生物化学--第三章 核酸化学-核酸(4-6节)

第四节　RNA的结构与功能RNA与DNA的比较真核细胞内RNA的种类及功能（续表）真核细胞内RNA的种类及功能种类细胞定位英文缩写分子大小及沉降系数功能不均一核RNA胞浆及细胞核hnRNA成熟mRNA及其他RNA的前体小核RNA胞浆及细胞核snRNA100~300个核苷酸参与hnRNA的剪接、转运小核仁RNA胞浆及细胞核snoRNArRNA的加工与修饰小胞质RNA胞浆及粗面内质网scRNA/7SL-RNA129个核苷酸信号识别颗粒的组成成分，选择分泌蛋白一、转运RNA结构与功能p496（一）一级结构　1.分子较小，由74~95个核苷酸构成,S＝4非标准碱基配对　2.3’-CCA-OH，5‘末端多为G3.tRNA是修饰成分最多的核酸（10～20%)如DHU、TΨC等稀有碱基。4.转运RNA约占细胞中RNA总量的10%~15%5（二）tRNA的二级结构一级结构中存在一些能局部互补配对的核苷酸序列，可以形成局部双链，使tRNA的二级结构呈三叶草形（cloverleaf）(1965,Holley)DHU环反密码环TC环额外环(可变的)tRNA的二级结构三叶草形氨基酸臂识别氨酰－tRNA合成酶（三）tRNA的三级结构－倒L形mRNA作为指导合成蛋白质的，含量3-5%.种类多、拷贝少、寿命短、修饰成分少是其特点。mRNA的主体序列是编码区，在其上游5’侧和下游3’侧都有非编码区。真核生物mRNA分子两端还有5’帽子和3’尾部结构二、信使RNA的结构与功能原核细胞mRNA的结构特点由先导序列,编码区和末端序列等组成,为多顺反子结构IPO原核细胞mRNA的结构特点真核生物mRNA的结构1种类多,拷贝少,序列短,修饰碱基少;2由5’帽子结构,非编码区,编码区,非编码区和3’polyA结构等组成,为单顺反子结构.35’帽子结构与蛋白质合成的正确起始有关,可对抗核酸外切酶。帽子结构通常有三种类型：O型：m7G5’ppp5’NpⅠ型：m7G5’ppp5’NmpNpⅡ型：m7G5’ppp5’NmpNmpNpG：N：m在字母左侧表示碱基被甲基化，在右侧表示核糖被甲基化右上角数字表示甲基化位置，右下角的数字表示甲基数目HN—CH3m7G帽子0保证转录的正确起始抗5’－3‘核酸外切酶的活性。功能U系列核内小RNA（snRNA）也有5‘帽子结构，但它们的帽子是三甲基鸟苷三磷酸（m32，2，7G5’ppp5’Np）有些病毒也有帽子和尾结构，有些没有PolyA尾：防止mRNA被核酸酶降解与mRNA其出核有关三、核糖体RNA的结构与功能核糖体RNA（rRNA）是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的75%~80%。rRNA与蛋白质共同构成核糖体或称为核蛋白体（ribosome），是细胞内蛋白质生物合成的场所。原核生物与真核生物的核糖体均由大亚基和小亚基构成。原核及真核生物核糖体的组成rRNA的结构特征rRNA一级结构的一个特征就是甲基化残基的存在，主要的修饰位点在β-D-核糖的C2'-OH。二级结构的模型也已构建出来，rRNA分子内部局部碱基互补，形成许多“茎－环”结构，为核糖体蛋白的结合与组装提供了结构基础。原核生物16SrRNA的二级结构四、其它小分子RNA及RNA组学RNA组学研究小的非信使RNA（smallnon-messengerRNA）小的非信使RNA包括；核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA（核酶）小片段干扰RNA等五.真核生物细胞中DNA的组装核小体60bp缠绕1.75圈约140~160bp真核生物染色体DNA组装不同层次的结构DNA（2nm）核小体链（11nm，每个核小体200bp）纤丝（30nm，每圈6个核小体）突环（150nm，每个突环大约75000bp）玫瑰花结（300nm，6个突环）螺旋圈（700nm，每圈30个玫瑰花）染色体（1400nm，每个染色体含10个玫瑰花200bp）线粒体DNA在真核细胞中，DNA除了存在于细胞核内，还有少量的DNA位于细胞的线粒体中，称为线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）。mtDNA与细菌的DNA相似，也是超螺旋双链环状分子，裸露而不与组蛋白结合，分散在线粒体基质的不同区域第五节　核酸的性质一般性质紫外吸收变性与复性核酸的分子杂交　1.粘度　高　长度与直径之比高达107　2.密度　浮力密度　DNA＞1.7，RNA，1.6，蛋白质，1.35～1.40。　线形双螺旋DNA、线形单链DNA、超螺旋DNA沉降系数之比为1:1.14:1.4。一、一般性质：3.酸碱性：两性偏酸　4.溶解性：固体，都溶于水，不溶于一般有机溶剂　5.颜色反应（定糖法测定含量）RNA与盐酸、苔黑酚（甲基间苯二酚）反应呈绿色；DNA与二苯胺酸性时共热，生成蓝色产物。6.核酸的水解　酸、碱或酶水解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。酸易水解N-糖苷键，DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成无嘌呤酸。碱易水解磷酸酯键，RNA在0.3N碱中即被水解，DNA对碱相对较稳定。RNA在0.1mol/LNaOH溶液生成环状磷酸二酯，进而生成2′-或3′-磷酸核苷核酸酶的分类：1.按作用底物：RNaseDNase2.按对底物的作用方式：　　　核酸内切酶　　　核酸外切酶3.按对磷酸二酯键的断裂方式：　3’－OH与磷酸之间断裂：蛇毒磷酸二酯酶　5’－OH与磷酸之间断裂：牛脾磷酸二酯酶4.按水解磷酸二酯键的专一程度　　特异性水解：　　非特异性水解限制性核酸内切酶：在分子生物学研究中最有应用价值。例如EcoRI能够切割DNA的双链，水解不需要ATP。可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。即识别二倍对称性的序列，做交错切割，产生粘性末端，可以形成重组分子。常用于克隆和序列二、紫外吸收　　核酸中的嘌呤环与嘧啶环在260nm处有最大紫外吸收。OD260的应用1.DNA或RNA的定量OD260＝1.0相当于：50μg/ml双链DNA　40μg/ml单链DNA(RNA)　20μg/ml寡核苷酸2.判断样品的纯度DNA纯品：OD260/OD280达到1.8RNA纯品：OD260/OD280达到2.0(一)核酸的变性1.概念：指核酸双螺旋区的的氢键断裂，变成单链无规则线团结构的过程。2.变性因素：温度升高、过酸过碱、纯水、甲醛和尿素等的存在3.变性实质：双链间氢键断开，成为两条单链　并不涉及磷酸二酯键的断裂，其一级结构(碱基顺序)保持不变。三、DNA变性与复性　DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如粘度降低、浮力密度增加，失去部分或全部的生物活性，紫外吸收(260nm)值升高等。4.增色效应与减色效应：增色效应：当双链DNA解链成单链时，260nm的紫外吸收值明显增加。　应用；检测核酸变性的情况。例如，天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加25～40%，而RNA变性后，约增加1.1%。5.熔解温度（meltingtemperatureTm）：加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度。也称为熔点、Tm值。DNA变性时，将紫外吸收增加量达最大增量一半时的温度值称为溶解温度、Tm值。DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。一般DNA的Tm值在82～95C之间。DNA的Tm值的影响因素：1.G和C的含量2.DNA的均一性3.离子强度、pH4.变性剂等经验公式：（G+C)%=(Tm-69.3)×2.44（二）复性：　1.定义：除去变性因素后，互补的单链DNA又可以重新结合为二级双链DNA并恢复生物活性的现象，称为复性或退火。　　Tm－25℃2.复性的影响因素：（1）温度和时间：一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件。复性时温度下降必须是一缓慢过程（2）DNA浓度和片段大小：（3）DNA顺序的复杂性：　简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。（4）离子强度热复性在基因测序中被广泛应用（三）变性与复性的应用　　PCR:polymerasechainreactionPCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。　5Primer15Primer255TemplateDNA基本工作原理分子杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern杂交（DNA-DNA杂交）Northern杂交（DNA-RNA杂交，或RNA-RNA杂交）Western杂交（抗原-抗体进行杂交）Eastern杂交（Westernbolting的变形）：双向电泳后蛋白质转移转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光。分子杂交的原理示意图不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例：southern印迹法核酸的变性、复性和杂交Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。DNA的杂交：Southern印迹RNA的杂交：Northern印迹主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。Western杂交印迹法(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应三种印迹技术的比较原位杂交(insituhybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态第六节DNA一级结构测定20世纪60年代，R.W.Holley首先测定了酵母tRNAala的碱基顺序，采用的类似氨基酸测序的重叠法，非常烦琐。1975年，Sanger采用了一种新型的快速测序方法-.1977年Sanger改进了测序方法，称为末端终止法，速度更快。根据Sanger的方法，现在已经有各种自动化测序仪，DNA的测序工作更加快捷，人类基因组测序因此得以提前完成。化学测序法：Maxam和Gilbert于1977年发明用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰然后用哌啶切除碱基，DNA链断裂成片段，末端为特异碱基变性胶电泳分离，放射自显影得到测序图谱。判断方法同Sanger终止法。RNA测序：用特异酶切断特异碱基位置的核酸链。电泳分离得到测序图谱，同Sanger终止法。化学试剂断裂RNA，电泳得到测序图谱。逆转录生成DNA，然后用DNA测序法。核酸的其他测序方法英国著名化学家桑格。他因测定出胰岛素的氨基酸排列顺序获1958年诺贝尔化学奖，又因发明测定DNA序列的方法（即桑格法）获1980年诺贝尔化学奖美国分子生物学家W·吉尔伯特因发明出另一种测定DNA序列的方法，与桑格分享1980年诺贝尔化学奖。美国生物化学家穆利斯、1993年因创建PCR技术获诺贝尔化学奖。本章小结核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（Watson－Crick双螺旋模型、Z－DNA）、结构维持的化学键RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交作业1名词解释核酸的变性与复性（denaturation、renaturation），退火（annealing）、增色效应（hyperchromiceffect）、减色效应（hypochromiceffect）DNA的熔解温度（meltingtemperatureTm）分子杂交（molecularhybridization）2.将核酸完全水解后可得到哪些组分?DNA和RNA的水解产物有何不同？3.对一双链DNA而言，若一条链中（A+G）/（T+C）=0.7，则：（1）互补链中（A+G）/（T+C）=？（2）在整个DNA分子中（A+G）/（T+C）=？（3）若一条链中（A+T）/（G+C）=0.7，则互补链中（A+T）/（G+C）=？（4）在整个DNA分子中（A+T）/（G+C）=？4．DNA热变性有何特点？Tm值表示什么？有你的参与生命科学可能更精彩←