OrexinB在颞叶癫痫大鼠海马及下丘脑表达的分析

中文摘要 Orex l n-B在颞叶癫痫大鼠海马及下丘脑达的研究 中文摘要 研究目的： 研究在海人酸致实验性急性／慢性颞叶癫痫大鼠海马及下丘脑内食欲素 OX-B的表达及其变化，以探讨OX-B对于癫痫发生所起到的影响，为深入了解癫 痫发作机制，发现癫痫诊治的新方向提供依据。 研究方法： 海人酸(KA)腹腔注射成年雄性Wi star大鼠建立急性／慢性颞叶癫痫动物模 型，在癫痫急性发作后8h，1d，3d，7d相应时间点及制作慢性癫痫复发模型后 断头取脑，用免疫组织化学染色法检测大鼠海马及下丘脑内0X—B的表达及随时 间的变化规律。 结果： 1．在对照组大鼠，0X—B阳性神经元在下丘脑有明确表达，其中阳性神经元 多分布于下丘脑外侧区及穹窿周围核，室周核及中央背核也有少量表达，OX-B 阳性神经纤维较密集的地方在下丘脑室周核。 2．与对照组大鼠相比，在KA组大鼠癫痫发作后，下丘脑OX-B阳性神经元数 量随时间而有变化，经历降低又升高的过程。从癫痫急性期一直持续到8h，OX-B 的表达降低，1d时OX-B的表达明显达到最低点，3d时较1d组有小幅升高，7d 时OX-B的表达明显增高，基本恢复对照组水平，慢性复发组阳性神经元数量与 对照组无异，除7d组与慢性复发组外，各组与对照组相比阳性神经元数量差异 均有统计学意义(P<0．05)；OX-B阳性纤维在痫样发作后于下丘脑室周核表达减 少，3d达到最低，7d后又回升到原来水平，慢性复发组阳性神经纤维的积分光 密度值略低于对照组。但是阳性神经纤维的数量差异没有统计学意义(P>0．05) 结论： 中文摘要 OX-B神经元在海人酸所致颞叶癫痫中的表达呈先降低后升高的变化，其可 能在癫痫发作的发病与修复过程中发挥双向调节作用。癫痫发作的早期和急性期 OX-B可致痫，而在癫痫发作后期和慢性复发期则具有抗痫作用。 关键词 OX-B 颞叶癫痫免疫组化大鼠海人酸 Abstract Research on the expression of Orexin-B protein in hippocampus and hypothalamus under cond ition of TLE Abstract [Objective] TMs study was designed to investigate the expression and changes of OX-B protein in hippocampus and hypothalarnus under condition of acute／chronic epilepsy induced by KA．So as to know the impact of OX-B on the epilepsy,for depth understanding the machnism of epilepsy and providing the basis for the new direction of treatment． [Methods] Acute／chronic temporal lobe epilepsy were induced by i．p．injection of KA on adult male Wistar rats．At the different periods of epileptic duration(8h，l d，3d，7d and chronic epilepsy)，the expression and changes of OX·B protein over time in hippocampus and hypothalamus were detected using Immunohistochcmistry． [Results] 1．In the control group．OX-B protein clearly expressed in the hypothalamus of rat, the positive neBrons mostly localized within and around the lateral hypothalamus(LH)， perifornical nucleus，less in the periventricular nucleus(PVN)and dorsomedial hypothalamic nucleus(DMH)．OX-B positive fibers have a high density around the PVN． 2．Comparing with the control group，after epileptic seizures of KA group rats，the expression of OX—B protein in hypothalamus changes over time．The number of positive neurons experiences a reducing and increasing process．The OX—B expression decreased from acute phase until 8h of epileptic seizures and decreased notably in l d compared to the model in 8h，and then increased slightly in 3d of model．In 7d，the expression of OX—B increased obviously to the level of control group．There is no difference between the chronic epileptic group and the control group on the OX·B III Abstract expression．There were statistically significant differences in the number of positive ne切的ns between each group and control group(P<0．05)except 7d and chomc epileptic group．OX-B positive fiber expression reduced around PVN，the density of OX—B fibers de．eased significantly and culminated at day 3，which seemed to recover to the level of controls at day 7．There is less OX-B fiber expression in the chromc epileptic group than the control group．But there were no statistically significant differences in the number of positive fibers between each group(P>0．05) 【Conclusion] OX—B neurons in kmmc acid induced temporal lobe epilepsy may have a reduong and increasing process，which exert a two—way adjustment．In seizures of early and acute stage，OX-B can cause epilepsy,while in the late and chromc rccurrent epileptic seizures it works with an anti-epileptic effection． Key words Orexin-B epilepsy immunohistochemistry rat kmmc acid IV 英文缩略词表 英文缩略词表 英文缩略词 英文 中文名称 DAB 3,3-diaminobenzidine 3，3一二氨基联苯胺 EDl：：f～ ethylcnediaminetetraaccctic acid 乙二胺四乙酸 KA k．anic acid 海人酸 OX Orexin 食欲素 PB Phosphate Buffer 磷酸缓冲液 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PFA Paraformaldehyde 多聚甲醛 Prepro-ox prepro-orexin 食欲素前体 TLE temporal lobe epilepsy 颞叶癫痫 IOD integral opticaldensity 积分光密度 LH lateral hypothalamus 下丘脑外侧区 PVN periventriculRr nucleus 室周核 DⅣ附 dorsomedial hypothalamic nucleus 下丘脑中间背核 SO stratum oriens 海马始层 SP stature pyramidale 海马椎形层 SR stratum radiatum 海马放射层 VIII 第一章引言 第一章引言 癫痫是世界范围常见的神经系统疾病之一，也是最难处理的脑疾病之一，仅 次于脑血管病而位居于神经系统常见病的第2位。据近期世界卫生组织报告，癫 痫的患病率在发达国家、经济转轨国家、发展中国家和不发达国家分别为5．0 ‰、6．1％o、7．2％0、11．2‰，估计全球有5000万癫痫病人n～。我国约有>900万 癫痫患者，患病率约5‰，且每年约有65—70万新病例出现，人数众多。其致残 率和死亡率也较高，已成为值得社会重视的问。近十余年来已引起国际社会 的高度重视，有关各方面的研究亦逐渐深入。 癫痫是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性 疾病，严重危害人类健康。突出的临床特点是具有反复发作性、每次发作的不 可预知性(反射性癫痫除外)，以及必须至少3年以上时间的服药治疗。极大的 影响了病人的身心健康，给家庭和社会也带来了巨大的压力。所谓癫痫的反复 性，是指有了第一次之后，间隔一段时间之后肯定会有第二次、第三次以至多次 发作。所谓发作性，是指症状突然出现，也突然中止。人们平时偶尔发生抽搐不 能确定为癫痫，只有当病征满足上述两条特点时，才能确诊为癫痫病。据美国癫 痫基金会的一份报告表明，1973年前美国为对付癫痫至少花掉40亿美元。由此 可见，世界各国每年就癫痫的治疗要消耗相当可观的巨资。因此，探讨癫痫发 病机制及治疗途径已成为神经病学和神经科学急需解决的课题。近些年，癫痫 的发病机制研究虽然有许多进展，但没有一种能解释全部的癫痫发作，已知神 经元的高度同步化反复异常发放是惊厥发作的基本特征，这种异常发放产生的 条件涉及一系列生化、免疫、遗传等方面的变化。 在按癫痫发作部位的分类中，颞叶癫痫(TLE)占绝大部分。其在成人的各 种类型癫痫中预后最差， 约有60％"--,70％发展为难治性癫痫璐1，而且TLE并发 精神障碍比其他类型癫痫高4"--12倍，多为痴呆或精神分裂症样特征。尤其是 引起视空间损伤，但机制不清楚H1。海人酸(KA)癫痫模型具有与人类TLE极为 相似的行为学和精神病理学特征，被广泛用来研究人类TLE插’。其最主要的病理 异常是神经元变性造成的大脑皮层下颞叶钩回、海马回、海马和杏仁核的硬化 性改变。海马与学习、记忆密切相关，而空间学习、记忆障碍在癫痫模型中已 l 第一章引言 经证实。现有的机制研究多以此为依据，着眼于癫痫病灶内的病理及生化改变。 颞区海马是边缘系统的一个重要组成部分，具有广泛的纤维联系。Liebowitz等№] 在电刺激所致的SD鼠点燃模型中发现，海马神经元释放GABA明显增高。Ding 等n3在海人酸诱导的模型中发现，海马CAl、CA3区细胞外液中GABA水平增 加，同时CA3区苔状纤维GABA免疫活性增强。Ribak等随1发现，遗传性癫痫 大鼠颞叶皮质中GABA浓度明显增高。Peterson等曲1发现，癫痫敏感性沙土鼠 海马GABA能神经元和末梢的数量增加。已知GABA是脑内的主要抑制性神经 递质，以上结果均指出，癫痫发作过程中GABA能神经元功能增强，脑组织 GABA浓度增高，其作用于突触后膜GABA受体使抑制性突触后电位增强，起 到抑制神经元异常放电的作用，即GABA对癫痫发作有抑制作用。 Orexin(又称hypoeretin)是1998年初在大鼠脑中分离出的一类具有重要作用 的小分子神经肽，中文有增食欲素、胖素、阿立新素等不同译名，主要由外侧 下丘脑区特定神经元产生，可投射部位为除小脑之外的全部中枢神经系统。1940 年有学者研究发现，下丘脑腹内侧(VMH)损伤可使动物出现过量进食的现象， 提示VMH可能存在一个进食中枢。1998年Yangisawa研究小组在美国德克萨斯 大学西南医学中心与宾夕法尼亚州史克药厂及英国贝克曼实验室的研究人员合 作，在探索能控制进食新药的实验中在大鼠下丘脑腹外侧发现了两种新的与能 量代谢有关，而与瘦素作用相反的神经肽：增食欲素A和B。增食欲素(orexin) 完全是一种现代分子筛选技术实验过程中的意外收获。因为所有的已知小调节 肽(小肽激素和神经肽)都是通过作用于G蛋白偶联的细胞表面受体(GPCRs)起 作用的，所以Yangisawa研究小组分析了许多编码G蛋白受体的eDNA序列，在 各种组织，包括脑的各个部位提取物中用高分辨的高效液相色谱法(HPLG)来筛 选作用于G蛋白受体的神经肽，在下丘脑腹外侧及邻近区域发现了两种新的神 经多肽，并命名为增食欲素A和B(希腊语orexjn意为食欲)，即orexin A(hypocretin-1)和orexin B(hypocretin一2)两种。它们都是前orexin(hypoeretin) 原的蛋白水解生物活性产物¨们，其受体为2种特异的G蛋白耦联受体OXlR和 OX2R 1。前orexin原由131个氨基酸组成，前33个氨基酸是信号肽，Ala32-Gln33 是信号肽切割位点，后面依次是orexin A((31y34’Gly66)和orexin B(Gly69’Met96)， 其中Lys67’Ar968是激素原转化酶的识别位点，Lys97’Ar998’Ar999序列是食欲 肽C端酰胺化的信号。Orexin A是一种33个氨基酸的多肽，N端是焦谷氨酸的 残基，C端酰胺化，4个半胱氨酸残基形成两套链内的双硫键，分子量为2562D。 2 第一章引言 人、猪、牛、鼠的orexin A完全相同。Orexin B为一种28个氨基酸的多肽，分 子量2937D。OrexinA和orexinB有13个(46％)氨基酸相同。小鼠和大鼠orexin B氨基酸序列一致，前体氨基酸也有95％相同，区别主要在c端。人的orexin B 和啮齿动物的orexin B有2个氨基酸不同，和猪的orexin B只有1个氨基酸的 差异，说明orexin B是一种相对保守的肽类。 0X神经元胞体主要位于下丘脑外侧区和穹隆周围核，下丘脑背内侧核和下 丘脑后区也有一定数量存在。其神经纤维广泛分布于整个中枢神经系统，其中以 下丘脑、丘脑内侧核群、大脑皮质、脑室周围区、边缘系统和脑干等脑区分布 密度最大，受体分布非常广泛，遍及多个脑区n引。其最显著的投射区域是调控睡 眠、觉醒的单胺神经系统(蓝斑核，缝隙核，结节乳头体核)n3J制。目前已证实 Orexin系统与机体一系列生理功能的调控相关，可参与食欲、能量平衡、以及 睡眠与觉醒状态的调控，并对神经内分泌体系起到一定调节作用，目前认为其 最重要的功能是对睡眠一觉醒的调节。 最近研究发现OXlR与OX2R都在海马CAl、CA2、CA3及DG区有明确 表达，从而说明OX系统与海马的功能关系密切，由下丘脑神经释放到海马的 OXs可以直接控制海马的兴奋性：脑室内注射OXs，伴有痫性激活；已知Orexin —A对海马有兴奋作用，Selbaeh等在海马区脑片培养实验中发现该区给予外源 性OX-A可以调节GABA能神经元与谷氨酸能神经元的神经传递平衡n耵，而这 种平衡的失去正是癫痫的一个明确特征n引。Morales A等假设在匹罗卡品诱导鼠 颞叶癫痫模型中，在癫痫持续状态后海马OXs水平增高。结果发现：在匹罗卡 品诱导癫痫持续状态后，前OX mRNA(编码两个肽)的组织浓度在下丘脑迅 速下降，继而出现从这些神经元发出的纤维的OX-A和OX-B免疫阳性纤维密度 下降。另外，意外的发现在海马的前一OX mRNA保持基础水平，在1-3天后 明显上调。用实时RT—PCR及原位杂交技术发现在海马的前一OX mRNA拷贝 数比下丘脑低50倍，海马内前一OXmRNA水平在SE后2-3天增加，伴OX-B 样免疫反应细胞出现在锥体神经元、颗粒细胞和神经元之间的细胞胞体，以及 在海马周围的一些星型细胞。目前这些资料提示OXs的基因编码在海马内有激 活，此可能在癫痫病因中起作用。因此，OXs可能与癫痫源有关，是一系列生 化、解剖和电生理改变导致癫痫的自发痫性活动或癫痫持续状态。在培养的下 丘脑神经元实验发现OXs可增加中枢抑制性神经递质GABA介导的自发抑制性 突触后电流(Spontaneous inhibitory postsynaptic currents，sIPSC)的发放频率， 3 第一章引言 表明GABA释放神经元有orexin受体的表达；orexin还可使微小兴奋性突触后 电流(Miniature EPSC，mEP2SC)和微小抑制性突触后电流(Miniature IPSC， mlPSC)频率都增加，表明orexin可引发突触前神经元GABA的释放。其机制 可能是通过激活了GABA神经元上的的Na。Ca交换泵n"。因此，OXs可能在 GABA能神经元对癫痫神经元放电的传播和扩散的抑制过程中起到一定的调控 作用。近期有研究发现OX—B的基因编码在颞叶海马内有激活n羽，基于以上理论 推测，我们采用海人酸制作成年大鼠急性／慢性颞叶癫痫模型，用免疫组化染色 技术研究在实验性癫痫大鼠海马和下丘脑神经元内OX-B的表达变化，通过观察 OX-B在癫痫模型引发的一系列神经分子生物改变，对OXs在痫性活动的发生 和发展过程中的作用进行研究探讨，为抑制癫痫模型神经元过度放电开拓新的 研究领域。 4 第二章OX．B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 第二章OX-B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 第一节研究材料和试剂 2．1．1 实验材料和设备 2．1．1．1 实验材料 1．实验动物 SPF级健康成年雄性wistar大鼠30只(由中国人民解放军总医院实验动物 中心提供)，体重200’2509，正常自由进食、饮水，自然光暗周期，环境温度22 --25。C安静饲养48 h。 · 2．主要实验试剂 KA购自美国Sigma公司，地西泮注射液购自天津金耀氨基酸公司，多克隆山 羊抗大鼠OX-B抗体(sc-8071，200ug)购自Santacruz生物技术公司，EDTA抗 原修复液(ZLI-9067)，封闭用正常兔血清原液(ZLI-9026)，一抗稀释液 (ZLI-9029)，山羊超敏二步法检测试剂盒(PV-9003)，DAB显色液(ZLI一9018) 购自北京中杉金桥生物公司，中性树胶购自中国上海标本模型厂。 蔗糖，十二水合磷酸氢二钠，多聚甲醛，氯化钠，磷酸二氢钠等试剂购自国 药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。 2．1．1．2实验设备 主要实验设备见表2．1 表2．1实验设备 ’ 设备名称 设备型号 生产厂家 水浴锅 )@ITD．2M TAIS兀'E pH仪 H】98107 HANNA 磁力恒温搅拌器 81．2型 上海仪器厂 通风橱 KD．1 世安 平称 TP．2000 湘仪天平厂 电子天平 HF．200 A&D 冰冻切片机 UM．1900 Leica 系统正置研究级显微镜 BX53 日本0LYMPUS 5 第二章OX．B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 其余设备：500ml输液瓶：输液器；lml注射器，三通，手术器械(直／弯头 眼科镊、Alice钳各2把，手术剪、眼科剪、骨钳各一把)；灌注针(将12号注 射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个； 阳离子防脱玻片(ZLI-9506)，盖玻片(citoglas)，羽毛刀片feather C35 (20x)，标本盒，晾片板购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 2．1．2常用试剂的配制 1．1mg／ml海人酸溶液：KA lOmg，溶于10ml生理盐水，配好的溶液可在低 温冰箱保存1、2天； 2．0．05M PBS： NaH2P04·2H20 1．489 Na2HP04·12H20 14．519 生理盐水 1000ml 3．含4％PFA的0．05mol／LPBS： 多聚甲醛409 蔗糖 309 0．05M PBS 1000ml 加热恒定于60℃，过程中需加入Na0H助溶，此后使用HCL调定PH值至7．4， 使用前用滤纸过滤。 4．0．2M PB： NaH2P04·2H20 5．939 Na2HP04·1 2H20 58．039 加蒸馏水，定容至1000ml，调定pH值至7．4。 5．脱水用蔗糖溶液： 15％蔗糖溶液：称取309蔗糖； 20％蔗糖溶液：称取409蔗糖； 30％蔗糖溶液：称取609蔗糖， 分别将以上蔗糖溶于0．2M PB，调定pH值至7．4，定容至200ml即得，30％ 蔗糖溶液需加入0．02％叠氮钠； 6．冰冻切片冻存液(100m1)： 无水乙醇(100％) 25ml 6 第二章OX．B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 甘油 25ml O．2M PB 12．5ml 蒸馏水 37．5ml 7．0．01M PBS(pH7．2～7．4)(500 m1) Na2HP04-12H202 2．99 NaH2P04·2H202 0．2959 NaCl 4．59 蒸馏水500 ml 混匀，完全溶解后，用H3P04调PH值至pH7．2～7．4。用前配制或者于4度 短期保存。 8．1％PBST：5ml Triton X100，加入495m10．01M PBS，在磁力搅拌器上搅拌 均匀。 9．EDTA抗原修复液：一份EDTA原液(pH8．0)用蒸馏水稀释50倍使用； 10．10％封闭用兔血清：原液常温融化后分装在EP管内，放于4。C冰箱保存， 用时取出，常温融化后以PBST稀释10倍使用； 11．一抗：一抗稀释液稀释抗体，lul抗体加入999ul一抗稀释液，即成lml 一抗工作液； 12．DAB显色液：lml显色液稀释液+50ul显色液底物混合均匀，避光保存， 6h内使用。 7 第二章OX-B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 第二节实验方法 2．2．1实验分组及KA点燃急／慢性颞叶癫痫模型的建立 大鼠用随机数字表分组法分为6组，每组5只单笼饲养，1组为对照组(C)： 2"-'6组为KA组，KA组分别为海人酸一次注射后诱发急性癫痫发作后8h、1d、 3d、7d及慢性复发组。KA组按大鼠体质量计算，经腹腔注射惊厥剂量(8mg／kg) 的KA，对照组给予同体积的生理盐水。观察注射后8h每组动物的行为学变化。 慢性复发组在KA注射致癫痫急性发作7d后再用阈下剂量的KA(4 mg／kg)检验 大鼠癫痫敏感性，制作慢性颞叶癫痫模型，并观察注射后90min动物的行为学变 化。每组均在相应时间点进行麻醉灌注，对照组于给药后8h麻醉灌注。 癫痫发作程度按Racine描述的5级判定n们：1级：咀嚼、闭眼、竖毛、 胡须抖动，嗅、面部肌肉抽搐；2级：以点头运动为主的颈面部肌肉抽搐；3级： 单侧前肢阵挛、抽搐；4级：双侧前肢阵挛、抽搐伴用后肢站起；5级：站立、 双侧前肢阵挛加重，双侧后肢强直，身体背曲强直，失去平衡跌倒伴全身阵挛。 其中1’3级行为代表复杂部分性发作，4’5级行为代表了继发全身性发作。痫性 发作行为学观察应用video录像监测。凡有连续至少3次4或5级发作的大鼠， 被认为是完全点燃。连续4或5级发作，持续30min以上，被认为是癫痫持续状 态。4级以上发作为成功的癫痫自发发作模型。癫痫大发作状态时，为了减少死 亡率，给予地西泮0．5ml腹腔注射。 2．2．2标本的留取 2．2．2．1大鼠的灌注 1)将两个输液瓶中分别装满0．05mol／L PBS(PH7．4)和含有4％PFA的0．05M PBS(PH7．4)固定液(4℃)并将输液管安装在PBS瓶上挂起，调整使输液管内没 有气泡，搁置待用。 2)1％戊巴比妥50mg／kg ip注射将大鼠麻醉，数分钟后，待其前后肢放松， 背朝下放平即可准备灌注。 3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上，固定四肢，用左手持镊子夹起腹部皮 肤，右手持剪刀自腹部剪--d,口，由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至 8 第二章OX．B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 下颌，分离皮下组织，小心操作以最大限度地减少出血。将皮肤翻向两侧，切开 肋骨，沿膈肌向两侧剪开，并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧，将止血钳翻向 外侧以充分暴露心脏。小心用镊子将心包打开，滴一些生理盐水保持湿润。 4)辨别左右心室(右心室为暗红，左心室为粉红)，将吸有PBS的针管刺 入左心室，灌注针头送至主动脉内3’5毫米，牢固固定使之不能退出，打开调节 阀灌注，先快后慢，灌流量约20ml／分钟。用眼科剪刀剪开右心耳，使血液排出， 观察。见大鼠肝脏、脾脏等转呈灰白色，当多数血液已流出后右心耳流出无色透 明液体。 5)旋转三通使之对准灌注液，开始灌注4％PFA固定液(4℃)。固定中大鼠 逐渐出现四肢肌肉及尾部颤动，最后全身组织器官僵硬，灌注完毕。 6)灌注完成后，大鼠断头取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大 孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳剪断两边的顶骨，仔细去掉嗅球上的顶骨，用 剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，将整块的脑组织翘起，剖下脑组织，在含 4％PFA固定液4℃中过夜。 2．2．2．2样品脱水 分别将样品浸泡于4"C的15％，20％及30％蔗糖溶液进行梯度脱水，每种溶液 均浸泡过夜，直至组织沉下(1--3h至过夜)。 2．2．3冰冻组织切片 将切片刀与恒温箱一起预冷到一20～一25℃之间(最佳温度为切头温度-19 ℃，机身温度为一2l℃)，在冰冻切片机内准备好组织支承器，铺一层水待其冻冰， 再放平摆好样品预冷，由于标本表面含有水分，自然就会与底座粘紧。预冷至标 本表面长白霜后，周边滴上水进行包埋，包埋时，由下到上，尽量均匀涂抹，不 要留空隙，特别是底部，螺旋状向上盘旋。标本周围包埋的厚度在1-2mm之间， 底部3-4mm为宜。冷冻的速度要快，冻结的速度越慢，冰晶形成越多。待脑包埋 完毕，冰冻组织与切片机温度平衡后切片，切片必须保持切片刀锐利，及时更换 新刀片；由视交叉至侧脑室后角行冠状位连续切片，切片厚度30um，每15张收 取一次，依切取次序放入24孔板内，并用冻存液保护切片，切片要薄而平整、 无皱摺、无刀痕，行切片免疫组化染色。切片置于冻存液中可放于低温(-20℃) 冰箱内保存备用。用前从低温冰箱内取出，在室温下复温，进入0．01M PBS缓冲 液即可进行免疫染色。 9 第二章OX．B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 在剩余切片中随机选取2张切片做为空白对照。 2．2．4免疫组织化学染色 1)切片在室温复温后，用0．01M PBST洗片，漂洗3次，每次5min，缓冲液 加入Triton-X100用以增加细胞的通透性； 2)抗原热修复：在玻璃瓶中加入EDTA缓冲液(pH8．0)，将脑片放入。水浴 锅加热到95度恒温，使脑片在缓冲液中浸泡。15分钟后，取出玻璃瓶，自然恢 复到室温，0．01M PBST洗片，5minx 3次。 3)3％H202去离子水避光孵育切片，室温lOmin，以去除内源性过氧化物酶 的活性，0．01M PBST清洗，5min×3次； 4)加入10％正常兔血清工作液孵育，37℃，60min，阻断非特异性结合： 5)吸去封闭血清，应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去 余液直接加入一抗：多克隆羊抗大鼠OX-B抗体(1：1000，sc8071，Santacruz 生物技术公司)，用一抗稀释液稀释，转入4℃冰箱孵育过夜至24h(用PBS缓冲 液代替一抗作阴性对照)； 6)吸去抗体，自然放置至室温，0．01mol／L PBS漂洗，5min X 3次，加入二 抗试剂1(聚合物辅助剂)，室温孵育20min，0．01MPBS漂洗5minX 3： 7)加入试剂2(辣根酶标记抗山羊IgG多聚体)，室温孵育20min，0．01MPBS 漂洗5min×3； 8)漂浮法将组织切片标本贴附于载玻片上：切片标本先用小毛笔转移到盛 有0．OIM PBS的培养皿中，然后再裱到泡在培养皿内的载玻片上，随水流移动 到想要调整的切片部位和形态。 8)新鲜配制的DAB显色液中显色l’2min，边反应边于镜下观察，待细胞着棕 色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，以蒸馏水迅速冲三次后加入0．01M PBS 终止反应。 9)将切片经800,6乙醇，90％乙醇(各10s)，95％乙醇，无水乙醇l，无水乙醇 2(各5min)分别梯度脱水干燥，二甲苯1，二甲苯2分别透明(各5min)，中 性树胶l滴／标本封片，晾干后置于显微镜下观察、相机拍照。镜下观察时免疫 反应阳性细胞呈紫红色或棕色。 免疫组织化学空白对照用PBS缓冲液代替一抗，其余步骤不变。 10 第二章OX-B在实验性癫痫大鼠海马及下丘脑的表达研究 2．2．5图像分析 根据George Paxinos＆Charles Watson大鼠图谱定位神经核团，显微镜观 察，拍照。每张切片任取视野，首先在20倍镜下，对下丘脑的阳性细胞进行记 数取均值，以胞浆和突起着色呈棕黄色颗粒，胞核未染色者为阳性细胞；然后采 用美国Image—pro plus(IPP)5．0图像处理分析软件进行图像分析，测定每张 脑片相关神经核团和区域的阳性神经纤维积分光密度(IOD)，算出每组切片的所 有免疫组化染色切片的平均IOD，作为一个样本。 2．2．6统计分析 所有统计过程均用SPSS Statisticsl7．0软件分析处理。所有数据均用均数 ±标准差表示，不同组间均数的比较采用独立样本t检验，设定PO．05 17 第二章结果与分析 图3．2各组人鼠海马及卜．丘脑神经元0X—B表达的变化(20X) A．对照组B．8h组C．1d组D．3d组E．7d组F．慢性复发组 3．2．3各组大鼠海马及下丘脑OX-B阳性神经纤维表达的变化 各组脑片选择室周核同部位进行观察(图3．3)。与对照组大鼠(0．3954± 0．0976)相比，KA组大鼠的下丘脑神经纤维密度变化不明显，癫痫发作急性期 到癫痫发作后3d，神经纤维的积分光密度呈下降趋势，至第3天达到最低点 (0．2872±0．0358)，在第7天(0．3914±0．0934)基本恢复对照组水平，慢性 复发组(0．3135±0．0470)阳性神经纤维的光密度较对照组稍有下．降，但不明显。 且各组问积分光密度数值并无显著性差异(P>O．05)，没有统计学意义。(图3．4 第二章结果与分析 表3．4) 表3．4各组大鼠OX-B阳性神经纤维在脑中表达的平均IOD(±S) 组别 例数 下丘脑室周核 对照组 b 0．3954±0．0976 8h 5 0．3645±0．4651 P 1 d 0 0．3349±0．()798 3d 5 0．2872±0．0358 7d 5 0．3914±0．0934 慢性复发组 3 0．31 35±0．0470 各实验纽VS对照组P>O．05 熏 图3．3脑片染色室周核选取视野部位示意图(4×) 19 第三章结果与分析 图3．4各组大鼠0X—B阳性神经纤维在脑中的表达(20×) A．对照组B．8h组C．1d组D．3d组E．7d组F．慢性复发组 第四章讨论 第四章讨论 第一节I(A注射的模型制作 KA是一种天然提取的谷氨酸类似物，它可以与突触后专门的KA受体结合， 产生兴奋性突触后电流，引起神经元的过度兴奋。全身或大脑局部定位注射KA 可以导致动物癫痫发作，是理想的颞叶癫痫模型。在动物实验中，癫痫状态的产 生是诱发动物由短期内的惊厥(seizure)转向癫痫(epilcpsy)的持续发作。海人 酸、匹罗卡品以及海马持续电刺激等方法均可以在短时间内致动物处于SE，而 后动物转向具有人类癫痫性质的慢性癫痫反复发作。资料啪1显示雄性成年 Wister大鼠具有对癫痫点燃的先天易感性和耐药性，故常用于点燃模型。 我们采用KA腹腔注射8mg／kg点燃癫痫动物模型，属急性与慢性继发性全身 发作性癫痫模型。海人酸模型应用广泛，具有理想的颞叶癫痫模型所应具备的条 件，该模型具有以下优点：(1)制作方便易学，成功率高，所需要的仪器设备简 单，容易推广；(2)不受麻醉剂和手术过程等外部环境影响，便于全面观察动物 惊厥发作：(3)不破坏局部脑组织的结构，有利于进一步开展脑组织各项指标的 检测。(4)在症状学上，海马、杏仁核和其它边缘结构占有中心地位，而KA所致 的颞叶癫痫有病理上特异的海马损伤，与颞叶癫痫的海马硬化相关；(5)有自发 抽搐；(6)与人类颞叶癫痫相同，都对大部分抗癫痫药物耐受。该模型也有缺点： 比如缺乏明确的病灶，与人类继发性全身发作性癫痫还有一定的差别。 14 第四章讨论 第二节癫痫与OX-B的关系 癫痫的临床病因非常复杂，其发生与体内的神经内分泌，免疫，生化环境密 切的平衡密切相关，中枢神经抑制性神经递质GABA的活性在海马区的减低是癫 痫发生的一个重要因素。 OX系统的神经元主要分布在下丘脑区，其与摄食，调节能量代谢及睡眠觉 醒周期等多方面行为相关。已有研究发现ox—A，OX—B的受体在海马CAl，CA2，CA3 及DG区均有特异表达，说明OX系统对于海马相应的功能可能具有一定影响。 本实验通过使用海人酸建立符合标准的颞叶癫痫模型，研究ox—B在癫痫发 作后不同时点在下丘脑和海马的表达变化，证明了OX-B在癫痫发作中起到了一 定影响。但是本实验在染色过程中并未发现明显的海马区的OX-B染色，可能与 大鼠个体差异及染色方法有关。 有实验证明OX-B对于摄食的影响不如OX-A，而其对于睡眠觉醒周期的调控 影响可能占主要地位。本实验中发现癫痫发作早期下丘脑OX—B阳性神经元减少， 可能正是与其觉醒作用有关，而下丘脑OX-B的减少与癫痫发作后的困倦现象相 对应，其机制可能是癫痫发作过程中的神经元凋亡导致的。有文献提示海马区在 癫痫发作后1d、3d有OX-B阳性神经元的表达增多，主要分布在海马CA2-CA3区 的始层，锥形层和放射层，这也可能是下丘脑神经元以及阳性神经纤维表达减少 的原因，Anne Morales对匹罗卡品诱导的癫痫下丘脑和海马的prepro—OX以及 OXs的mRNA表达水平检测实验中也得出相似结论。而癫痫后期OX—B阳性神经元 再度增加，说明OX-B水平在这段期间内逐渐得到恢复，关于其在后期恢复后是 否具有抗痫的作用及其机制，尚有待更深一步的研究。从目前的研究来看，估计 这是与GABA释放有关系的一种调节方式。另外有研究发现，TRtt在下丘脑具有 激活orexin神经元的作用，而TRH在癫痫病人体内起到一种内源性的抗癫痫作 用，orexin的抗痫作用也有可能是部分通过TRH得到激活的，两种物质相辅相 成，对癫痫起到内源性抑制。这些都需要更进一步的探讨。 15 第四章讨论 第三节实验中出现的问题 4．3．1标本制作及挑选的问题 在免疫染色中有时会发现脑片两侧染色结果有差异，神经元数目不同或神经 纤维分布差异很大。分析这种情况的发生有可能是在冰冻切片的过程中，由于某 种原因，如支承器上的预冻冰不平或脑标本放置不平，导致切片时不在冠状位， 而是倾斜了一定角度，则最终挑选的脑片并不是所需要的部位，而是比相应部位 靠前或靠后了一定角度，最终导致样品两侧不在同一平面上，出现误差。故冰冻 切片时要尽量保证标本水平放置，冠状位连续切片。 4．3．2染色背景的剔除 DAB染色时间的控制对于免疫组织化学染色十分重要，尤其是背景染色，要 浅。因为在软件计算积分光密度(IOD)的时候，会把所有黄颜色的部分全部计入， 背景颜色过深，会增加IOD的值，造成误差。所以在实验中尽量做到同一批次样 品在同等条件下一次完成，减少不同条件造成的染色差异；在观察照相的过程中， 尽量一次照完所有染色片，避免光线条件带来的误差，同时关掉相机白平衡，以 免由于相机的智能功能给照片增加不需要的处理结果；在后期电脑计算时，用 IPP软件尽量将所有照片的背景色以同一底色标准统一，避免因背景色不同造成 IOD的差异。以上三点可以最大限度的帮助减少染色背景不同带来的误差。 16 第五章结论 第五章结论 OX-B在海人酸所致实验性急性／慢性颞叶癫痫的发病病程中起到一定的影 响，在癫痫发作的早期和急性期，下丘脑的OX-B表达下降，而海马的OX-B表达 升高，对发作有促进作用，可能与其促觉醒，提高神经系统兴奋性的作用有关； 在癫痫发作的后期和慢性发作期，OX-B的水平恢复，可能对发作起到一定的抑 制作用。是否通过影响GABA释放途径，其机制仍需要进一步研究，了解OX-B 的变化与癫痫发作机制的关系可以为研制新的抗癫痫药提供某些线索。 22 参考文献 参考文献 【1】IL垣Commission Report．111e epidemiology ofthe epilepsies：future directions．Epilepsla， 1997，38(51：614．618． 【2]Jallon P，Ⅱ，AE．Workshop 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的诸位主任以及感谢参与 答辩委员会的各位专家教授1 25

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个人简历 姓名： 王卓 性别： 女 出生日期：1985年10月31日 政治面貌：共青团员 籍贯：天津市 联系方式：kishu@eyou．c．,om 教育经历： 2004．9-2011．7南开大学医学院临床医学系七年制本硕连读 2009．7-2010．6北京中国解放军总医院 实习1年 2010．7-2011．6北京中国解放军总医院神经内科硕士研究生课题研究导师：郎森 阳 ●获奖情况： 2004-2005 南开大学校三等奖学金 2005-2006 南开大学校三等奖学金 2006-2007 南开大学校三等奖学金 2007 南开大学本科生“百项工程”校二等奖，研究综述《雌激素及其受体 对不同年龄段神经系统作用的研究进展》发表在“现代生物医学进展”2008年8 卷10期。 26 在学期间发表的学术论文 在学期间发表的学术论文 《雌激素及其受体对不同年龄段神经系统作用的研究进展》一一《现代生物医学进 展》2008年第8卷第10期(published) 27 在学期间发表的学术论文 雌激素及其受体对不同年龄段神经系统作用的研究进展★ ‘ 王卓柴慈曼倪虹△ (南开大学医学院天津300071) 摘要：雌激素的新近研究发现。雌激素的功能并不局限于生殖系统，它也能够通过其广泛分 布的受体(ERa和ERB)影响神经系统的发育与功能，且该作用受年龄的影响。本文综述 了雌激素对发育期、青年期、更年期三个年龄段神经系统功能状态的影响。在发育期，雌激 素影响神经细胞的存活和生长，与其神经保护作用有关；青年期其主要与情绪变化关系密切， 该阶段不同诱因的抑郁和精神障碍的发生即与雌激素在体内水平变化有关；同时雌激素与其 受体的水平变化对于更年期妇女AD发生，骨质损坏和绝经后抑郁也有一定的作用。了解对 神经系统发育存活影响作用的机制，有利于在不同生命阶段的神经系统疾病治疗过程中采取 相应的策略，达到更佳的治疗效果。 关键词：雌激素；雌激素受体；神经系统 中图分类号：R977．12文献标识码：A文章编号：1673-6273(2008)10-1956-03 Progresses in the effects of estrogen and its recqators on the net"veiLs system of different ages· WANGZhuo,CHAICi-man,NIHongA (College of medicine,Nankai University,Tianjin 30007 1，China) ABSTR ACT：Ra：ent researches on estrogen and its rec,cptors(ER a and ER B)discovered that estrogen had many age-related effects on the nen，ous system in addition to the genital system．This article summarized the r∞,eflt researches 0n the effects of estrogen and its receptors on the nervous system of different ages，mainly including upgrowth，youth and menopause aS representation．During upgrowth，estrogen affected the living and development of nerve cells，its effect involves pallium,nerve stem cells，etc；in youth，the mood change has something closely to do with the level of estrogen and its rocoptors’dramatic fluctuation，especially with depression of different inducements，such as deciduas syndrome，gestation and post-partum ner~，e obstruction；lack of estrogen for women in menopause could result in AD，osteoporosis and menopause depression through neuro-endocrine mode．Knowing the mechanism of effect of es仃ogen on facilitates to take corresponding measures in the treatment ofdiseases ofncrvous system at different stages of development． Key words：Estrogen；Estrogen receptors；Nervous system； Chinese Library Classification：R 977．1 2 Document code：A Article ID：1 673-6273(2008)1 0．1 956-03 在中枢神经系统中，雌激素不仅作用于脑内与生殖相关的神经回路而影响生 殖过程，而且还作用于与学习、记忆、情感以及运动协调功能相关的神经回路而 影响学习和记忆【l】。近年来的研究还发现它不仅在神经系统的发育过程中具有神 经营养作用，而且对成年人和动物的神经系统的功能活动也具有作用，从而对神 经系统疾病的治疗具有重要意义。 1雌激素对不同年龄阶段神经系统的影响 1．1发育期 在学期间发表的学术论文 在胎儿发育早期阶段，大脑是唯一为机体提供雌激素的器官。雌激素受体的 两个亚型(ER Q和ER 8)也在神经系统表达，胞内外雌激素信号均可通过这些 受体来影响神经细胞的活动。因此推测：在神经系统发育过程中，神经元合成的 雌激素可以通过神经系统中广泛分布的雌激素受体对神经系统的发育产生一定 影响。 1．1．1雌激素对大脑皮层发育的影响在小鼠皮层中，ER 13有高水平的表达。 ER 13基因被敲除后，大脑出现严重的形态异常，表现为躯体感觉皮层神经元的 严重缺失，特别是在皮层的第1I、Ⅲ、Ⅳ、V层，此外还有边缘系统大量星形胶 质细胞的增殖。BrdU掺入实验发现，ER 13基因敲除型小鼠皮层的神经元分化发 生停滞；同时，神经元向皮层浅层的迁移过程也受到明显的阻遏。在胚胎18．5 天，缺乏ER B小鼠的脑室区发现有更多的凋亡细胞，皮质的放射状胶质细胞的 突起也发生断裂。因此，ER B可能对于皮层神经元的存活和发育是必要的，同 时ER 13也可能与中枢神经系统神经退行性疾病如Alzheimer disease(AD)和 Parkinson disease(PD)有重要关联【zJ。 1．1．2雌激素对海马发育的影响Pilgrim等在对大鼠发情周期几个阶段各脑 区BrdU阳性细胞的研究中发现，雌性大鼠海马齿状回的BrdU阳性细胞数量明 显多于雄性大鼠，这些新生海马神经元在数量上受着脑内雌激素水平的影响。切 除大鼠卵巢后，其海马新生神经元数量减少，如果给以雌激素替代治疗，新生神 经元的数量又可回升，这些新生细胞具有与海马神经元相同的特性。因此，雌激 素诱导产生的新生海马神经细胞可能对成体后海马的神经发生及其功能维持有 重要影响。雌激素对海马发育的影响还表现在对海马突触可塑性的增强作用。切 除卵巢的雌性大鼠接受一定剂量雌激素后，海马CAl区锥状神经元的兴奋性树 突棘密度增加且在新生的树突棘上有新突触形成。Murphy的研究显示，N．甲基 ．D．天冬氨酸(NMDA)受体阻断剂可阻断雌激素对树突棘上突触形成的诱导作 用。这可能是由于雌激素增加了海马CAl区NMDA受体的密度，而后者的增加 又是提供海马内兴奋性突触形成的一个重要条件。 1．1．3雌激素对背根神经节中感觉神经元存活的调节KorhOriel等通过对 DRG神经元中Bcl．2家族的研究发现，17 13雌二醇可以上调细胞内抗凋亡分子 Bd．x的表达而并不影响Bax的表达，同时Bcl．x在DRG神经元中很可能充当雌 激素活动的下游靶点。抗NGF抗体不能阻断17 13雌二醇的这种效应，说明17 8雌二醇并没有影响NGF的表达；而NGF也没有增加DRG中Bcl．x的表达， 这就意味着NGF和雌激素通过两个独立的途径促进DRG神经元存活。此外， 近期研究发现雌激素对鸡胚DRG神经元的增殖也有促进作用【3J。 1．1．4雌激素对神经干细胞的影响单纯17 0雌二醇对体外培养的神经干细 胞的增殖具有促进作用，可使胚胎神经干细胞中BrdU阳性细胞增殖数量增加 7％，而对成体神经干细胞不存在这种影响14】。如17 B雌二醇和EGF同时加入培 养基中，EGF可削弱雌激素对神经干细胞增殖的促进作用，这种削弱作用在胚 胎神经干细胞要比成体神经干细胞更加明显，其原因可能是雌激素与EGF有着 共同的作用通路，两者同时作用时可能引起EGF竞争性抑制雌激素的效应。雌 激素对于神经干细胞的分化也有一定影响。Johansson等的研究表明神经干细胞 在各种生长因子作用下可分化为神经元和神经胶质细胞。17 13雌二醇可以促进胚 29 在学期间发表的学术论文 胎神经干细胞向神经元分化，对成体神经干细胞向神经元方向分化仅有微弱的促 进作用【51。 17 13雌二醇对体外培养的神经干细胞的作用可以被雌激素受体拮抗剂 ICI．182780阻断，由此可知，雌激素对神经干细胞的作用具有受体依赖性。ER a和ER 13在胚胎神经干细胞以及成体神经干细胞均同时表达，但表达水平略有 不同【4J：胚胎神经干细胞中ER Q的表达水平不恒定，而ER 13则恒定于较高水平： 成体神经干细胞中，ER 13的表达水平始终高于ER 0t。经进一步实验证实，神经 干细胞分化成为酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例对雌激素有剂量依赖性，这种效 应亦可被雌激素受体抑制剂所阻断16J。 1．2生育期 近期的研究发现，脑内有广泛的ER分布，包括新皮层和海马，以及皮层下 的基底核，杏仁核等。在生育期，中枢神经系统的雌激素受体尤其是下丘脑腹内 侧核分布的受体可能参与多种活动，包括内分泌和情绪之间的平衡，生育行为等， 也可能通过影响大脑皮层而影响认知功能。 1．2．1雌激素与情绪的关系雌激素及神经递质和情感障碍的关系很复杂，但 主要可能是通过五羟色胺系统影响心境并导致攻击行为。研究显示，在隔外侧区、 内侧室前区、杏仁核以及中缝背核这些攻击行为相关脑区分布有很丰富的雄激素 受体、雌激素受体、5-HTlA和5-HTlB受体【『71。雌、雄激素可通过调节5-HTlA 和5-HTlB受体激动剂而影响鼠的攻击性。在许多研究中，敲除ER Q的雄性小 鼠攻击行为减少，相反，敲除ER Q雌性对其他与野生型雌鼠表现出攻击行为增 加【8】，敲除ER Q的小鼠表现行为正常或攻击行为增加。 1．2．2雌激素与经期综合症月经与女性情绪变化的关系早己受到人们的注 意。研究表明，月经期雌激素水平升高可以降低或减少精神病发病率，临床上， 研究者发现精神症状在月经fi{『或月经期加重(此期为低雌激素水平相)。为了观 察月经对正在服用药物治疗的双相情感障碍患者心境的影响，Rasgon等让17例 无月经紊乱的双相情感障碍患者接受药物治疗， 结果表明心境变化与雌激素水 平有关‘91。 1．2．3雌激素与妊娠期及产后精神障碍在妊娠期，雌激素血清水平是常人的 100到200倍，而在产后二、三天内便迅速下降至正常值，主要是子宫不再分泌 雌激素所致。产后精神障碍约占产妇的1／1000，产后精神病在产后第1个月内的 发病率是妊娠前的22倍。内分泌因素一直被认为是产后抑郁症的致病原因之 一，但长期以来一直缺乏直接的证据。Bloch等对有或无产后抑郁症史、胸腺功 能正常的妇女各8例，通过诱发低性腺机能法，来观察性激素对产后抑郁所起的 作用。结果发现在性激素撤除后，有产后抑郁症史的妇女5例出现明显的心境障 碍症状，而对照组无一例出现。这一结果支持雌激素和孕酮对产后抑郁的发生有 直接作用。 1．3更年期 神经流行病学研究结果显示，绝经期前的女性比同年龄男性的卒中发生率低， 而绝经后女性卒中发病率明显升高。雌激素替代治疗可使绝经后与卒中相关的死 亡率和相对危险度下降，此外对绝经后妇女的阿尔茨海默病、绝经后抑郁、帕金 森病也有预防和保护作用。更年期妇女雌激素替代疗法的明显治疗效果体现了雌 30 在学期间发表的学术论文 激素对于神经系统的重要作用。对人类不同性别、年龄的下丘脑背侧视上核的 ER Q、13研究显示： 在绝经后妇女视上核精氨酸加压素(A：vP)神经元，ER 13表达明显降低，ER a明显升高，提示绝经前后ER亚型的改变可能与更年期 症状有关。 在动物实验中， 去卵巢后大鼠体内雌激素明显减少的同时，海马组织的ER a m R NA表达显著降低，而ERt5 m RNA表达则明显升高，说明雌激素受体 mRNA的表达受体内雌激素水平变化的影响，且ER a和ER 13的表达对雌激素 减少的反应不同。这也提示老年妇女认知功能的减退可能与脑内ER 13 mRNA表 达降低，ER B mRNA表达升高有关。有关于雌激素的脑保护作用目前知之较少， 体外细胞培养研究发现，雌激素的抗氧化作用优于维生素E，且能阻断谷氨酸的 兴奋毒作用和DNA变性，似与ER无关。但是，在卵巢切除后的雌性鼠下丘脑 和海马，ER B／ER a要比切除前高，从而显示了ERB在调节雌激素在中枢神经 系统的作用中扮演着十分重要的角色IlⅢ。 我国北京地区妇女更年期情感障碍的发病率为36．1％，且其发病率有逐年上 升趋势。通过对人体雌激素昼夜节律特征的研究，发现患抑郁症的女性体内雌激 素与皮质醇的同步节律消失，CRH神经元与雌激素受体Q双标神经元数目明显 增加。雌激素通过雌激素受体促进CRH的表达是人下丘脑一垂体一性腺系统和 下丘脑一垂体一肾上腺系统相互作用的分子基础，提供了抑郁症发病性别特征 性的可能机制。 目前对ER与绝经期相关症状疾病的关系所知甚少，因而对ER的跨学科多 范围的研究必将成为新的热点。例如绝经前两种受体亚型在性腺轴表达及对配体 亲和力的差就具有重要的研究价值，它将进一步指导新型抗雌激素药物开发，新 一代的雌激素替代药物以及雌激素受体拮抗剂将具有更高的效能、不良反应更 小，可大大提高雌激素相关疾病的内分泌治疗效果，改善围绝经期妇女的生活质 量。 2展望 雌激素对于不同年龄段神经系统具有不同的影响作用，对这一领域的进一步 探索将有助于打开神经系统发育这一神秘之门，一方面可以使我们了解雌激素是 否能够通过改变神经干细胞的生物学特性而对神经系统发育产生重要影响；另一 方面也可揭示AD中雌激素的神经保护机制。 妊娠和生产过程中雌激素的戏剧性变化以及下丘脑．垂体．肾上腺轴(HPA)明 显抑制，可能会增加抑郁症的易感性。在绝经期，雌激素水平的下降和调节功能 的丧失可能会导致围绝经期妇女产生心境障碍。这种与女性生殖相关的神经内分 泌模式对心理社会、环境和生理等的因素变化具有敏感性和易感性。进一步的研 究需要识别特殊的基因标记，以帮助我们了解雌激素与孕酮、睾酮和其它类固醇 激素之间的平衡关系是如何影响神经递质功能的。此外，多巴胺和五羟色胺能神 经系统是否存在雌激素异体受体；在女性精神病患者的性激素水平时是否与月经 周期相对固定等，也是今后研究要注意的问题。搞清这些关系可能会对抑郁症、 双相障碍和精神分裂症等一类顽固疾病的有效治疗起到意义重大的作用。 31 在学期间发表的学术论文 参考文献(References) 【l】Zhou Zhi-kun，Zeng Hong-bing，Gao Zhi-ming．Estrogen and disease of central nervous system 【J】．Transaction of Guangdong medicine school，2006,24(4)：420-422(In Chinese) 【2】W ang L，Anderson S,Warncr M，eta 1．Morphological abnormalities in the brains of estrogen receptor beta knock out mice【J】．Proe NatlA cad SciUSA 2001，98：2792．2796 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细胞旁，以模拟递质释放过程能引致相同的生理效应；④存在使这一递质失活的 酶或其他环节(摄取回收)；⑤用递质拟似剂或受体阻断剂能加强或阻断这一递 质的突触传递作用。在神经系统内存在许多化学物质，但不一定都是神经递质， 只有符合或基本上符合以上条件的化学物质才能认为它是神经递质。神经递质根 据合成方式可分为经典神经递质和神经肽两类，有研究资料表明，神经肽是一类 短链的氨基酸化合物，包括生长抑素、血管活性肠肽、脑啡肽等。作为中枢神经 系统中的重要递质或调质，可以通过影响脑细胞的无机离子、Ca：+离子通道影响 细胞兴奋性，参与癫痫的发病机制，在癫痫发病中起着重要作用。以下分类对几 种主要神经肽类递质与癫痫发作的关系进行综述。 【阿片肽】 33 综述 阿片肽是一种具有吗啡样活性的多肽，最先在中枢神经系统发现，并被广泛 ，研究。人体内源性阿片肽包括B．内啡肽、脑啡肽和强啡肽三大类。到目前为止， 已发现了18种内源性阿片样活性的肽，它们均以甲硫或亮脑．啡肽(L．Enk)的序列 为N．末端起始序列。有研究表明，阿片肽类与癫痫的发病机制密切相关，并具 有致惊厥和抗惊厥的双重作用，这两种作用均受特异的阿片受体调节，可涉及u、 8、K和￡等受体，各受体的作用性质不同。阿片拮抗剂纳络酮可对抗阿片肽的 致惊厥作用，但其临床应用疗效不佳。 内啡肽：有研究发现，癫痫发作后1．2小时，脑内的13．内啡肽明显增高，发 作后1"--4日恢复正常，灵长类及大鼠脑室内注射13．内啡肽可引起边缘系统发作。 脑啡肽：脑啡肽是五肽化合物，有甲硫氨酸脑啡肽(M．ENK)和亮氨酸脑啡 肽(L．ENK)两种，但以亮．脑啡肽(Leu-Enkephalin，L．Enk)在癫痫中的变化最明 显。有通过对动物脑室内注射甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽的研究发现，脑啡 肽可引起癫痫样活动，导致惊厥发作，并产生持续的癫痫样放电，甚至导致动物 点燃发作效应itl。对癫痫病人脑脊液的研究也发现，阿片肽类中以L-Enk升高 最明显，且与病程长短、起病年龄及腰穿距末次癫痫发作时间无关，认为L-Enk 升高是引起癫痫的神经生化机制之一【2】，可能参与了神经元兴奋性的增高【31。王 氏等报道杏仁核点燃、青霉素致痫等癫痫模型海马内L-Enk含量显著升甜4，5】。 沈氏等观察到， 声源性惊厥易感大鼠海马、大脑皮层内L=Enk含量明显增加【6】。 强啡肽：有实验表明，海人酸点燃后即刻，大鼠大脑皮层内强啡肽含量明显 升高，2d后回至对照水平，但至点燃后第7d再次升高；而海马及小脑内强啡肽 含量在点燃即刻有显著下降，点燃后2 d海马内强啡肽含量开始回升，至第7 d 已明显高于点燃即刻水平，但仍低于对照水平；而小脑内强啡肽含量至点燃后7 d回升至即刻水平【7】。另外在大鼠点燃模型上，脑室内注射强啡肽可显著抑制癫 痫的发展。在海马内注青霉素或海人藻酸致痫及电惊厥等模型上，均可发现强啡 肽II：LrLNA表达，强啡肽含量，乃至其释放的减少，而针刺抗痫时，强啡肽的合 成、释放及含量均明显增加，强啡肽抗体或受体阻断剂则拮抗了针刺的上述作用。 强啡肽注入动物脑内可提高PTZ及六氟双乙基乙醚等致惊剂的惊厥阈值，对癫 痫点燃性发作产生强烈的抑制作用，并升高海马的后放电阈值，认为强啡肽1．13 可能调节点燃发作的敏感性，为内源性抗痫物质[83。 【脑．肠肽】 中医认为，癫痫的发病是由于脾胃转枢不畅，导致脏腑气机失于调畅，体内 34 综述 精微物质不归正化，反聚饮生痰，气机逆乱，风阳内动所致【9】。70年代末以来的 研究证实，一些产生于胃肠道的肽，不仅存在于胃肠道，也存在于中枢神经系统 内；而原来认为只存在于中枢神经系统的神经肽，也在消化道中发现。这些双重 分布的肽被统称为脑．肠肽。随着这一类物质的概念提出及研究的深入，发现神 经系统与肠道之间的起源与功能有较为密切的关系，在消化道与脑之间，可能存 在着未知的庞大的联络网，二者可能存在着反馈关系[10]o已知的脑．肠肽有胃泌 素、胆囊收缩素、P物质、神经降压素等约20余种。 胆囊收缩素：经过多年研究，目前认为脑肠肽是抗癫痫药物发展最有希望的 一类神经肽，尤其是胆囊收缩素(CCK)。在一些癫痫模型中，CCK显示了强烈 的镇静和抗惊厥作用。预期CCK有希望成为新的抗癫痫药物，特别是对于安定 治疗不敏感者。CCK具有预防谷氨酸的神经毒性的作用。有人认为此作用是通 过CCKB受体，抑制NMDA引起NO形成而产生的。CCK．8能明显促使培养中 的大鼠脑皮质突触体释放GABA。对遗传易感性听源性癫痫动物脑室内注入微量 CCK．8则产生癫痫发作抑制作用，放射免疫法测定癫痫患者颞叶病灶内CCK含 量均见减少。有实验证明，(1)海马内注射胆囊收缩素．8，大鼠癫痫发作明显减轻； 海马内注射L．365和胆囊收缩素．8，胆囊收缩素．8压抑癫痫发作的作用消失；(2) 癫痫发作后海马内胆囊收缩素．8含量显著增加；(3)大鼠海马内注射胆囊收缩素 ．8，海马内13．内啡肽含量明显减少；若大鼠海马内注射胆囊收缩素．8再诱发癫痫， 此时大鼠癫痫发作明显减轻，海马内p．内啡肽含量显著降低；(4)大鼠海马内注射 胆囊收缩素．8，海马内多巴胺含量明显增加。以上结果均提示：胆囊收缩素．8具 有压抑癫痫发作作用【111。 Ghrelin与nesfatin．1：Ghrelin与nesfatin．1是两种新近发现的具有调节能量 平衡和摄食功能脑肠肽。Ghrelin是由日本科学家Kojima M等于1999年发现的 含有28个氨基酸的生长激素释放肽，迄今为止，它是生长激素促分泌素受体 (growth hormone secret agogue receptor，GHSR)的第一个内源性配体，可造成摄 食增加。nesfatin．1是在下丘脑和脑干中新发现的一种分泌性肽，是由核组蛋白 2(nucleobindingr2，NUCB2)N端水解产生的片段，可对摄食有抑制作用。2006 年由日本OH．I教授在(Nature))上首次报告。目前对于这两种肽类的化学结构、 分布定位、作用机制和生理功能及临床应用做了大量的研究探索，对于其与癫痫 的关系也有很多涉及。 Ghrelin ．在匹罗卡品所致癫痫中可以通过调节P13K／Akt信号通路和线粒体 35 综述 凋亡相关蛋白发挥神经保护作用。尽管在研究中并未发现ghrelin能减轻癫痫发 作的程度，但研究结果阐明了癫痫致海马神经元损伤的分子生物学机制及ghrelin 的神经保护作用机制，为癫痫的神经保护治疗提供了新的思路。Nesfatin．1 ．在 癫痫患者唾液和血清检测中，Nesfatin．1也与对照组存在显著性差异：Nesfatin．1 水平在发病期间急剧增加；正规的抗痫治疗后明显减少，但仍高于对照组；在不 同的癫痫发作类型中，它的表达也有所不同n劲。然而，目前一个重要的问题在 于不知道是升高的Nesfain．1水平引起了癫痫发作还是癫痫发作引起了Nesfatin．1 水平的升高。Ghrelin和Nesfatin．1对于癫痫发作影响的机制探讨仍需要更多的研 究。有研究表明，海人酸致痫大鼠下丘脑中，ghrelin水平于发病时降低后逐渐升 高，其中又以24h与7d最高，但始终低于对照组；nesfatin．1则升高后逐渐降低 ’ 但始终高于对照【”J。 血管活性肠肽(V口)：Toshiya掣14】报道脑室内注射VIP则促进杏仁核点 燃，诱发癫痫。而注射抗体取消VII'的作用后，其影响减弱。用免疫组织化学 方法，观察正常、青霉素诱导的癫痫大鼠，以及双氢吡啶类钙通道阻滞剂尼莫地 平(Nimodipine．NIM)抑制癫痫发作的大鼠大脑皮质，海马、杏仁核的血管活性 肠肽能神经元。发现癫痫鼠脑各区的V I P免疫反应(Vm．瓜)阳性神经元较正 常组增多(P