Bmp4_Smad信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作用及其机制研究（可编辑）

Bmp4_Smad信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作用及其机制研究（可编辑） Bmp4_Smad信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作 用及其机制研究 单位代码: 分类号:. 学 号: 级: 密 蔡办孽 硕士学位论文 论文目:/信号通路在小鼠精原干细胞 分化过程中的作用及其机制研究 /李毅 作者姓名 专业 人体解剖与组织胚胎学 指导教师 专业技术职务 郝晶教授 年月日原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下, 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本 论文不包含任何其他个人或集体己经发或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名:缎导师签名:菇爷‰日期:彻?.汤目录 中文摘要 英文摘要 符号说明前 言 材料 结 果?”??“讨仑 结仑图 表 参考文献 致 谢 发表论文。 山东大学硕士学位论文 如/信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作用 及其机制研究 硕士研究生:李毅 导 师:郝 晶 专 业:人体解剖与组织胚胎学 中文摘要 目的及意义精原干细胞 ,是位于睾丸曲细精 管基膜上既能自我更新维持自身群体恒定,又能定向分化,最终产生精子的 一类 成体干细胞。近年来,由于在精子发生机理研究、男性不育治疗、遗传性 疾病治疗、转基因动物建立及多潜能干细胞制备等方面的重要价值,探讨 增殖分化的分子调控机制,成为生殖生物学和干细胞生物学研究的热点。 骨形态发生蛋白 一,是转化生长因 ,?家族中重要的一员,在胚胎发 子 育时期,对多种细胞的增殖分化具有调控作用。基因敲除会引起胚胎中胚 层发育缺陷而导致小鼠胚胎性死亡。信号转导通路通常由细胞内信号转导? 结合,再与 蛋白介导。通过丝氨酸/苏氨酸激酶受体 受体结合形成复合物。复合物形成激活了型受体的蛋白激酶,从而导致细胞 内受体蛋白如,,的磷酸化,激活的与 共用型.结合形成蛋白复合物,该复合物进入细胞核内与特 异的转录启动子或阻遏蛋白再次结合形成复合物,最终与结合,进行特异 的转录调控。研究表明,/信号通路参与胚胎干细胞、神经干细胞等干 细胞的增殖分化调控。但目前尚未有人研究/信号通路在精原干细胞分 化过程的作用及其作用机制。 本研究利用体外培养的小鼠精原干细胞,通过免疫荧光染色、实时定量 及干扰等方法,检测了外源性对分化的影响,以及在此过程中 分化关键基因和表达变化,从而探讨了/信号通路 山东大学硕士学位论文 在精原干细胞分化中的作用及其可能的作用机制,为将来男性不育症治疗提 供了 新的理论和实验依据。 研究方法 .培养鉴定取原代培养的在饲养层上培养小时后,通过 免疫荧光染色,检测鉴定标志物,在中的表达。 .体外处理将细胞分为三组,分别为:正常对照组组,添加 / 组组,添加/ 和 /抑制剂组 抑制剂组。培养小时后,通过免疫荧光,检测、、 和在三组细胞中的表达及其变化规律。培养小时后,通过实时定量, 检测、、和基因在三组细胞中的水平及其变化规律。 . 干扰将细胞分为四组,分别为:非特异性组,非特 组及 异性组, 组。细胞转染 后培养小时,通过实时定量,检测、?、和基因在 四组细胞中的水平及其变化规律。 结果 形态学观察结果显示,倒置显微镜下可见由十几个细胞聚集成的克隆团, 细胞为圆形,细胞大小比较均匀,核大胞体小,核/质比高。免疫荧光染色检测 结果显示,和在中特异表达。 .免疫荧光染色结果显示,、及的阳性表达主要分布于 克隆团块的周边,的阳性表达主要分布于克隆团块的中心。 组和的阳性细胞数和表达量均明显高于组和抑制 剂组,组和抑制剂组之间无显著性差异;组的核内表 达明显高于其他两组;组和抑制剂组的表达明显高于 组。实时定量结果显示,与组相比较,组和 水平 明显降低,而及? 水平明显增加,差异有显著意义.; 抑制剂组中各基因表达与组无显著差异。 .细胞转染 后,实时定量结果显示,与非特异性 组相比较, 组 水平明显减少, 和 水平明显增加,差异有显著差异.。与非特异性山东大学硕士学位论文 水平明显增加, 组相比较,非特异性组和? 和 水平明显减少,差异有显著意义.。 结论 .可促进小鼠的分化; .可通过激活信号通路,上调靶基因的表达,从而促进 ?的表达,发挥其促进小鼠分化的作用。 关键词精原干细胞,,,,分化 山东大学硕士学位论文 /: :.:. ? , ,. , , ,, , ? , .??., . ./ ., . ,. . , 山东大学硕士学位论文?? / .,, /., ? , ,, , ./ , . . , , . , : . / ,// , ,.,, ,?, . ? ..:? ,?. , , ,?, ? . 山东大学硕士学位论文. , , , , , / ,., . . . , , , .? , . .. . , ?, , , ? .. . ?. ,?? , . , .: . ? , ?,, .. 山东大学硕士学位论文 . . . ? , .,,,,.山东大学硕士学位论文 符号说明按英文字母先后排序 英文全称 中文全称 英文简称 碱基对 牛血清白蛋白 骨形态发生蛋白 ,氨基一一苯基眄 .一一一 哚 无钙镁缓冲液 脱氧核糖核酸’ ’ //培养基 / ’培养基 ’ 二甲基亚砜 双蒸水二氨基联苯胺 表皮生长因子 胺四乙酸 胎牛血清异 硫氰酸荧光素 ? 胶质源性神经营养因子 ? 辣根过氧化物酶 一一一 一羟乙基哌嗪乙磺酸 小干扰 州 毫升 信使 小鼠胚胎成纤维细胞 吸光度值 山东大学硕士学位论文 ? 八聚体结合转录因子 磷酸盐缓冲液 多聚甲醛 干扰 每分钟转速逆转录聚合酶链式反应 精原干细胞 小干扰微克 微升 山东大学硕士学位论文 /信号通路在小鼠精原干细胞分化过程中的作用 及其机制研究 前言 世界卫生组织调查数据显示,全世界约有%一%不孕不育症患病率,其中 因为男性因素不育的约占/。近年来,不孕不育症发生率呈现明显上升趋势, 不孕不育症的基础研究和临床诊治成为人们关注的焦点。由于精原干细胞 ,在精子发生机理研究、男性不育治疗、遗传 性疾病治疗、转基因动物建立及多潜能干细胞制备等方面的重要价值,探讨 增殖分化的分子调控机制,成为生殖生物学和干细胞生物研究的热点。 是位于睾丸生精小管基膜上的单个存在的型精原细胞 ,, 是机体中唯一的一种将遗传信息传递给下一代的成体干细胞 ,。具有干细胞的两大特性,一方面可以自我增殖维持自身数目 的相对恒定,另一方面可以经过数次有丝分裂后进入减数分裂,形成精母细 胞,最 终形成精子。精原干细胞的维持依赖于干细胞自身基因调控及由支持细胞、 基膜、 血管构成的微环境。 等报道,精原干细胞是否分化为精子细胞与睾丸 局部的生长因子密切相关。 骨形态发生蛋白 ,是一类广泛存在人 体骨骼、牙齿中能异位诱导成骨的酸性蛋白。至今,已发现家族成员至少有 个。除属虾红素家族瞳外,其他都属于转化生长因子一 ,家族成员。主要作用于未分化间充质细胞,影 响其增殖和分化。在调节组织器官的生长发育及抑制肿瘤的发生过程中有重 要的作用 基因缺失可引起动物胚胎中胚层发育缺陷而导致动物胚胎性 死亡。在生殖细胞发育过程中发挥重要的作用,基因敲除可导致原始生 殖细胞缺失阳。在生殖细胞发育过程中,生殖细胞从其微环境中感应适当信 号, 启动卵子或精子发生分化程序,最终形成配子,此阶段最重要的诱导信号之 一是 盯。。等人发现/品系的杂合子雄性小鼠为不育,主要表现为生 殖细胞退化,精子数量减少和运动能力降低,说明对小鼠精子发生和功能维 持具有重要作用阳。在小鼠睾丸中,由生精小管中的细胞产生。 山东大学硕士学位论文 结合后,再与 ?受体结合形成复合 与丝氨酸/苏氨酸激酶受体 物,其机制是典型的细胞表面接受配体信号后,在胞浆内进一步处理,随后信 号 进入细胞核的过程。参与胚胎干细胞、神经干细胞等干细胞增殖分化的调控, 其作用是通过信号通路介导的。 、? 、 蛋白家族是细胞内的信号转导蛋白,直接参与包括? 及活化素等超家族成员的信号转导。。是和 蛋白及其类似物的统称,且族蛋白口’迄今为止,在哺乳动物 已经分离鉴定出的蛋白有种引,一般用表示。蛋白根据结构和 功能分为种亚型,即特异型、、、和、公共调节型、 抑制型,。蛋白是细胞内信号转导和调节分子,可以直 接将细胞外信号从细胞膜转导入细胞核,构成/信号转导通路,而 /信号通路在许多干细胞的增殖与分化中发挥着重要作用。在各级生 精细胞中均有表达,基因缺失,可影响生精细胞的增殖分化。 是 转录因子超家族的成员,是小鼠生 殖细胞特异表达的基因 。在雄性小鼠,仅在精原细胞中表达, 基因敲除可导致型精原细胞向型精原细胞分化障碍,证实是精原细 胞分化的关键调控因子。研究发现,在小鼠胚胎干细胞体外培养中,加入外源 性 后可促进的表达,并伴有其他生殖细胞标志性基因的表达,如 ,等。分泌产生的细胞因子是否通过调控精原细胞 表达,从而参与精原细胞分化调控,是本研究的重点。己证实,在调控 精原细胞分化过程中,直接作用的靶基因是?。是由原癌基因编码的跨膜酪氨 酸激酶受体,其配体是干细胞因子 ,,由基因编码,和它的配体在生精细胞的发育和分化 过程中起着重要作用’ 。在缺乏存在的情况下,精原干细胞无法分化。 研究表明,未分化的精原细胞不表达,而分化中的精原细胞有表达。 体外实验证实,上调基因的表达来调控精原细胞的分化?引。 已有研究表明在睾丸支持细胞中有表达,而在精原细胞中有表达, 但目前尚未有人研究/信号通路在小鼠精原干细胞分化过程的作用及山东大 学硕士学位论文 其作用机制。本研究以昆明小鼠为研究对象,对小鼠精原干细胞进行体外培 养, 通过免疫荧光染色及实时定量检测精原干细胞标志性基因的表达及其变化 规律,从而深入探讨/信号通路在小鼠精原干细胞分化过程的作用,并 通过转染小干扰、实时定量检测精原干细胞中基因的表达及其变化规律, 进而探讨/信号通路在小鼠精原干细胞分化中的作用机制,为男性不育 治疗提供有力的实验与理论依据。山东大学硕士学位论文 材科与方法 一实验材料 一实验动物 .小鼠品系 本试验应用了小鼠,购于山东大学实验动物中心。小鼠饲养条件为每天 小时光照,小时黑暗,任意取水和饮食。 .胎鼠和乳鼠获得 成年小鼠按:或:合笼,第二天早晨检查阴栓,见栓日期记为怀孕 天。在小鼠怀孕天后,取胎鼠做饲养层。在小鼠怀孕天后,每 天观察产仔情况,出生日记为天。本试验应用的是出生后天的雄性乳鼠。 .研究对象 小鼠精原干细胞为原代培养。 二药品及试剂 .培养基,高糖培养基,胎牛血清,一谷氨酰胺,青霉素一链霉素 双抗,.%胰蛋白酶,.%胰蛋白酶,和非必需氨基酸均 购自公司。 .转铁蛋白,胶原酶?,胰岛素,丙酮酸,腐胺,,一,二甲基亚 砜,丝裂霉素,抑制剂,一巯基乙醇,抑制剂一 一一一一一,一 和明胶均购自公司。 .重组人,小鼠均购自 。 .购于公司。 .鼠抗鼠单克隆抗体购自公司;羊抗鼠?、兔抗鼠 //多克隆抗体均购自武汉博士德公司生物科技技术有限公司;兔抗 鼠多克隆抗体购自公司。 .羊抗鼠荧光二抗,兔抗羊荧光二抗,羊抗兔荧光二抗,, 一抗稀释液,缓冲液,羊封闭血清和兔封闭血清均购自中杉金桥生物技 术有限公司。 .提取试剂盒购自公司。 】山东大学硕士学位论文 .?试剂盒购自大连宝生物科技技术有限公司。 . 购自公司。 . 抗荧光淬灭封片液购自江苏碧云天生物技术研究所。 .伯 及小干扰购自公司。 . 其他:酒精,多聚甲醛,甲醇等为国产纯试剂。 三试剂配制 .溶液配制 %配制 溶于中,加热搅拌并加少许/的至溶液清亮, 定容至,?保存备用。 /胶原酶?储存液 将胶原酶?粉末溶于 中,过滤除菌,避光,一保存备用。 储存液 / 中,分装,一。保存备用。 在超净工作台上,取溶于 ×丝裂霉素储存液 在超净工作台上,在盛有丝裂霉素的棕色瓶内加入 培养基, 配制成/储存液, 分装,一?保存备用。 .%明胶溶液 称取.明胶,加入到约三蒸水中,边加热边搅拌,待溶解后,三 蒸水定容至,高压灭菌,保存备用。 /转铁蛋白储存液 ,过滤除菌, 在超净工作台上,往盛有的棕色管中注入 ?保存备用。 /腐胺储存液 ,过滤除菌,分装,一保存备用。 称取腐胺溶于 /重组人储存液 在超净工作台上,溶于含.%的,分装,一?保存备用。 /重组小鼠储存液 在超净工作台上,溶于含.%的,分装,一?保存备用。 山东大学硕士学位论文 小鼠睾丸组织消化液和中和液 消化液:.无血清高糖中,加入胶原酶?和.双抗, 配好后,。保存备用。 中和液:.无血清/中,加入.和.双抗, 配好后,?保存备用。 冻存液 无血清高糖中,加入%和%,现配现用。/储存液 超净工作台中,溶于的无血清高糖中,分装,。保存备用。 /抑制剂储存液 将抑制剂溶于中,配制成/的储存液,。保存备 用。 / 储存液 将.粉末溶于中,待溶解后用调至., 滤过除菌后,?保存备用。 .培养液配制 精原干细胞培养基 ? . % %谷氨酰胺. .非必须氨基酸. 双抗. 一巯基乙醇. . 丙酮酸钠 /转铁蛋白/胰岛素 /腐胺/“ /山东大学硕士学位论文 配好后,?保存。 培养基 高糖 % %双抗 配好后,?保存。 四仪器设备 .超净工作台 苏净集团安泰公司 .孵箱 .倒置相差显微镜 .荧光显微镜和显微照相系统 .分光光度计 ? .凝胶成像及分析系统 .扩增仪 ? .水平电泳仪 ? .垂直电泳仪 山东新华 .立式灭菌器 .紫外透射反射分析仪 上海康华 .离心机 .微量加样器 .滤器 .培养瓶及培养板. .液氮罐 广东东亚 .电热恒温水浴箱 上海精宏 青岛海尔 .一?低温冰箱.。低温冰箱 .荧光定量基因扩增仪 ? .扫胶仪 山东大学硕士学位论文 .烤箱 上海精宏 .纯水系统 五引物 引物 序列 退火温度度 扩增长度 从 . . ?从’。‘’’‘从从 六小干扰序列 从 从二实验方法 一细胞培养鉴定 .细胞培养条件 所有细胞都在?、%。条件下培养。 .培养瓶、培养板及六孔板准备 山东大学硕士学位论文 瓶内、板内及各空加.%明胶覆盖,置于孵育小时后吸出液体,于超 净台中吹风干燥备用。 .的分离、培养、冻存 脱臼处死孕天的孕鼠只,%酒精消毒孕鼠,破腹取出子宫置于 浸洗遍,洗去血渍; 用弯剪撕破子宫壁,取出胎鼠,用洗涤胎鼠遍: 取一只胎鼠,夹掉头、尾、四肢及内脏,将其余胚胎转移到一个装有 新鲜的离心管中,用冲洗,然后倒掉,重复此步骤一次。然后将 胚胎转移到另一装有的平皿中,用眼科剪将其切碎; 将平皿中的转移到离心管中,离心分钟,弃上清, 加入胰酶,重悬沉淀,水浴消化分钟,每隔分钟轻轻晃动一次; 培养基的离心管 收集已消化的上层细胞悬液,将其倒入一装有 中,目尼龙网过滤后,离心分钟收集细胞,培养基洗涤次, 然后离心; 细胞沉淀用培养基悬起,细胞计数; 培养基中,接种到×培养板中,小 ×细胞悬浮于 时后更换新鲜培养基; 待细胞长满后先用冲洗遍,然后加胰酶消化时间小于分钟, 按:传代; 细胞再次生长到覆盖率%%左右,经常规消化和离心后,用冻存 液重悬细胞,每只冻存管中加入细胞悬液; 将盛有细胞悬液的冻存管放入棉垫中,密封后置于一冰箱预冷, 小时后迅速投入液氮中长期保存。 .饲养层制备 取出含有小鼠细胞的冻存管,置于水浴中快速解冻时间小于 分钟 用吸管吸出冻存管中细胞悬液,转移到盛有培养基的 离心管中,离心分钟收集细胞,弃上清,再以培养基重悬细胞 并接种培养,?天,细胞长满;山东大学硕士学位论文 /丝裂霉素的 待培养瓶中细胞达到%汇合度,换成含 培养基,处理?.小时; 弃掉含丝裂霉素的培养基,用洗涤细胞次,然后常规消化,离 心和重悬细胞; 冲洗预先用.%明胶包被的培养板或培养瓶,然后将细胞以×/ 的密度接种,置于孵箱内培养备用。 .睾丸细胞收集 取天的雄性乳鼠将其脱臼处死,然后用%的酒精洗涤; 在超净工作台上,手术取出乳鼠睾丸,放入培养皿中;在培养皿中加入 %双抗清洗睾丸 去掉睾丸白膜,将剩余的睾丸组织转移到含消化液培养基% 胶原酶%双抗的离心管中,置于。孵箱中消化分钟,每隔分钟混悬 一次,混悬后静置一分钟; 快速离,山,/秒,弃上清液,加入.%.% 消化分钟; 加入与消化液等量的培养基/%%双抗,用枪头反复 吹打次分散细胞,然后离心,/分钟,弃上清液; 重复步骤; 将已挂好.%明胶的六孔板用冲洗现用现冲,加入的培养 基,然后用少量培养基将细胞悬起,移至六孔板中,在、%条件 下培养; 第二天观察细胞的情况; 将收集当天记为天,分别于、、天换孔,加培养液吹打注:若细 胞过多可根据培养基颜色适量换液。 .精原干细胞鉴定 孔板准备:将无菌×盖玻片置入孔板,每孔加.%明胶覆 盖,将板置于。孵育小时后吸净液体,于超净台中吹风干燥备用。 细胞准备:将被覆明胶的孔板用冲洗一遍;将细胞按每孔 ×/的密度传代至孔板中,待细胞过夜贴壁后,吸弃培养基,加入山东大学硕 士学位论文 培养基,然后将种植于饲养层上,培养小时后,加条件继续 培养小时。 细胞固定:取出培养小时的孔板,吸弃培养基,用预冷的小心 冲洗净残留培养基,共三遍。每孔加%常温固定分钟。 封闭:弃,冲洗分钟,共三遍。用含.%的破膜 分钟,弃液体,每孔滴加山羊血清封闭液常温封闭小时。 一抗结合:小心弃去封闭液,滴加一抗浓度为:,湿盒 孵育过夜。 二抗结合:弃一抗,冲洗分钟,共三遍,滴加标记羊抗小鼠 的二抗浓度为:,。湿盒内避光孵育小时。 复染:弃二抗,冲洗分钟,共三遍,滴加避光孵育? 分钟。 成像:弃,冲洗分钟,共三遍,抗淬灭荧光封片剂封片,荧光 显微镜下观察并记录。 实验重复三次。 二/信号通路对精原干细胞分化的作用 .细胞分组 将培养的分组如下: 正常对照组组:全程常规。,%,饱和湿度及常规培 养基培养。 添加组组:。,%:,饱和湿度及含/的 的培养基培养。 添加和抑制剂组抑制剂组:。,%:。饱和 湿度及含/的和 /的抑制剂的培养基培养。 .免疫荧光化学染色 孔板准备:将无菌 姗盖玻片置入孔板,每孑/ .%明胶覆 盖,将板置于孵育小时后吸净液体,于超净台中吹风干燥备用。 细胞准备:将被覆明胶的孔板用冲洗一遍;将细胞按每孔 ×/的密度传代至孔板中,待细胞过夜贴壁后,吸弃培养基,加入 山东大学硕士学位论文 培养基,然后将种植于饲养层上,培养小时后,加条件继续 培养小时。 细胞固定:取出分组培养小时的孔板,吸弃培养基,用预冷的 小心冲洗净残留培养基,共三遍。每孔加%常温固定分钟。 封闭:弃,冲洗分钟,共三遍。用含.%的破膜 分钟,弃液体,每孔滴加山羊血清封闭液一抗为、及// 及兔血清封闭液一抗为?,常温封闭小时。 一抗结合:小心弃去封闭液,分别滴加、、、// 一抗浓度为:,湿盒孵育过夜。 二抗结合:弃一抗,冲洗分钟,共三遍,分别滴加标记羊抗 鼠、兔抗羊、羊抗鼠、羊抗鼠的二抗浓度为:,。湿盒内避光孵育 小时。 复染:弃二抗,冲洗分钟,共三遍,滴加避光孵育? 分钟。 成像:弃,冲洗分钟,共三遍,抗淬灭荧光封片剂封片,荧光 显微镜下观察并记录。 每细胞爬片观察至少个细胞团,分别计算每组、及 的表达及的入核率,并进行免疫荧光强度的半定量分析,实验重复三次。 .实时定量检测基因水平的变化情况 细胞准备:将被覆明胶的六孔板用冲洗一遍,将细胞按每孔 ×/的密度传代至六孔板中,待细胞过夜贴壁后,吸弃培养基, 培养基,然后将种植于饲养层上,培养小时后,加条件继续 培养小时。 细胞总提取根据试剂盒说明进行: 吸弃培养基,用预冷的将轻轻吹下,离心分钟, 弃液,用预冷的悬起,将悬浊液转移至处理过的.的管 中,留 冰浴待用,其余做好标记快速冻存至一。冰箱。 吸取 裂解液加入到管中裂解细胞,在室温的 条件下,静置孵育分钟。山东大学硕士学位论文 每 裂解液中加入.氯仿,把管的盖子盖 牢固,用力震荡秒,然后放在冰上静置孵育分钟。 在的环境下,离心分钟。离心后,混合物将分成三层:下 层的是苯酚氯仿相,中间层,还有上层的水相。几乎全部在上层的水相中。 此时应轻拿轻放,避免将中层和下层的物质震荡起来。 将不多于%的上层水相吸出来注意不能将中间层和下层的物质吸出 来,将它转移到另一个干净的管中,再加入三分之一体积的室温无水乙醇,用 最大速度震荡秒。 在第步中得到的水相混合物,从中吸取不大于来,加入 吸附柱中, 多余的水相混合液部分可以在做完这一步 的吸附后继续加入;如果有沉淀,可能是第步中加入的乙醇所形成的,要震 荡。 收集管 把混合液全部加入吸附柱当中,并把吸附柱套在 中,在室温下以离心秒,倒掉收集管中的废液,把吸附柱重新套在 收集管上。 重复第六步,直到把剩余的水相混合物全部加入到吸附柱中为止。和第 步一样离心,离心后倒掉收集管中的废液。 的 把吸附柱套到一个新的收集管中,在吸附柱内加入 洗脱缓冲液,然后和第步一样的条件,室温以离心? 秒,倒掉收集管中的废液,把吸附柱套在收集管上。 的洗脱缓冲液, 将吸附柱套回收集管上以后,再向吸附柱内加入 室温条件下离心秒,倒掉收集管中的废液。 把吸附柱重新套回收集管上,加入 的 洗脱缓冲液该液在提供时是浓缩的,用无水乙醇进行了稀释,室温条件 下离心秒,倒掉收集管中的废液,把吸附管套回到收集管上。 重复一遍步的操作,加入 洗脱缓冲液,离心后弃掉废液, 然后再把吸附柱套到空的收集管上,以离心机的最大速度离心分钟,以彻底 清 除膜上残留的废液。 洗脱。弃掉离心管,把吸附柱套到一个干净的.管上,用 ? 的水试剂盒提供来洗脱,要确保水加到了吸附柱的膜表山东大学硕士学位论 文 ? 分钟’ ? 分钟孓 。 分钟 三/信号通路对精原干细胞分化作用的机制山东大学硕士学位论文 实时定量检测细胞转染后基因水平的变化情况 .细胞转染鉴定 三组小干扰,分别记为,,,细胞转染后,实时定量 检测 水平的高低,从中筛选出有效的。 .细胞转染 用.%胰蛋白酶消化并计数,使其在转染日密度大于%,将被 覆明胶的六孔板用冲洗一遍,细胞铺板在.无血清,无抗生素的正 常生长的培养基中。 的 对于六孔板的每孔细胞使用 无血清的?培养基稀释 。 无血清的?培养基稀释 对于六孔板的每孔细胞使用 试剂,试剂稀释后,尽快与同稀释的 混合。 混合物在室温下静置分钟,然后将其加入到每孔中,边加边摇动培养 板,轻轻混匀。 在、%的:培养箱中孵育小时,无须去掉混合物或更换培养基, 在细胞中加入混合物小时后,继续分组培养小时,收集细胞,提取。 .细胞转染小时后,分组培养如下: 非特异性组:细胞转染非特异性后,加入常规 培养基,继续培养小时; 非特异性组:细胞转染非特异性后,加入含/ 的培养基,继续培养小时; 组:细胞转染 后,加入常规培 养基,继续培养小时; 后,加入含/ 组:细胞转染 的培养基,继续培养小时。 .细胞总提取根据试剂盒说明进行: 吸弃培养基,用预冷的将轻轻吹下,离心分 钟,弃液,用预冷的?悬起,将悬浊液转移至处理过的.的 山东大学硕士学位论文 管中,留 冰浴待用,其余做好标记快速冻存至一。冰箱。 吸取 裂解液加入到管中裂解细胞,在室温的 条件下,静置孵育?分钟。 每 裂解液中加入.氯仿,把管的盖子盖 牢固,用力震荡秒,然后放在冰上静置孵育分钟。 在的环境下,离心分钟。离心后,混合物将分成三层:下 层的是苯酚氯仿相,中间层,还有上层的水相。几乎全部在上层的水相中。 此时应轻拿轻放,避免将中层和下层的物质震荡起来。 将不多于%的上层水相吸出来注意不能将中间层和下层的物质吸出 来,将它转移到另一个干净的管中,再加入三分之一体积的室温无水乙醇,用 最大速度震荡秒。 在第步中得到的水相混合物,从中吸取不大于来,加入 吸附柱中, 多余的水相混合液部分可以在做完这一步 的吸附后继续加入;如果有沉淀,可能是第步中加入的乙醇所形成的,要震 荡。 收集管 把混合液全部加入吸附柱当中,并把吸附柱套在 中,在室温下以离心秒,倒掉收集管中的废液,把吸附柱重新套在 收集管上。 重复第六步,直到把剩余的水相混合物全部加入到吸附柱中为止。和第 步一样离心,离心后倒掉收集管中的废液。 的 把吸附柱套到一个新的收集管中,在吸附柱内加入 洗脱缓冲液,然后和第步一样的条件,室温以离心? 秒,倒掉收集管中的废液,把吸附柱套在收集管上。 的洗脱缓冲液, 将吸附柱套回收集管上以后,再向吸附柱内加入 室温条件下离心秒,倒掉收集管中的废液。 的 把吸附柱重新套回收集管上,加入 洗脱缓冲液该液在提供时是浓缩的,用无水乙醇进行了稀释,室温条件 下离心?秒,倒掉收集管中的废液,把吸附管套回到收集管上。 重复一遍步的操作,加入 洗脱缓冲液,离心后弃掉废液, 然后再把吸附柱套到空的收集管上,以离心机的最大速度离心分钟,以彻底 清山东大学硕士学位论文 除膜上残留的废液。 洗脱。弃掉离心管,把吸附柱套到一个干净的.管上,用 ? 的水试剂盒提供来洗脱,要确保水加到了吸附柱的膜表 面中央,加入后室温静置分钟,接着以离心机的最大速度离心分钟,如果想 要得到更多的,就要重新再洗脱一次。得到总后,做好标记快速冻存于 ?冰箱中。 .总浓度及纯度的测定:分光光度仪测量浓度及纯度,并用将各 组浓度调整至同一浓度。 .反转录合成根据试剂盒说明进行: 按照下列组成配制反转录反应液 . .. . ? 总 按照以下条件于扩增仪上进行反转录反应 。 分钟、 ? 分钟 ? 分钟 .实时定量反应. .山东大学硕士学位论文 总量 统计学处理 数据由.统计软件处理,计量统计结果以?表示,实验数 据采用小样本组间检验进行统计分析,.为差异有统计学意义。山东大学硕士 学位论文 实验结果 .培养鉴定结果 原代培养的在饲养层上培养小时后,普通光镜下可见由十几个 细胞组成的克隆团,细胞大而圆,细胞核较大图。免疫荧光染色检测结果 显示,和在中特异表达图,。 .分组培养小时免疫荧光染色结果 结果显示, 组的表达明显少于组和抑制剂组 .,且的阳性表达主要分布于细胞克隆团的中心,组和 抑制剂组的表达无显著差异.,图。组在细 胞核中的表达明显多于组和抑制剂组.,组和 抑制剂组的表达无显著差异.,图,的阳性表达 主要分布于细胞克隆团的周边。组和抑制剂组的阳性细胞 数较组明显减少.,组和抑制剂组之间的表 达无显著差异.,图。组和抑制剂组的阳性细 胞数明显少于组.,组和抑制剂组之间在 核内的表达无显著差异.,图。和的阳性表达主要分布 于精原干细胞克隆团的周边。 .分组培养小时实时定量结果 水平明显低于组和 实时定量结果显示,组和 抑制剂组,组和抑制剂组之间无明显差异., 图。组和基因表达明显高于组和抑制剂组, 组和抑制剂组之间和?基因表达无显著差异 .,图。 .细胞转染 ,小时后,实时定量结果 ,的干扰效果更为明显,因此选 结果显示,,为有效的 为作用的小干扰图。实时定量结果显示,与非特异性 组相比较, 组 水平明显减少,和 水平明显增加,差异有显著意义.,图;与非特异性组相 山东大学硕士学位论文 水平明显增加,和 比较,非特异性组和? 水平明显减少,差异有显著意义.,图。山东大学硕士学位论文 讨论 随着社会的发展和人类自身需求和生活质量的不断提高,男性不育的问题日 益受到重视。在所有可能导致男性不育的原因中,有%一%是源于精子发生出 现障碍。无精子症和少精子症是引起男性不 育的常见原因。近年来随着精原干细胞移植技术的飞速发展,在治疗男性不育方 面有着广阔的临床应用前景钆捌。精原干细胞是一群生活在睾丸特殊的微环境 中、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞,是能向子代传递遗传信息的 永生细胞。的显著特点是可以进行自我更新和向下一级生精细胞分化,即不 对称分裂。这种特点既保证了干细胞池数量,使得精子源源不断的产生,也保证 了物种的延续乜?。小鼠是睾丸生精小管基膜上单个存在的型精原细胞 ,。可自我更新形成两个新的干细胞,或者子细胞经细胞间桥连 接形成,经有丝分裂形成~细胞的印,定向分化为 型精原细胞,后者经.型、中间型、型精原细胞,而后形成初级精母细胞。 像造血干细胞一样具有可移植性,即将移植到没有生精能力的受体动物 曲细精管内,重塑精子的发生过程。年,等皿率先报道的移植 试验,他们利用显微注射法将可育小鼠的混合生精细胞含移植入没有生 育能力的小鼠睾丸曲细精管内,移植后几个月,来自供体的不但可以在受体 睾丸内存活、迁移、定居、增殖,而且还启动了生精过程,产生了具有受精能 力 的精子,并且受精后产生了供体的后代。是未来临床治疗男性不育症最具潜 能的细胞,但其自我更新和分化机制尚不完全清楚。自我更新和分化取决于 其自身调控基因,女、、、、、?等,以及干细 胞巢内的细胞因子,、、等。 是转录抑制因子和家族一个成员,仅在早期未分 化的精原细胞中表达。等【】发现在未分化的精原细胞中表达,表明 是成年雄性干细胞自我更新所必需的。己证实缺陷的雄性小鼠出生 后会出现渐进性的不育,研究发现,可能通过直接抑制基因的转录来 调节精原干细胞的增殖与分化之间的平衡,导致不育。在体外培养精原细胞 的培 养基中添加一定量的胚体下调的表达,表明在精原细胞的分化过程中山东大 学硕士学位论文 /通过调节的表达起一定的作用】。也被称为、、 或,为转录因子家族中的一员,是多潜能干细胞的标志物。本实 验中,与作为鉴定的标志物,在精原干细胞克隆团块中表达, 并且中心部位表达较强,克隆团块的中心部位为干细胞的聚集部位。当把 中的干扰掉后,和基因水平升高,细胞增殖的趋势加 强而分化的趋势减弱。 早在年,美国研究发现如果将牛的脱钙骨基质明胶植入小鼠的肌 肉内,可诱导形成新的软骨和骨,便认为在骨基质明胶中可能存在某种特殊蛋白, 其可有骨诱导活性。经过多年的研究,证明在骨基质中确实存在一种骨诱导 活性蛋白,即骨形态发生蛋白 ,。是转 化生长因子. ,.超家族中的重要组成成员, 因其能在异位诱导骨和软骨的形成而得名【羽】。它通过调节一系列下游基因的活 性,控制着诸如中胚层形成、神经系统分化以及牙齿和骨骼发育等许多重要的生 物学过程。是一组分泌性、疏水性的酸性糖蛋白,相对分子量左 右。在酸性条件下,性质稳定;在值为.的溶液中,有一定的溶解度;若 值大于.时,则失活【。有研究表明,有骨诱导作用的为骨髓基质 干细胞提供了向成骨细胞分化的初始信号【】。是家族中重要的一员, 它主要作用于未分化的间叶组织细胞,对多种细胞的增殖分化具有调控作用。 对干细胞、多种细胞间充质细胞、肿瘤细胞等的增殖、分化、迁移、凋亡 均具有调控作用。已经证实的人类有两种【】:一种是在成熟胎盘组织中表 达的,其前体蛋白由个氨基酸构成;另一种是在骨肉瘤中表达的,其前体蛋 白由个氨基酸构成,其中包括个氨基酸的信号肽、个个氨基酸的 前区和个个氨基酸的成熟片段。基因定位于号染色体,基因转录单位 有个外显子编码,其中至少有两个功能因子保持活性与的靶细胞结合, 根据不同细胞类型发挥不同作用‘。是生殖细胞发生分化程序形成配子的 重要信号之一,并且对小鼠精子的发生和功能的维持具有重要作用。 等】发现诱导大鼠精原干细胞的分化,并且导致细胞粘附特性发生改变。 研究表明,雄性小鼠的由睾丸支持细胞产生,通过调节.基因的表达 来调控精原细胞的分化【】。小鼠精原细胞、精母细胞和支持细胞均表达, 山东大学硕士学位论文 而精子细胞不表达;受体在精细胞中有表达,而在精母细胞和精子细胞中不 表达 】。实验中,我们通过采用添加的培养基培养精原干细胞,使细胞培养环 境中的浓度升高,进而激活/信号通路促进细胞分化。抑 制剂作为一种强效的,选择性,可逆的抑制剂,选择性的阻断信号,其作 用机理是选择性的抑制的型受体,,并且阻碍// 的磷酸化,阻断的效果与使用量有关?纠。 蛋白最早在无脊椎动物中进行鉴定,是通过基因筛查出来的。 等町研究分离出蛋白,等鉴定出基因,它与蛋白密切相关。 在对果蝇和 的研究中发现蛋白和蛋白作用于丝 氨酸/苏氨酸激酶受体的下游。因此,将蛋白和蛋白及其类似物统称为 ?族蛋白。迄今为止,在哺乳动物中已经分离鉴定的蛋白有种。 按照蛋白的结构和功能将其分为种亚类:? ,是家族受体激酶的直接底物,主要包括,,, ,及。果蝇中,它的端特异序列能被型受体磷酸化个 ,它能与磷酸 丝氨酸中有个磷酸化。? 化的结合形成复合体,从而进入细胞核,调控基因表达。?主要包 括脊椎动物和果蝇等。是哺乳动物中唯一的?,在 和?/信号通路中共享。它是诱导的信号传递通路中必不可少 的成员及调控转录的关键转录因子。? 或 ,包括、和果蝇等。其基因由等于年在血 管内皮细胞中发现引。?是由家族成员诱导的,能够竞争性的与 信号受体结合,从而对介导的信号转导起反馈调节的作用聆。与超家族的其 他成员一样,通过丝氨酸/苏氨酸激酶受体 结合,再与 ?受体结合形成复合物。其机制是典型的细胞表面接受配 体信号后,在胞浆内进一步处理,随后信号进入细胞胞核的过程。信号转 导通路由配体、受体、及蛋白等组成。具体转导机制为:配体与 结合后, 磷酸化,激活异聚体中的型受体如./., ./,.并与之结合形成受体复合物,复合物激活了型受 体的蛋白激酶,从而导致细胞内蛋白如,,的磷酸山东大学硕士学位论文 化,.及.可激活这三种,而只激活,。激活 的.主要有,,,与共用型. 结合形成蛋白复合物,该复合物进入细胞核内与特异的转录启动子或辅阻 遏蛋白再次结合形成复合物,最终与结合,进行特异的转录调控过程【’。 这一信号传导机制可以使肌母细胞转化为骨母细胞】,进一步说明诱导骨 生成的演变过程。研究发现在支持细胞中有表达,而在精原细胞中有 表达。本实验的免疫荧光染色结果显示, 组阳性细胞数要比其它两组 多,考虑可能是激活信号通路。 是转录因子超家族中的成员,在生殖细胞中特异性表达,并参与 转录因子的缺失导致精原 精原细胞的分化。在雄性青春期前的睾丸中, 细胞的不表达?,在精原细胞分化过程中起着重要作用。可在 处于分裂期的型精原细胞专一性的表达引,从未分化阶段到分化阶段均有表 达。 研究表明将小鼠的基因敲除后可引起不育,是由于引起型精原细胞分化 的基因消失,所以在精原细胞的分化形成精子的过程中,是关键信号之一 副。等钔利用基因打靶小鼠的实验证明,基因的缺失导致精 原细胞的分化障碍,从而引起不育。在精子发生过程中,基因的缺失将下 调的表达。在活体实验中,能促进表达阳性的精原细胞的分化。 有研究显示,是的下游基因,通过影响的表达调节精原 干细胞的分化。本实验中免疫荧光结果显示,组和抑制剂组 的阳性细胞数明显少于组,并且实时定量结果显示,组的的 基因表达明显高于其他两个分组。综上结果表明,激活/信号通路 后,通过上调靶基因的表达,导致?基因的高表达,从而促进精原干 细胞的分化。 是干细胞因子受体,在精原细胞的生存与增殖分化上具有重要 作用钔。编码和的任何一个基因发生突变都引起精原细胞的发育障碍, 并最终引起不育。研究显示引,生精细胞在不同的发育阶段表达的?的情况 不同,睾丸中的原始生殖细胞数量较少,所以散在表达,原始生殖细胞中 表达与其有丝分裂分化成型精原细胞有关;型精原细胞是严格意义上 的精原干细胞,其未分化并进行自我更新,因此型精原细胞中极少表达?;山 东大学硕士学位论文 当睾丸周边的生精小管中出现亚型时,精原细胞中出现大量的阳性细 胞,这是由于卜型精原细胞不断进行分化。给成年小鼠注射抗?抗体可导 。/ 致所有分化中的精原细胞消失,表明这些细胞对?的依赖性 信号转导系统在型精原细胞的分化起着关键性的作用,在其增殖过程中作用 不 太明显。采用抗?的多克隆抗体对精子进行免疫组化染色,电镜观察发现免 疫标记物出现在几个字顶体质膜上;当精子获能和顶体反应时,一条约 的长蛋白链从精子膜表面释放,这条蛋白链是蛋白的主要表达产物 。目前发现的短蛋白约为,星,其表达在单倍体精子和成熟精 细胞上,与受精发育有关 ’。在小鼠中,分化的生殖干细胞后代依靠外部的信 号。细胞分泌的干细胞因子能激活、的酪氨酸激酶受体,促进 生殖干细胞后代的分化。功能缺失突变会引起精原细胞分化停滞在早期阶 段,表明/的通路是干细胞分化和生存所必须的。当精原干细胞发生分 化的时候,即刚出现型精原干细胞及型精原细胞时,是?表达最高的 时候。这也说明,的表达是精原干细胞走向分化的标志。等陋?将荧光 标记的生精细胞移植入/突变鼠的睾丸,免疫组化显示未分化型的型精原 细胞不表达。本实验中免疫荧光染色显示,组和抑制剂组 的阳性细胞数较组明显减少。实时定量结果显示,组? 水平明显高于组和抑制剂组,转染后实时定量结果显示,与非 特异性组相比较, 组? 水平明显减少。 因此,在的作用下,走向分化的过程中,对的调节起着非 常重要的作用。 本实验提出/信号通路的激活能够促进小鼠精原干细胞的分化,其 作用可能是通过上调靶基因的活性来实现的,此结论尚需更进一步的实 验来验证和讨论。山东大学硕士学位论文 结论 分析实验结果,我们得出以下结论: .可促进小鼠的分化; .可通过激活信号通路,上调靶基因的表达,从而促进 ?的表达,发挥其促进小鼠分化的作用。