硫酸铵分级纯化蛋白质原理操作

硫酸铵分级纯化蛋白质原理操作 硫酸铵分级沉淀蛋白质原理与操作 一,基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二,试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫酸铵(NH 4 )SO 4 3. 饱和硫酸铵溶液(SAS ) 4. 蒸馏水 5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三,操作 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。 (一)配制饱和硫酸铵溶液(SAS ) 1.将767g (NH 4 )2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液(4.1 mol/L, 25 °C ). 2.其它不同饱和度铵溶液的配制 (二)沉淀 1.样品(如腹水)20 000 ′g 离心30 min ,除去细胞碎片; 2.保留上清液并测量体积; 3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中,终浓度为1 :1 ( 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜(4 °C ),使蛋白质充分沉淀。 (三)透析 1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min (4 °C )。弃上清保留沉淀; 2.将沉淀溶于少量(10-20ml )PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时(4 °C ),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨; 3.透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。 四,应用提示 (一)先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1.边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v) ; 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或过夜(4 °C ); 3.3000 ′ g 离心30 min ( 4 ° C ),保留上清液;上清液再加SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 4.上清液再加SAS 到0.5:1 (v/v) ,再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨; 5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效 (二)为避免体积过大,可用固体 硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1 );硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。