空斑实验

问:我准备做病毒空斑实验,不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液,敬请各位指教 答:1、我是这么做的: 24孔板VERO,HSV1 1)24孔板预板 2)24h后,弃培养液,用hanks液洗1次 3)接种病毒液0.1ml/孔 4)放入37度5%CO2培养箱1h,期间每15min慢摇一次,使病毒充分吸附 5)加入1%甲基纤维素(1ml/)孔覆盖培养基,放入37度5%CO2培养箱继续培养 6)3天后,吸弃培养基 7)加入5%甲醛1ml/孔固定4min,弃甲醛,加入结晶紫0.8ml/孔染色20min 8)自来水缓缓冲洗染液,计算孔斑数 2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素,不过浓度是2%,配置方法是:甲基纤维素:3克溶于150ml 蒸馏水中,最终浓度为2%;染色用的碘液:25g溶于500ml95%的乙醇中。最终浓度为5%做出的效果很好。不过甲基纤维素要提前很长时间配置,大约2周,高压后放入冰箱,使用前无菌操作加入培养液,混匀放入冰箱,过一天后再拿出,使劲摇匀,使纤维素达到一种匀质的状态,静置至起泡完全消失后使用。染色可以用中性红0.1%(w/v)温箱孵育2-3小时,若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。 问:“1%甲基纤维素(1ml/)孔覆盖培养基,放入37度5%CO2培养箱继续培养”是指把1%甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里,还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中?配方比例是什么?甲基纤维素要提前很长时间配置,大约2周为什么?什么时候可以计数了?以什么为呢? 答:1、1%甲基纤维素(1ml/)孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。因甲基纤维素难溶,所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分,注意MEM 配的是10×的,这样要加的MEM 溶液体积就少的多。我按protol配好Viscous medium其最后总体积约400 ml,所以10×MEM只需40 ml。其他成分所加量按配400 ml 培养基换算就是了。所以甲基纤维素和培养基不是分开的,甲基纤维素只是这种培养基里的一种成分而已。 至于什么时候可以计数要看感染后CPE出现情况,这个要看具体测的病毒,刚开始每天坚持观察并计数就是了,直到没新的斑出现,大概都应在一周内吧。这个做一遍就可摸索出来。 2、我也用Viscous medium做病毒空斑实验,甲基纤维素覆盖培养液具体配方如下,供参考:In a glass bottle, combine 8.8 g methyl cellulose (4000 centipoise ,Sigma) with 320 ml distilled water. Stir with a large magnetic stirrer. Autoclave 30 min at 121 ℃, leaving the magnetic stirrer inside the bottle. Remove from autoclave while still hot and stir again until methyl cellulose has completely dissolved (usually a few hours).Add 40 ml 10×MEM or 10×DMEM, 40 ml FBS, 40,000 U penicillin, 40 mg streptomycin, and 4 ml of 1 M HEPES. Add L-glutamine and sodium bicarbonate according to the medium supplier's recommendations. Store up to 6 months at -20℃.配置此Viscous medium 确实挺麻烦,所用试剂多,甲基纤维素是难溶解,不过我按上述方法大概两三天内也溶好了。只要配好了甲基纤维素溶液,其他步骤都简单了。 问:还想请教,不管用什么培养基,怎么灭菌?用高压的话琼脂拿出来后很快就凝固了呀要是高温就加进去细胞会被烫死的,那个琼脂稍微加热溶解一下都很快凝固的,请指教。 答:可用低熔点琼脂糖呀,压完后放在42度保温培养基37度保温,用时混合半小时内不会凝的。我做的空斑实验就是用的低熔点琼脂糖,效果很好。当然也是文献推荐的因为我是做杆状病毒-昆虫达系统的,上层覆盖物只是防止病毒随液体扩散。 方法一 1、以5×10e5/ml的密度接种Hep-2细胞到6孔板中,每孔加入3ml细胞悬液; 2、待细胞长成单层后(不得超过48hr),移去营养液,每孔加入400ul的PBS和100ul毒液(10倍系列稀释); 3、37℃,5%CO2,吸附1-4h,每隔15-30分钟应摇晃板子1次以令病毒分布均匀,病毒在4h时达到最高吸附度; 4、弃去吸附液,每孔添加覆盖层3ml,少于3ml细胞不易存活。覆盖层以含5%小牛血清的2×DMEM 和0.6%的琼脂糖按1:1比例混合而成,这样小牛血清的终浓度为2.5%,琼脂糖为0.3%。琼脂糖必须高压灭菌,用前以微波炉充分融解,并放置65℃水浴保温待用。2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml 去离子水融解即可,其中还可加入双抗或二性霉素等,过滤除菌备用,用时37℃预热。二者应充分混合且温度不能过高(即无烫手感为止),否则会摧残细胞; 5、37℃孵育6-7天,到时每孔添加约2ml的1%福尔马林(以0.15M的NaCl配制),固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固定时间24h以上,无上限; 6、剔除覆盖层,用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂糖; 7、每孔添加2-3ml的0.05%中性红。贮存液为10×的,可保存数月之久,工作液以去离子水稀释即可; 8、室温染色1h-1d,吸掉染液,轻柔地清洗并打开盖子令其干燥后即可保存数年之久; 9、空斑计算方法同其它方法。 参考文献:Jennifer L.McKimm-Breschkin,A simplified plaque assey for respiratory syncytial virus-direct visualization of plaques without immunostaining,J.Viro Methd.120(2004):113-117 方法二 1、以5×10e5/ml密度接种Hela细胞于12孔板中,每孔1ml,使之24h内能长成单层; 2、以2%DMEM(维持液)10倍系列稀释好毒液; 3、吸去生长液,PBS洗涤细胞1-2次,每孔加入维持液500ul; 4、每孔加入稀释好的毒液50ul,充分混匀,每个稀释度做2个复孔,37℃,5%CO2吸附2h,每隔5分钟摇晃1次平板,以使之分布均匀; 5、微波炉充分融化无菌的3%琼脂糖,65度水浴保温备用,4%的2×DMEM预热至37℃;取1个小培养瓶,分别加入等体积的琼脂糖和DMEM,充分混合至温度适合时每孔加入混合液1ml; 6、室温或4℃放置板子致覆盖层完全凝固,然后将之反扣过来,置37度培养4-5天,每天观察细胞情况,注意保证培养箱内有保湿的蒸馏水,否则琼脂糖易干裂; 7、取出板子,每孔加入100ul的MTT,37℃孵育4h,则可见清晰的空斑形成,活细胞染成蓝色,选择空斑不融合且分散单个的空斑计数计算pfu值即可。MTT即塞唑兰,100mlDDW加入250mg配成0.25%浓度,-20℃冻存备用; 8、PFU计算方法同其它方法。 参考文献:见重庆医科大学儿童医院免疫室廉国利博士论文《脱氧核酶在小鼠体内抗呼吸道合胞病毒的效应》。 方法三 1、试验前一天用2×105HEP22细胞接种24孔板。37℃,5%CO2培育过夜。Hanks液冲洗细胞1~2次,用NaHCO3调Eagle MEM的pH值后稀释RSV(10倍稀释) ,然后加入24孔板中(设2个复孔),吸附1~ 2h,15~30min摇动一次以保证蚀斑分布均匀; 2、以2倍的Eagle内加青链霉素、卡那霉素、碳酸氢钠、琼脂糖配成琼脂覆盖层; 3、倒出病毒液,加入琼脂覆盖层0.5ml ,冷凝后,倒置于34℃,5d后,用福尔马林固定,0.15 %结晶紫染色,显微镜下数斑; 4、PFU=a1b/v( PFU指每ml病毒样品空斑形成单位,a指空斑均数,b指病毒稀释度的倒数,v指病毒量); 参考文献:邹毅,黄海鹭,徐军,钟南山.小鼠的原发性呼吸道合胞病毒感染.中华结核和呼吸杂志2001年8月第24卷第8期。 方法一 1、以5×10e5/ml的密度接种Hep-2细胞到6孔板中,每孔加入3ml细胞悬液; 2、待细胞长成单层后(不得超过48hr),移去营养液,每孔加入400ul的PBS和100ul毒液(10倍系列稀释); 3、37℃,5%CO2,吸附1-4h,每隔15-30分钟应摇晃板子1次以令病毒分布均匀,病毒在4h时达到最高吸附度; 4、弃去吸附液,每孔添加覆盖层3ml,少于3ml细胞不易存活。覆盖层以含5%小牛血清的2×DMEM 和0.6%的琼脂糖按1:1比例混合而成,这样小牛血清的终浓度为2.5%,琼脂糖为0.3%。琼脂糖必须高压灭菌,用前以微波炉充分融解,并放置65℃水浴保温待用。2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml 去离子水融解即可,其中还可加入双抗或二性霉素等,过滤除菌备用,用时37℃预热。二者应充分混合且温度不能过高(即无烫手感为止),否则会摧残细胞; 5、37℃孵育6-7天,到时每孔添加约2ml的1%福尔马林(以0.15M的NaCl配制),固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固定时间24h以上,无上限; 6、剔除覆盖层,用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂糖; 7、每孔添加2-3ml的0.05%中性红。贮存液为10×的,可保存数月之久,工作液以去离子水稀释即可; 8、室温染色1h-1d,吸掉染液,轻柔地清洗并打开盖子令其干燥后即可保存数年之久; 9、空斑计算方法同其它方法。 参考文献:Jennifer L.McKimm-Breschkin,A simplified plaque assey for respiratory syncytial virus-direct visualization of plaques without immunostaining,J.Viro Methd.120(2004):113-117 方法二 1、以5×10e5/ml密度接种Hela细胞于12孔板中,每孔1ml,使之24h内能长成单层; 2、以2%DMEM(维持液)10倍系列稀释好毒液; 3、吸去生长液,PBS洗涤细胞1-2次,每孔加入维持液500ul; 4、每孔加入稀释好的毒液50ul,充分混匀,每个稀释度做2个复孔,37℃,5%CO2吸附2h,每隔5分钟摇晃1次平板,以使之分布均匀; 5、微波炉充分融化无菌的3%琼脂糖,65度水浴保温备用,4%的2×DMEM预热至37℃;取1个小培养瓶,分别加入等体积的琼脂糖和DMEM,充分混合至温度适合时每孔加入混合液1ml; 6、室温或4℃放置板子致覆盖层完全凝固,然后将之反扣过来,置37度培养4-5天,每天观察细胞情况,注意保证培养箱内有保湿的蒸馏水,否则琼脂糖易干裂; 7、取出板子,每孔加入100ul的MTT,37℃孵育4h,则可见清晰的空斑形成,活细胞染成蓝色,选择空斑不融合且分散单个的空斑计数计算pfu值即可。MTT即塞唑兰,100mlDDW加入250mg配成0.25%浓度,-20℃冻存备用; 8、PFU计算方法同其它方法。 参考文献:见重庆医科大学儿童医院免疫室廉国利博士论文《脱氧核酶在小鼠体内抗呼吸道合胞病毒的效 应》。 方法三 1、试验前一天用2×105HEP22细胞接种24孔板。37℃,5%CO2培育过夜。Hanks液冲洗细胞1~2次,用NaHCO3调Eagle MEM的pH值后稀释RSV(10倍稀释) ,然后加入24孔板中(设2个复孔),吸附1~ 2h,15~30min摇动一次以保证蚀斑分布均匀; 2、以2倍的Eagle内加青链霉素、卡那霉素、碳酸氢钠、琼脂糖配成琼脂覆盖层; 3、倒出病毒液,加入琼脂覆盖层0.5ml ,冷凝后,倒置于34℃,5d后,用福尔马林固定,0.15 %结晶紫染色,显微镜下数斑; 4、PFU=a1b/v( PFU指每ml病毒样品空斑形成单位,a指空斑均数,b指病毒稀释度的倒数,v指病毒量); 参考文献:邹毅,黄海鹭,徐军,钟南山.小鼠的原发性呼吸道合胞病毒感染.中华结核和呼吸杂志2001年8月第24卷第8期。