤杀伤作用更强,且免疫原性低,移植后移植物抗宿主病 .. ,发生率低。牟青杰等报道了三种来源 细胞体外增殖及杀伤活性比较,证明了肿瘤患者、正常人及脐血来源的 体外均可得到大量扩增,但脐血扩增速度较其它两种来源扩增速度 快,且脐血对的杀伤功能更强【】。 近几年来对脐血的扩增速度、免疫表型、细胞毒性等方面的研究较 为深入,但对脐血的免疫原性即和的表达及激活型和抑制 性表面标志物表达报道较少。本实验中比较了脐血与肿瘤患者外周血来源的 引言 细胞免疫原性及表面标志物的表达差异,探讨脐血来源的细胞应用 于临床恶性肿瘤治疗的优越性。此外,联合放、化疗可以提高患者对放、 化疗的敏感性,抵抗放、化疗的免疫抑制作用。细胞免疫治疗须在放、 化疗前采血,放、化疗结束后回输,因为放、化疗对机体免疫功能损伤 较大,尤其是残余的化疗药物可能影响细胞的活性。故检测细胞耐 药基因的表达,并采用化疗药物处理两种来源的细胞,检测其抗凋亡能 力,寻找能更好与放、化疗结合治疗的细胞来源邛。 食管癌是常见的恶性肿瘤,其发病具有明显的地区差异性。全球%以 上食管癌发病和死亡发生在发展中国家,河南省属于食管癌高发区之一,每 年死于食管癌的人数仍在增加。目前对食管癌的治疗主要采用手术和放、化 疗,晚期食管癌患者通常不适合手术且对化疗药物不敏感,治疗效果不显著 【】。而早期食管癌患者,放、化疗对其生活质量影响较大,为提高食管癌患 者的生活质量及延长生存期,可采用细胞免疫治疗与放、化疗相结合, 提高对肿瘤的杀伤能力。本实验中选择一种食管癌细胞株,体外检 测两种来源的细胞对的杀伤能力,并建立的移植瘤模 型,通过体内试验检测的杀伤活性,为食管癌的治疗提供实验依据。 材料与方法 移液器 百得 微量振荡仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 公司 仪 微型光度计 美国、, 凝胶成像系统 .主要试剂 抗单克隆抗体 以色列 重组人白细胞介素 北京双鹭药业股份有限公司 上海凯茂生物医药有限炯 干扰素培养基 赛默飞世尔生物化学制品有限公司 胎牛血清 淋巴细胞分离液 上海华精生物高科技有限公司 反转录试剂盒 宝生物工程大连有限公司 西班牙琼脂糖 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 公司 美国公司 一?抗体 美国公司 .?抗体 美国公司 一抗体 抗体 美国公司 材料与方法 抗体 美国公司 抗体 美国公司 .抗体 美国公司 .抗体 美国公司 ..抗体 美国公司 抗体 美国公司 美国公司 ? ,抗体 美国公司 ,《:抗体 美国公司 ,抗体 ,抗体 美国公司,:抗体 美国公司 . 公司 . 佛波酯一 公司 离子霉素 公司 / 北京碧云天公司 一 试剂盒 公司 吖试剂盒 公司 .【试剂盒 公司 .主要试剂的配制 :购买的干粉溶解于去离子水中,常温下搅拌至完全溶解,. 过滤,分装保存于备用。 材料与方法 速,降速,转速/,时间,洗涤后,加入无血清 培养基重悬细胞,调整细胞密度至个/,避光加入羧基荧 , 光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 至终浓度为 /,。孵育后加入此胎牛血清,放置, 终止染色。取 个细胞转移到上样管中进行流式检测,连续检测。采 用软件分析脐血与外周血的增殖情况,以增殖指数 ,表示两种细胞的增殖能力。 .流式细胞术检测细胞的免疫原性、免疫表型及表面激活 型和抑制型标志物 取脐血与肿瘤患者外周血诱导培养后的细胞各,加入免 疫荧光标记抗体及相应的同型抗体,混匀后室温避光孵育 ,加入磷酸 盐缓冲液 ,,离心/,洗 、 、 、 涤后,流式细胞术检测免疫原性 、免疫表型、十、及表面激活 型标志物、和抑制型标志物一的表达。 . 检测细胞耐药基因的表达 ..总的提取 取培养的细胞个,离心洗涤后加入室温静置 .。 加入氯仿,上下颠倒混匀,室温静置,?条件下离心 。 /, 转移上层水相至另一干净的管中,加入肛异丙醇使沉淀 。析出。 室温孵育,条件下离心/,,可见管 的底部或侧壁有胶膜状颗粒。 材料与方法 去除上层清夜,加入 %乙醇,上下颠倒混匀,条件下离心 ,加入此 /,,去除上清,空气中干燥 无水溶解后检测的纯度与浓度。 ..反转录 基因组的去除反应: 此, 肚, “此, 肚加入到管中, ?。 反转录反应:另取一干净的管,加入 ,., , 此,的反应液此。放入仪上按以下步骤进行的 。 。 合成:? ,? .. .扩增目的基因 ’一 根据文献报道进行引物,上游引物: .;下游引物: 上游引物:’..下游引物: .:反应体系中加入上、下游引物各 此, .此,溶液此, .“。在荧光定量仪上按照以下步骤进行目的基因的扩增:预变性, ,反应?,?,个循环;添加溶解曲线? ,?,?。琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并拍照。 ./双染法检测细胞抗凋亡情况 取培养的细胞,铺到孔板中,每孔×个。采用不同浓度 的顺铂处理细胞,分为四组即对照组、.组、组、组。 处理、后,分别取出细胞悬液,加入预冷的,离心洗 和,?遮光孵 涤,加入 材料与方法 育,转移到上样管中,加入此流式检测细胞的凋亡。 . 检测细胞内因子分泌情况 取培养的细胞悬液,对各组细胞进行计数,调整细胞浓度为× 个/。 用无菌的管,取出悬液,离心:/,。 用离心洗涤,培养基含%胎牛血清重悬,分组 培养后,取上清,做。 具体流程如下:以为例简要说明 、使用的 包被酶标板,放置条件下过夜。 、取出包被好的酶标板,室温放置,洗板次,加入样品稀释液,室 温下封闭。 、洗板次,加入样品或品。标准品用倍比稀释融支标准品,加入 .皿 ,预先准备个管,加入此 ,然后依次稀释成浓度依次为/、/、/、 ./、./、./、./、,然后加入到相应 的孔内。加好后,室温孵育。、洗板次,加入 ,室温孵育。用 将 稀释成× 。 、洗板次,加入×辣根过氧化物酶,室温。用 将 稀释成×.。 、洗板次,最后一次尽量甩干,加入肛显色液,室温,避光 显色液: 液:混合。 ,阳性孔会变成黄色。 、加入终止液/ 、使用酶标仪在处读取样本的吸光值。 材料与方法 .体外检测细胞对靶细胞的杀伤功能 收集的细胞个/,离心洗涤/,,重悬 于培养基中。肿瘤细胞先用洗两遍,加入胰 酶消化,血清终止反应并将培养瓶壁上的细胞吹打下来,离心洗涤 /,重悬于培养基中,取出细胞× 个/,调整细胞与细胞的比例即效靶比为:铺于孔板 中,每孔,作为实验组。取部分细胞铺于孔板中,每孔, 作为阳性对照组,阳性对照组中同时加入/此、离子霉素 /此、阻断剂,。孵育。实验组中加入阻断剂 此孵育。收集细胞,离心洗涤,/,。避光加入 抗体、、,孵育后,用洗涤/,, 弃上清转移至上样管中,进行流式检测。 .体内裸鼠实验 × /裸鼠,经皮下接种肿瘤细胞 个/,建立荷瘤模 型,约左右成瘤,取移植瘤直径基本一致的裸鼠随机分为组,即对照组、 脐血组、外周血组,每组只。经尾静脉给予相应的注射治疗次, 细胞个/斗。裸鼠在接种肿瘤细胞前、成瘤后、治疗后进行拍照, 并对裸鼠肿瘤体积的大小进行测量,计算肿瘤体积:体积长×宽×高/ 。 .统计学处理 采用.统计软件进行数据分析。计量资料采用又士表示,样本符 合正态分布,均数方差齐,各样本测量值相互独立,采用成组,检验,若不 检验,检验水准萨.。 符合检验标准,采用.结果 .脐血与肿瘤患者外周血的体外增殖情况 脐血与外周血细胞培养至第时均开始增殖,第时增殖速度最 快。培养后开始检测细胞的增殖指数,值越高表明细胞增殖速 度越快。脐血和外周血在第时的值无显著性差异 .士..士.,.,而第时脐血的值显著 ,。 高于外周血.士..士.,.】图? 圈 囊瓣越 燃 一 撒? 豳撇 重是 ?“甜? 茎宝,? 雪。《 一 。 隔 .一 。 ‘ ? 童量 宅导 寸 ”四州。一 结果 ?、 × 艺 至 / 图脐血与外周血体外扩增情况:染色法检测第与第脐血与外周血 增殖情况; :使用软件分析脐血与外周血的增殖指数., 木木. ?: ;??: .脐血与外周血的免疫原性及免疫表型 人类白细胞抗原 ,等位基因的匹配程度 在异体移植中起重要作用,为检测脐血细胞的免疫原性,取培养至第 天的脐血与外周血细胞,流式检测、的表达情况, 其中是引起异体排斥反应的主要分子表。结果显示图脐血 细胞、的表达显著低于外周血【..% ..,..%.士.%,.】图,其中 、 及 的表达在脐血中较外周血中低, 两者比较有统计学差异【..%.士.%,..% ..%,..%..%,.图, 的表达在脐血与外周血中无显著差异.士.%.士.%, .图。脐血与外周血细胞中、效应细胞 比例无显著差异.;效应细胞在脐血中的含量显著 高于外周血中的含量【.:.%?..%,.】, 结果 一??????????????????????????????????????????????????一 细胞是细胞的主要效应细胞图、表。 表 细胞及和细胞表面的表达士,% 一????????????????????????????????????????????一 . .土.. .:. . .:. .:. .:. . .:. . .士. .士. . . .士 .:. . .土. .:. 结果? ; .?% .% ”』 一 ? 曩 量: 二一 ?一一?????一一一? :‘罐 囊 ,耄 .毒薮? 避 。遗:盛 .% 瀵 霪 。霪 麟 警 ? 蕊一 显 , .% 一 :蒜, 、毽 燃 鎏 ’厂?,可铲 . 图流式细胞术检 的表达:脐血与外周血细胞与的表达: 、细胞的表达:脐血 :外周血 :脐血与外周血 ? ? 一 苓 ? 耋 、细胞与表达的统计图木氏. 图脐血与外周血 .:;:结果 圣 .% ? 寸? 爹 ?窿 气 . , ‘, ? 飞 。.鎏 ? 懑。 护 ,? 轳 .%, 、 ‘,、 瓣 一 豢。 铲 图流式细胞术检测脐血与外周血的免疫表型:脐血 :外周血 表扩增后细胞的免疫表型,% .脐血与外周血表面激活型和抑制型表面标志物的表达 为检测不同来源的活性,取培养的脐血和外周血各例, 用流式细胞仪检测表面激活型标志物、以及抑制型标志物 .等的表达。结果图显示、及 活化效应细胞在脐血中的比例均显著高于外周血中的比例 结果 【.:.% .%,..%坩..%, ..%..%,.】;而抑制型.细胞在脐 血中的比例与外周血相比显著降低..%..%, .】表。但是,在脐血和外周血中,激活型 细胞的比例【.:.% ..%,.和抑制型. 细胞的比例【.士.%..%,.】没有显著差异。 表表面激活型和抑制型标志物的表达士,% .% .% .% % .% ?.“ 缀 量霪’ 懿 灌 盈 镳 、. 鎏 溪 卜.: ::.霉 爨 辫罐 灌鋈.% .% % .% ?. 蘧嬲 魁二。萋 露 鎏 ; :.霪 麟 震:溪 鳖整 蓬 滋瀵.。图流式细胞术检测脐血与外周血表面激活型标志物、 和抑制型标志 物的表达:脐血 :外周血 结果 .脐血与外周血耐药基因的表达及细胞凋亡 两种来源的培养至第,荧光定量检测耐药基因 的表达,以外周血为对照,其值为,脐血与外周血相比, 值为..。电泳结果进行分析灰度分析,表明在脐血 中高表达,而在外周血中低表达【...士.,.】图 。采用三种不同浓度的顺铂即.、、分别处理的脐血与 外周血,及未经顺铂处理的两种来源的细胞于、后检测细 胞的凋亡,发现顺铂浓度在.、 时对脐血与外周血凋亡 的影响没有差异,仅在顺铂浓度为时对早期凋亡的有影响,两者 差异显著【.:.%..%,.,对照组脐血与外周血 细胞的凋亡无显著差异图,? 图脐血与外周血细胞耐药基因的表达 :;:外周血 么尸何;:脐血 ;:外周血 ;:脐血 彳 结果 . 盯一 对照缀 。?% 啊鄹。 争‘嘲翳盼’‘。’熊 图流式检测对照组与顺铂处理组的脐血与外周血的凋亡情况:脐血 :外 周血 . 法检测脐血与外周血细胞内因子分泌水平 为检测两种来源的细胞内因子分泌水平,取脐血与外周血各 例,法检测、、.【的分泌水平。结果显示图,脐 血 、一的分泌水平显著高于外周血【.士./ ../,../../, .】,耵婚一的分泌水平两者之间无显著差异.士./ .. /,.】。 结果一、口 一?『坠 一 自占 ’ ? 置 图 法检测脐血与外周血细胞内因子的分泌水平木.,木. ?: ? ;?: .脐血与外周血的体外杀伤功能 脐血与外周血培养至,取个细胞,作为阳性对照 或与靶细胞共孵育后,流式检测 的表达图,, 结果表明,阳性对照组 的表达无显著差异,与靶细胞共孵育后 脐血 的表达显著高于外周血【..%..%, .。 结果 图流式检测脐血与外周血中细胞对的杀伤功能., 宰木尸..:脐血 :外周血 :: 零 嵋 卜 图脐血与外周血中细胞对的杀伤功能统计图 .体内裸鼠实验 为检测脐血与外周血体内抗肿瘤活性,建立食管癌的移植 瘤模型,约成瘤,瘤体积大小约为,分别经尾静脉输注生理盐水、 脐血与外周血,结果表明,对照组肿瘤体积一直增大,脐血组 肿瘤体积逐渐减小,两周后肿瘤消退, 而外周血组肿瘤体积先缩小,由 于肿瘤的复发,肿瘤体积在治疗后第 开始增大,两周时肿瘤体积达到 .图,图。 结果 : 豳囹 : 雹图 脐血与外周血体内杀伤的功能检测 图治疗第各组肿瘤体积的大小 :对照组:脐血组:外周血组 讨论 讨论 是继、、之后的又一高效的免疫效应细胞。过 继性免疫治疗用于恶性血液系统肿瘤和其它实体瘤,可促进机体免疫系统的 重建,防止肿瘤的复发和转移叭。研究表明,不同来源的在临床应用上 是安全有效的【?。目前,肿瘤患者外周血来源的已成功应用于临床,但 外周血还存在一定的局限性,而脐血由于来源方便,免疫原性低,并含 ,发 有大量造血干细胞,移植物抗宿主病. 生率低,成为的一个重要来源,越来越引起人们的关注【。 本实验比较了脐血和外周血来源的在增殖、免疫原性、表面标志物、 耐药基因、抗凋亡能力、细胞内因子及体内外杀伤功能的差异,结果表明脐 血第天增殖指数为.士.,外周血的增殖指数为 .士.,说明脐血扩增速度明显高于外周血。其可能原因是脐血 中前体细胞含量高,并含有一定比例的幼稚细胞,具有较强的增殖潜力 。脐血免疫原性较低,其、 的表达水平显著低于外 周血 的表达水平,表明脐血输注到患者体内后不易引起免疫 排斥反应,此外脐血诱导出的细胞是外周血的倍, 与文献报道有一定差别可能与添加的细胞因子的活性、产妇的胎龄等有关 【】。而抗肿瘤作用主要是通过、细胞实现的,故 脐血抗肿瘤效果更加明显。 近几年对脐血的扩增速度和免疫表型研究较为深入,但对脐血 的激活型和抑制型表面标志物的报道甚少【 ’。故本实验中主要分析了、 、.在脐血和肿瘤患者外周血的表达差异。是活化 的细胞表面标志物,表达于几乎所有的细胞和大多数细胞 上,其配体是表达于抗原提呈细胞上的分子,两者结合产生的协同刺激 信号在细胞活化中发挥重要作用,脐血中细胞比例高 于外周血中细胞的比例,初步说明脐血更能促进细 胞的增殖与分化,输注脐血到肿瘤患者体内后,可快速、大量增殖细 胞,进而杀伤肿瘤细胞。 分子是受体超家族成员,可稳定表达于细胞上,在细胞 讨论 激活、分化和细胞毒功能中发挥重要作用。与其配体结合 后调节细胞的活化,促进免疫球蛋白的合成。在脐血 和细胞中表达量分别为..%、.士.%,在外周血 中表达量分别为..%、..%,在脐血 和细胞中的高表达说明脐血中大多数细胞处于未激活状态, 可能与脐血未接触抗原刺激有关,这种处于未激活状态的细胞,能向记忆性 和分化。若将脐血输注到患者体内,遇到抗原刺激后进一步分化, 其治疗潜能更大。 .是一种负性协同刺激分子,属于/.超家族成员。它表 达于活化的细胞上,与其配体.和结合后,向胞内转导抑制信 号,抑制细胞的增殖及.和等细胞因子的产生【,。外周血 中.的比例高于脐血 .的比例..% ..%,初步说明铃周血易促进细胞的凋亡,而脐血 不易促进细胞的凋亡,而细胞是细胞毒细胞,可通过 细胞分泌穿孔素和颗粒酶杀伤肿瘤细胞。 耐药基因是一种半分子转运蛋白,它在肿瘤细胞中高表达,使 肿瘤细胞对放化疗产生耐药性,肿瘤细胞的多药耐药性是恶性肿瘤治疗的主 要障碍。目前,联合放、化疗可以提高患者对放、化疗的敏感性, 抵抗放化疗的免疫抑制作用,但需要在放、化疗前采血,放、化疗结束后回 输,化疗药物在体内的残余对细胞的活性可能存在一定的影响。本 实验结果表明,脐血表达耐药相关的基因,对放化疗可能会产 生耐受,并且经顺铂处理后的脐血抗凋亡能力增强.士.% ..%,.】,增加在体内的存活时间,提示脐血在与 放化疗联合治疗肿瘤患者时,效果可能比外周血更好。 细胞通过释放大量细胞胞内因子如:、、.等,能够 促进淋巴细胞的增殖、维持其活性、并能够通过多种途径杀伤肿瘤,增强机 体免疫功能【 。主要由单核细胞和淋巴细胞分泌,是一种多功能的糖 蛋白,对多种肿瘤具有良好的疗效,如慢性髓样白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、 肝癌、神经胶质瘤及妇科肿瘤等。。通过激活天然免疫系统发挥抗 肿瘤作用,可诱导巨噬细胞的活化,活化的巨噬细胞通过产生大量的 讨论 氧自由基和一氧化氮杀伤肿瘤细胞,还可通过上调家族的细胞毒性配体 的表达,如、、相关凋亡诱导配体等来杀伤肿瘤细 胞,此外可激活细胞、细胞及细胞毒性淋巴细胞 活化,它们通过释放颗粒酶、穿孔素等发挥细胞毒作用刀。成熟的脐血 细胞上清中分泌的显著高于外周血细胞分泌的水平 ../ ../,.,说明脐血 细胞较易激活机体的免疫细胞,发挥的抗肿瘤效应更强。由活化的、 细胞分泌,主要功能是刺激细胞生长和分化,并激活细胞和巨 噬细胞【】。脐血细胞分泌的水平显著高于外周血细胞分泌水 平,../ ../,.,初步表明脐 血抗肿瘤功能优于外周血。.【主要参与局部炎症反应和内皮细 胞活化,对靶细胞进行杀伤及促进肿瘤细胞的凋亡等【,.的分泌在脐 血与外周血细胞上清中无显著差异。 是一种溶酶体相关的膜蛋白,可作为淋巴细胞细胞与 细胞脱颗粒的表面标志物,与淋巴细胞的杀伤功能相关,细胞表面 表达水平越高表明其对肿瘤的杀伤功能越强【叭。本实验比较了脐血和外 周血分别与靶细胞共孵育后,细胞上的表达情况, 结果表明脐血细胞 表达水平显著高于外周血细胞 ..%凇..%,.,表明脐血细胞在体外试验中其 杀伤肿瘤细胞的能力优于外周血细胞。在体内试验中,脐血治疗组 裸鼠肿瘤体积缩小,也表明了脐血在食管癌的治疗中效果显著,有望应 用到临床食管癌患者的细胞免疫治疗。 总之,脐血免疫原性低、扩增能力强、活性高、具有较强的抗凋亡 能力及分泌细胞内因子能力,体内试验证实脐血输注杀瘤效果显著,表 明脐血有可能成为一种理想的细胞免疫治疗,然而其具体的分子机 制尚不清楚,还有待进一步的研究。 参考文献 参考文献】 , , . .,:。 : 【 , , 。 . , , : .【】 , , .?. : .,,:? 【】 李晓英,鲍杨漪,江蓓蕾,等.不同类型肿瘤患者自体细胞治疗对机体免 疫状 态及临床症状改善的影响.安徽医科大学学报,,:?. 张俊萍,毛光华,史天良,等.?联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌的临床疗 【】 效.中国肿瘤生物治疗杂志, ,:.. 【】 .. .:?. 牟青杰,王洁,崔为发,等.三种来源体外增殖及杀伤活性比较.山东医药, 【】 ,:. , , 【】 , .. ,,:. 【】 魏矿荣,练秋红,刘静,等.食管癌流行概况.中国内科杂志,,:?. ., , 【】 ,: ? . ,,: 参考文献 】 , , . 、 .,:?. .【】 ’ / , . . ,: 肖琼,张乐玲,沈柏均.脐血的研究进展.国际儿科学杂志, ,: 【】 .. .【】 , , ,: ., ,:. . , , , 】 : ., .:. . , 【】 , ? ? . , , . : , 】 , , . / . ., , :? . , ’ 【】 . / . ,,:?. . / , 【 参考文献 . , ,:.. , , , 【】. ../.,,:?. ? . , , , , 【】 : , , /:. .. , 一 】 , ,. ,,:?.. ? , , , 】 ? , :?. ., , .? 萄 【】 , : ? . , : ?. , , , . 【】 ? , ,:. 丫. . , , ,【】 . : , , :?. ’ ? , , . 】 ., ,:. .一, 【】 , 一丫 夕参考文献 ,,:. . ., , 【】 . ?,,:?. ., 【】 . ,,: .