维生素c的定量测定

维生素c的定量测定 实验9:维生素C的定量测定(磷钼酸法) 一、实验目的 1、了解维生素C的测定方法。 2、加深理解维生素C的理化性质。 二、实验原理 钼酸铵在一定条件下(有硫酸和偏磷酸根离子存在)与维生素C反应生成蓝色结合物。在一定浓度范围(样品控制浓度在25—250ug/ml)吸光度与浓度成直线关系。在偏磷酸存在下，样品所存在的还原糖及其它常见的还原性物质均无干扰，因而专一性好，且反应迅速。 -，H2SO HPO 24 2-MoO+维生素C Mo(MoO)+维生素C 442 (还原型)钼蓝(氧化型) 三、实验器材 1、松针、绿色蔬菜、橘子、广柑等富含维生素C的生物材料。 2、722型(或7220型)分光光度计。 3、水浴锅。 4、离心机4000r/min。 5、组织捣碎机。 6、吸管0.10ml(×2)，0.20ml (×2)，0.50ml (×2)，1.0ml (×3)，2.0ml (×1)，5.0ml (×1)。 试管1.5cm×15cm(×10)。 7、试管架。 8、吸管架。 四、实验试剂 1、5%钼酸铵:5g钼酸铵加蒸馏水定容至100ml。 2、草酸(0.05mol/L)-EDTA(0.02mmol/L)溶液:称取草酸6.3g和EDTA二钠0.75g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml。 3、硫酸(1:19):取19份体积蒸馏水加入1份体积硫酸。 4、冰乙酸(1:5):取5份体积蒸馏水加入1份体积冰乙酸即可。 5、偏磷酸-乙酸溶液:粉碎好的偏磷酸3g，加入48ml(1:5)冰乙酸，溶解后加蒸馏水定容至100ml;必要时过滤;此试剂放冰箱中可保存3天。 6、维生素C溶液(0.25mg/ml):准确称取维生素C25mg，用蒸馏水溶解，加适量草酸(0.05mol/L)-EDTA(0.02mmol/L)溶液，然后用蒸馏水稀释至100ml，放冰箱贮存，可用一周。 五、实验操作 1、制作标准曲线 取试管9支，按1进行操作。 30?水浴15min后，测定。以吸光度值为纵坐标，维生素C质量(ug)为横坐标作图。 表1 维生素C的定量测定——标准曲线的制作 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准维生素C溶液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 (0.25mg/ml) 蒸馏水/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.2 0.0 草酸-EDTA溶液/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 偏磷酸-乙酸/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1:19硫酸/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 5%钼酸铵/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀30?水浴15min 维生素C质量/ug 0 25 50 75 100 125 150 200 250 A 760nm 1( 样品测定 将所用生物材料如青菜、松针，洗净擦干，准确称取2.0g，加入草酸-EDTA溶液至10ml，组织捣碎机中匀浆2min，取上清液离心(4 000r/min)5min.。取上清液0.5ml，其余按做标准曲线第三步(即加入草酸-EDTA溶液)做起，根据吸光度值查标准曲线。 六、计算 mV 01 m= ×100 3mV×10 12 式中 m:100g样品中含抗坏血酸的质量(mg); m:查标准曲线所得维生素C的质量(μg); 0 V1:稀释总体积(ml); m1:称样质量(g); V2:测定时取样体积(ml); 3 10:μg换算成mg。 七、思考题 1.制作标准曲线需要注意的问题, 2.根据实验过程和结果，举出影响实验结果的几个因素，为什么,