活细胞成像设备的选择

为活细胞研究设计光学显微系统时，首要考虑的是器的敏感度（对信号乃至噪音的检测），图像获取的速度，以及在此基础上标本的可行性。对于固定细胞的成像，曝光时间及光强度相对来说都很高，这时可能会造成光漂白；然而对于活细胞成像，上述光的影响必须去除。几乎在所有情况下，活细胞显微镜都会在尽可能高的图像质量与尽可能好的细胞活性之间取得一个平衡。对于此类实验，时间及空间上的分辨率需要设定在能满足实验要求的水平上，而不是给予过度的光照或设定过多采样时间点。  基本上,一个理想的活细胞成像系统必需有足够的敏感度，来满足在弱荧光条件下仍能得到高图片质量；同时，系统也必需足够快，以整个动态过程。 另外，这个系统还需要有足够高的分辨率以捕捉样品细节，并且能够准确的实时测量每个微小的光强变化。然而不幸的是，要改善上述的任意一条都需建立在牺牲其它性能的基础上。因此现在还不能够设计出一个可以满足所有要求的活细胞成像体系。研究人员现在只能在尽量减低不重要的信息的遗失的同时，尽可能的获得最优的重要参数。这样，显微镜的配置最终取决于成像的要求，对于样品在实验期间活性的要求，进行标记的难度水平，以及仪器的可用性等实际因素。如图一（Figure1）所示为一台倒置研究级显微镜，它配有四个相机接口，并可满足对培养的组织的研究。在四个接口上分别配有四个不同的相机，每一个都用来获取不同的图像。在大多数情况下，这种显微镜的分光设计是100％进入相机或以80：20的比例同时分配给相机和目镜。在弱光成像时，研究人员必需确保将最敏感的相机接在100％分光口上。在图一中，彩色CCD（FullcolorCCD）接在显微镜的底部（a），它从物镜接受的光信号不经过棱镜或反光镜的反射。这样的相机通常用来进行多色荧光或明场拍摄。显微镜右侧连接高效的电子倍增电荷偶联设备（ElectronMultiplyingChargeCoupledDevice，EMCCD）（b），它通常用来检测极弱的荧光信号。接在显微镜左侧的相机（c）配有一个高量子效应的感应器，可以感应700－1000nm 波长范围内的光，所以这个相机可以用来进行微分干涉相称（differentialinterferencecontrast，DIC）观察方法下厚标本的红外线照明成像。最后，对于高分辨率的单色荧光成像，如全内反射荧光或其它荧光技术，图一中的显微镜在前部（d）配备了Peltier-cool 相机。这个相机最小像素点为6μm，适合于此类成像的需求。如图一中的配置非常昂贵，但是它能满足用户所有的成像要求。进行活细胞成像的光学显微镜需要宽光谱增称模块。大多数的研究者使用荧光显微镜，通常还会配合一种或多种透射光技术。其中荧光技术包括了传统的宽视场落射荧光，激光扫描共聚焦，真空碟片共聚焦，场扫描共聚焦，多光子，全内反射（TIRF），荧光关联光谱，荧光寿命成像（FILM），光活化，镭射陷阱等技术。相应的成像技术有光谱成像，多色成像，共定位，时间序列，荧光光漂白恢复，（FRAP，FLIP，FLAP），荧光共振能量转移（FRET），荧光散斑显微镜，膜片钳技术等，以上这些技术通常要配合一种或多种基础成像技术。当荧光与明场,DIC,霍夫曼调制相称(HMC),相差等技术相结合时,荧光技术作为探针,可用于定位.对于绝大多数的活细胞成像来说,显微镜的配置都需要满足一些特定的需要以保证试验能够成功进行。除了显微镜与数字成像系统，活细胞成像还需要考虑到两个限制因素——一个是保持细胞的活性，另一个是在北京噪音及自发荧光的基础上尽可能的提高信号强度。提高活细胞成像的信噪比活细胞成像与固定细胞成像之间的基本区别是，后者的成像没有过多的限制， 如合适视野的选定，曝光时间的设定，电子益增的设定，读出率及,偏移值等。这样，染色的固定样品的成像就可以充分利用相机的全部动态设定。因此，固定成像可以得到理想的信噪比。但不幸的是，由于细胞活性对照明的严格要求，活细胞成像的情况又与固定细胞的成像有所不同。在活细胞成像时，样品的灰度往往比背景高不了多少。在这种情况下，成像首要考虑的是检测系统的暗电流及噪音值。经济型的相机通常噪音都会比较高，导致背景混乱并掩盖样品信号，在读出速率增加时这种影响更为严重。所以，几乎所有的活细胞成像设备质量的衡量都是检测器的好坏。数字图像的噪音主要由四方面造成，检测器，照明系统，Poisson 噪音或shot 噪音（由于光子通量的随机性造成），以及弥散光。在大多数情况下，通过选择好的检测器或优化照明条件可以降低系统噪音。事实上，任何一种光子检测器在记录的时候都会产生某种形式上的噪音。扫描光聚焦及多光子显微镜中的光电倍增管（PMT）会产生杂电子。同样的，用于明场，全内反射，针孔碟片共聚焦，场扫描显微镜的CCD也会生成背景暗电流。对此，CCD 及光电倍增设备也做了一系列的改进，比如制冷设备，它会使仪器工作时保持在低温状态，从而降低暗电流的水平。然而，在读取光信号并将模拟信号转换为数字信号的时候，特别是CCD这种仪器，也会产生噪音，即readnoise，制冷数码相机产生的主要噪音。                                                                       Figure2所示为影响活细胞成像质量的数字相机的读出速度与敏感度的相互依存关系。Thespecimenisacultureofhuman 图中样品为人的宫颈癌细胞(HeLa 细胞系)，展示mKO（monomericKusabiraOrange）荧光蛋白与人的α珠蛋白融合，图片在宽视场荧光下单色相机拍摄，照明中添加TRITC滤片，读出速度为10或1.25MHz。Figures2(a)&2(b)所示，在关闭CCD 光闸的条件下，低读出速度下的噪音要明显高于高读出速度下的噪音。但是，如果将CCD 调节到全动态范围的话，这方面的影响就不明显了，如Figures2(c)&2(d) 所示；然而，在低光照条件下，低读出速度(Figure2(f))的图片质量要明显的优于高读出速度（Figure2（e）。 Figures2(e)&2(f) 的照明强度大约是 Figures2(c)&2(d) 的十分之一。如将照明强度再降低5倍效果会更加明显，如Figures2(g)&2(h)，低读出速度下的图片至少还能够表达出需要的效果(Figure2(h))，然而高读出速度下的成像质量则很不理想(Figure2(g))。一个成功的数字成像实验，要求样品的空间照明模式是连续的，即整个视野内的照明是连续一致的，每次成像间的图片也是连续一致的。这取决于照明光源，使用钨卤素灯照明，样品的光学性质在显微镜下通常都是连续的（被称为光学一致性）。然而使用激光扫描显微镜的照明装置对某一特定的点进行扫描，则每一次的扫描结果都不一样。另外，使用汞灯（themercuryplasmaarc-dischargelamp）作为宽视野荧光显微镜的照明光源，图片结果会在光谱上体现为特定的分离的波长峰值。相比之下氙灯（Xenonlamps）在可见光谱下的结果就相当连续，÷但是在它在紫外区的结果不佳（这一光谱范围通常不用于活细胞成像）。对于金属卤素灯这样的照明光源，它的特性介于汞灯与氙灯之间，也许是性能最佳的光源。金属卤素灯能够提供从紫外到红外间连续的光谱，此外，保有汞灯的光强。除了调整照明光源，为了达到照明一致的效果，还可以在灯箱及显微镜的照明输入端口之间添加一个光导纤维（或液体光导）。在视场中的照明梯度可以通过计算来矫正（flat-fieldalgorithms）。灯泡有时在输出的亮度会与平均值有10％的偏离，这时需要注意的是它不能够通过光学纤维来矫正，而要使用稳定的电源。对光子通量的测量是统计学的处理，在检测信号时会产生偏差。所谓的Poisson 或 shotnoise（如前所述），它体现在测量N个光子时，出现的偏差与N的平方根成正比，即信噪比。所以，增加信号光子的数量N可直接提高信噪比及图像对比度。提高信号最简单的方法是手机更多的光子，通常做法是增加曝光时间或提高激发照明的强度，但是这些做法会增加光毒性并降低细胞活性。其次，另一个更有用的方法是加强检测器的敏感度。为了解决活细胞成像低光照的问题，现在的数字CCD相机检测器更加敏感，这是通过面元划分（binning）来实现的(如Figures3&8所示)。一般CCD读取像素点会将横向上的像素值转移到只读寄存器上，然后进行顺序分析。在binning 处理时，相互临近的一群光信号会被合在一起检测（2x2 或 4x4）为一个信号值进行输出。这通过将多行像素转移到一系列只读寄存器(比如两行进行 2x2binning ，四行进行4x4binning)中然后多行同时读取来实现的。在2x2binning 情况下，空间分辨率会降低一半，信号强度增加4倍，信噪比增加2倍。很明显，虽然降低了空间分辨率，但对于弱信号强度的提高是很显著的。   Figure3显示的是将临近的像素结合在一起并不断的增加binning 水平，对数字图像的空间分辨率及最终尺寸的影响。样品为印度麂鹿皮肤组织的纤维原细胞，它表达mCherry 荧光蛋白（红色伪彩）及人的β肌动蛋白，位于应力纤维组成的丝状细胞骨架网络中。通常在进行荧光蛋白标记时，表现出很好的共定位的细胞常常表达很低水平的融合蛋白，其发出的信号极微弱。如果不用binning处理(Figure3(a))，在不产生光毒性及光漂白的曝光时间下得到的信号弱到无法辨别。Binning2x2 渐进到 4x4增加了信号水平，但降低了空间分辨率(Figures3(b)and3(c))。在binning8x8 像素下的图像(Figure3(d))最亮。但分辨率降低极多。另外很重的一点是，在binning 处理时，增加合并像素点，图像尺寸按比例缩小例如，不进行binning 处理（1x1)的图像（Figure3）的原始大小为1360x1024（pixels），在(2x2),(4x4), 及 (8x8) 处理条件下的图像分辨率分别为680x512,340x256, 及 170x128（pixels）。如上所述，这些图像的尺寸被缩小了。同样的，一个512x512 的数码相机在进行上述比例处理时，图像的大小将分别缩小为256x256,128x128,and64x64（pixels）。Binning 处理的重点是读出噪音产生在binning 处理后，所以虽然读取了几个像素的集合，但是每个binning处理后的像素只读取一次。相对的，像 2x2 这样的像素集合，如果先收集信号再进行平均计算，那么由于每个点都会产生噪音，这样的结果会比binning差。因此，虽然binning处理会降低空间分辨率，但是这样的处理可以显著提高空间分辨率，这在光敏细胞的试验中是非常有意义的，因为在这样的试验中，光照水平非常的低，而且曝光时间和很短。在活细胞成像中最重要的参数通常是检测若荧光信号的能力，而不是空间分辨率，所以，通过binning处理提高敏感度及缩短曝光时间是成像的重点，不需太多考虑空间分辨率。除binning 处理外，许多高效相机通过小范围拍摄或只拍摄感性的区域来缩短曝光时间，这种拍摄方法可以在保有空间分辨率的同时减少曝光对细胞的损害。克服常规高效相机的缺点 为了满足极低照明下高速成像的需求，开发商们推出了一种有效的放大弱信号的相机，EMCCD。这种EMCCD通过芯片上益增寄存器进行信号放大，敏感度能够达到单光子检测级别，同时不会像传统CCD 一样降低量子效率和空间分辨率。EMCCD 的一个显著特性是，通过芯片上专门的外延串行寄存器，在硅亚结构内发生碰撞电离过程中进行增益。(Figure4). 由光子激发出的电荷要高于读出噪音，这即使在高帧频下也能实现，并且对于现在的任何CCD 都使用，包括背照芯片CCD（back-illuminatedCCD）。   EMCCD 的优越性在于由于放大过程直接发生在CCD的结构内，它要比其它的强化CCD（intensifiedCCDs）便宜一些。对于单分子成像，全内反射，针孔碟片场扫描共聚焦离子通量检测实时3D试验等弱信号的测定，EMCDD要比其它针对弱光的感光原件好很多。另外，如果使用传统的荧光成像技术，EMCCD 极高的敏感性可以在弱光及/或低激发强度下得到高信号强度，这样，可以降低光毒性及荧光的光漂白。显微镜的光学系统用于活细胞成像的显微镜的结构必需足够坚固，或者是铝制的，同时，也要足够稳固防震。而显微镜外露的光学表面及聚光镜，灯箱，物镜转盘等装置必需保持洁净，存放显微镜的房间要保持低湿度的无尘状态。在活细胞成像的日常使用时，必需保证所有的光学通路及光圈在同一轴线上，并应用克勒照明。存放显微镜的房间也有相应要求，室内不要安装顶灯，以减少直接进入目镜及样品处的光线。电子数字相机通常通过专用的接口接在显微镜的一个或几个相机接口上。研究级的显微镜通常有多个接口同时连接几个相机(如 Figure1)。这对于需要使用不同手段得到最佳图像效果的显微成像是十分有用的。在显微镜机身内部有一系列反光镜，分光镜，棱镜分别被安置在恰当的位置以将光信号反射到不同的相机接口及目镜中。需要注意的是，由于部分光进目镜而减少了进入相机接口的光线，相机成像的信噪比会降低。因此，在配置显微镜时，应该将若荧光照相的分光口的分光率设置为100％。物镜负责收集由样品发出的光线，并将其传到显微镜的光学组件中，因此，物镜的选择是至关重要的。在光路中的光学组件，如反光镜，分光镜，聚光透镜，滤光镜，棱镜等会严重的降低信噪比，所以，这种效应必需降低。在荧光成像时，应当使用高数值孔径的物镜，因为它能够尽可能多的收集由样品发射出的光线。数值孔径（Numericalaperture）体现了其棱镜能够从单一点光源收集光线的能力，因此，对于活细胞成像，数值孔径是最重要的考虑因素。其数值标注在物镜筒上，大小从0.25（低放大倍数，如10x干镜）到1.20（水镜）及1.45（油镜，40x-100x范围）不等。数值孔径的表达式如下：NumericalAperture(数值孔径，NA)=RefractiveIndex(折射率，η)×LensAcceptanceAngle(镜口角的正弦值，sin(θ))因此，物镜对光的收集能力与物镜前透镜及样品间介质的折射率有关，与镜口角的正弦值有关。数值孔径为物镜分辨率数学表达式的一个因数。根据瑞利判据（Rayleighcriterion，一种保守的估计），分辨率等于照明光波长与一个常数（1.61）的乘积与数值孔径的商。另外，数值孔径还决定了图像的亮度，图像亮度与数值孔径的四次方成正比，与放大倍数的二次方成反比。所以，稍微提高数值孔径都能够显著地提高信号强度。因此活细胞成像要求使用数值孔径最高的物镜及高折射率的浸入物（油或水）。如上，图像的亮度与物镜放大倍数的二次方成反比，因此弱信号成像最好使用低倍数的物镜。比如说，在100x数值孔径1.4的物镜下观察样品，如果这个时候信噪比成为影响图片质量的主要因素，那么将物镜转换到60x或40x，则同样的数值孔径下图片的亮度会得到显著的提高。事实上，将60x/1.4与100x/1.4的物镜进行对比，对同一张荧光图像成像，前者要比后者亮三倍。观测强度也是衡量物镜透光能力的一个因素。在某些试验中，为了达到要求的放大率，通常要将放大与binning 处理借个起来。在多重标记的固定细胞试验中（有时也能是活细胞试验），具有色差及平场矫正的物镜是最理想的。然而不幸的是，复消色差物镜和平场复消色差物镜中相对于消色差物镜和萤石物镜（低精确度物镜）来说，不可避免的添加了很多光学器件（透镜）。高矫正的物镜不会生成假象，可应用于透射光技术，如相差，DIC等。然而，矫正的结果降低了光透过率，这对固定细胞的成像不会有很大的影响，但是对活细胞成像来说却不然。阐述这种现象最好的例子是，一个40x/1.4的平场复消色差的物镜，理论上要比同类100x物镜亮六倍，但实际上，前者的亮度只有后者的四倍左右。但无论如何，40x及60x的物镜在光学分辨率极限下，仍能提供最亮的图片。   如Figure5 所示，为就图像分辨率及亮度方面，物镜数值孔径的重要性。样品为非洲绿猴的肾脏上皮细胞培养物 (CV-1line)，用表达特异结合线粒体的EGFP 的质粒转染该培养物，在荧光显微镜下可以观测到线粒体在细胞中的网络分布。Figure5 为平场萤石物镜下相同视野的图片（数值孔径1.3，放大倍数由40x到100x不等）。虽然图中的拍摄条件及矫正手段相同，但40x下的线粒体要比其它条件的亮(Figure5(a)，图片大小为经调整)。相比之下，60x及100x下的图片逐渐变暗，100x下的线粒体几乎不可见 (Figures5(b)&5(c)).这样的物镜仍然可用，但是必需放大检测器的增益值，这样一来信噪比就会降低，图片质量也相应下降。 需要注意的是，由于数值孔径相同，从Figures5(d)到5(f)的分辨率是一样的。    以上的例子说明在选择活细胞成像的物镜时，如果样品标记荧光，则不要盲目的追求放大倍数。对共聚焦显微镜的40x或60x物镜来说来说，在成像时进行放大后的结果和100x物镜的成像效果相同(Figures5(d)and5(e))。由于具有相同的数值孔径，两个物镜的分辨率是一样的。但这种说法并不是说60x或100x 的物镜没有任何作用。事实上，观察小样品通常要使用高倍数的物镜，比如宽视场显微镜下观察过氧化物酶体和分泌颗粒。由于图像大小通常与检测器的尺寸有关，所以，光学成像最终的放大率取决于CCD的参数（像素点大小，中间变倍等）。因此，物镜的选择通常要考虑光学显微镜的配置，以及试验的特殊要求。信噪比比分辨率的影响更大的时候，最好要选择矫正度低的物镜，这样的物镜中光学原件更少，相对的光的透过率会显著提高。同样的，相差物镜中的光学器件也会减少光的透过率。这种水平的减少在透射光成像时不会有影响，但是在荧光成像时大概会减少15%-20％的光透率。因此，在进行活细胞成像时，如果试验用的荧光标记较弱，则不能用相差物镜，除非实验步骤方面有特殊的要求。同样的，当试验要求将荧光图片同DIC 图片进行叠加时，在荧光成像前要将物镜下方的偏光装置拿开，因为它大概会减少30％ 的透光率。    光路中的任何缺陷都会直接影响最终成像的信噪比。对于活细胞成像来说必需消除高数值孔径物镜的球差。通常引起球差的因素有培养液及物镜浸入物等。球差是由于光沿光轴不均匀分布造成的，会导致成像变形。由于成像样品通常较大，球差还会影响信噪比。这个问题在对厚组织成像时要比薄层细胞成像时严重很多，由于水的折射率与培养基的折射率接近，通常使用水镜来消除这个问题。另外一种方法是矫正因培养基或盖玻片导致的折射率的改变。由于折射率会受温度影响发生变化，所以，在室温下与在37摄氏度下的浸入物及盖玻片厚度需要做适当调整。最新的物镜可通过矫正环来消除温度引起的折射率的改变。   如 Figure6 所示，为显微镜光学系统（a）及数码相机检测系统（b）对活细胞成像的影响。图中样品为鼠袋鼠肾脏的一个上皮细胞(PtK2line)，该细胞表达EGFP，EGFP与H2B组蛋白结合定位于细胞核。观察方法为宽视场落射荧光。如图，左图右下方及右图左下方为分辨率最佳的两张。在活细胞显微成像方面，光学系统中物镜的数值孔径及光源的波长决定了图像对比度与物理分辨率。在左图中，随着照明强度的增加，图像中的噪音明显减少；随着光学分辨率的提高，细胞核中的细节变得更加清晰。在右图中，图像质量随着灰度及空间分辨率改变。增大像素尺寸，图像的细节变得模糊不清，图像几乎无法辨认；而降低灰度，会改变图像外形，并仅呈现出具有高对比度的信息。以上两种因素共同改变图像质量，同样，在活细胞成像试验中以上因素需要根据试验需要进行配置。在活细胞成像试验中还应用了各种滤色片及反光镜，它们的作用是调整从照明器经显微镜到检测器中光的波长。在透射光系统中这些增称光学组件包括起偏器，棱镜（DIC），聚光镜环，相差环等。在透射光成像系统中，如明视野，DIC，相差等，光的强度要比荧光大得多，所以，为了提高信噪比，需要在光路中添加一些组件。其中首要考虑的是过滤金属卤素灯的紫外及红外波段的光以保护样品。红外线产生的热效应会损害细胞活性，并会降低红外敏感CCD 成像的信噪比。紫外线很少出现在透射光源中，为了阻止这些波长范围的光，只需添加绿光片或红光片即可。红外及可见光滤光片都会显著降低光强，所以在成像时需要增加曝光时间及增益以保证适宜的信噪比。在荧光成像中，为了保证激发光及发射光的波长在适宜的范围内，会在光路中添加滤光片及半透半反滤光片。在相对光强较低的荧光成像中，选择滤光片首要考虑的是它是否能提供适宜的信噪比。大多数情况下，光会不分波长大量的通过光学组件以至于掩盖了荧光染料发出的信号，这时带通滤色片就显得非常重要。通常这中窄波段的滤色片会限制绝大部分光透过，所以，为了得到满意的图片，研究人员必需选择适宜带宽的滤色片。现在，市场上有很多厂商提供特制的带通滤色片及半透半反滤色片组合。在为活细胞成像选择滤片组时，为了得到好的信噪比，所选的组合要最接近荧光子的光谱性质。例如，选择标准的多色荧光成像FITC 滤色片组专门为进行YFP成像时，就不需要为了提高信噪比而滤掉部分YFP 范围内的光(Figure7(a))。在这种情况下，选择符合YFP 吸收及发射波段的带通激发光滤色片及长通发射光滤色片会得到最佳的效果。   再举一个两个荧光蛋白衍生物波段的选择实例（Figure7）。图中上部为YFP 的变种Venus 的激发及吸收光谱，它配合FITC 滤片组及宽波段发射光光谱以达到最好的信号收集效果。发射光滤色片的选择与检测器收集的信号直接相关，而上述组合显然不如宽带通YFP 组和收集的信号多。 同样的，TRITC 滤片组(Figure7(c))在mCherry 荧光蛋白的激发波段不如TexasRed 滤片组(Figure7(d))效率高。另外，TexasRed 滤片组的发射光波段更宽，允许检测器收集更多的信号。所以，在为活细胞成像选择荧光基团时需要配合滤片组合一起考虑，以保证得到最佳的激发及发射信号。现在有更多的带宽组合可供多色荧光标记同时成像。另外还需要考虑的是在显微镜光学组件中添加中性密度滤色片来降低激发及发射强度——这在活细胞成像中是重要的，如同阻挡或减少紫外，红外线的细胞光毒性。这些滤色片通常放在显微镜光源接口处，并可以随时取出以增加光强。通过显微镜的光强及数值孔径可以通过聚光镜或落射照明器的孔径光阑及视场光阑进行调节。 检测器几何形状与光学分辨率间的匹配由于样品有检测器成像，图像的空间分辨率取决于光学系统的分辨率。因为CCD 的检测器有一列光电二极管组成，每个都有固定的尺寸，所以，每个像素的几何学特性限制了图像的最终的分辨率。为了达到显微镜的分辨率，检测器的尺寸要符合Nyquist 抽样标准——2.5-3pixels/Airydiskunit。举个例子，对于光学分辨极限250nm，图像最终的像素大小应接近80-100nm。对活细胞成像来说，信噪比要比空间分辨率更重要，所以最佳的成像方式为2pixels/Airydisk，这种方式不会对图像质量造成明显损害。降低每个像素与AiryUnit的比例会增加图像的亮度，并且可以使用更大的CCD 光电二极管，以累积更多的光电子。Figure8(a) 中描述的是应用高数值孔径物镜进行活细胞成像时Airydisk 与CCD 像素列阵的投射关系。列阵中每个像素大小为6μm。100x/N.A.1.4 的物镜投影在CCD表面上的像直径为20μm（Table1），因此，可以达到Nyquist抽样标准(3.3pixels/Airyunit)。在这样的采样频率下，有充足的空白可以进行2x2 的binning 处理。相对的相同数值孔径下60x 物镜的投影直径为12 μm，刚好低于Nyquist 的下限。另外，即使将数值孔径降到1.3，40x 物镜投影直径仍只有8.4μm ，需要连接放大接口才能达到Nyquist 分辨率标准。光电二极管列阵的像素尺寸可大可小以匹配显微镜的空间分辨率，而无需添加中间变倍体；或者可以配置一个特制的CCD 接口，这样的接口中包含了一系列棱镜系统。Figure8(b) 中显示的为2x2binning处理的原理图，列阵中包含16个像素。曝光后，CCD 收集的光电子将进行两次平行迁移，然后，串行寄存器上发生两次迁移，这样一个像素上将收集4个像素（2x2binning）的光电子，并将其传输到输出节点进行放大。4x4binning 的处理方式与此相同，在处理过程中收集列阵中16 个像素信号并在输出前进行放大，这样一来可以显著地增强信号，同时降低读出噪音。如前面讨论过的，binning 处理是活细胞成像中一个绝佳的弱信号收集方式，这种处理可以降低对低荧光表达量细胞的毒害。 实际上，由1.4数值孔径的物镜成的像，最终大小介于100-120nm 之间。将这样大小的信号一合适的物理尺寸转移到CCD 光电二极管中，需要考虑物镜的放大倍数。例如，要达到60x/1.4 物镜的最大分辨率，光电二极管不能大于6μm ——大小取决于放大倍数及分辨率。然而，对100x/1.4 的物镜来说，光电二极管最大可至10μm。因此可以很明显的看出，只有当CCD 的配合了适当的物镜，数字分辨率才会与光学分辨率相匹配。10μm光电二极管与100x 物镜组合生成的图片像素大小为100nm；当与60x物镜组合时生成的像素大小为167nm，这时；图片的分辨率会低一些。相比之下，6μm 光电二极管与60x 的物镜配合则是最佳的，但是当与100x物镜组合时，则会取样过度。这种情况下的取样过度会降低图像亮度，从而无法改善图像分辨率。从前面的讨论看来，似乎想要得到理想的分辨率就得为不同的物镜配不同的CCD。实际上，这种方法一点都不实际，所以，需要找到一个折衷的办法。在有些情况下，这个问题可以通过在CCD 与显微镜之间添加一个耦合器来消除物镜放大倍数造成的影响。例如，0.6x 的接口可以将100x 物镜的投影大小降低到60x 物镜的效果。通过售后经销商可以得到各种耦合器，可放大或缩小CCD 光电二极管上投影的大小。以上的建议中需要注意的是，这些组件添加或移除相对来说非常容易，最好不要把CCD 从显微镜接口处拿下来，以防灰尘或颗粒进入显微镜机体内或相机成像传感器上。清洁传感器是件非常困难的事，尤其是要彻底清除那上面的每一个灰尘及颗粒。 与显微镜光学分辨率相匹配的像素大小物镜（数值孔径）分辨率(μm)投影尺寸(μm)要求像素尺寸(μm)1x(0.04)6.96.93.5 2x(0.06)4.69.24.6 2x(0.10)2.85.62.8 4x(0.10)2.811.25.6 4x(0.12)2.39.24.6 4x(0.20)1.45.62.8 10x(0.25)1.111.05.5 10x(0.30)0.929.24.6 10x(0.45)0.616.13.0 20x(0.40)0.6913.86.9 20x(0.50)0.5511.05.5 20x(0.75)0.377.43.7 40x(0.65)0.4216.88.4 40x(0.75)0.3714.87.4 40x(0.95)0.2911.65.8 40x(1.00)0.2811.25.6 40x(1.30)0.218.44.2 60x(0.80)0.3420.410.2 60x(0.85)0.3219.29.6 60x(0.95)0.2917.48.7 60x(1.40)0.2012.06.0 100x(0.90)0.3131.015.5 100x(1.25)0.2222.011.0 100x(1.30)0.2121.010.5 100x(1.40)0.2020.010.0  Table1现在许多为荧光显微镜设计的CCD 的光电二极管大小在5-16μm 范围内，并可进行binning 处理。如上讨论，通过binning 处理，几个光电二极管上的信息倍整合到一个单元中，从而有效的增大像素尺寸。6-8μm 大小的光电二极管可匹配60x 的物镜，经过2x2binning 处理，可匹配100x 物镜。这中情况下，使用高透过性的物镜，可使100x 物镜下成像更加明亮。这样，100x 物镜下，bin2 下的图片几乎是60x 物镜下，bin1 图片亮度的二倍，而分辨率近似或高于bin1。当要求更高的敏感度时，使用60x 物镜进行2x2binning 处理可以增加图像亮度，这时对于活细胞成像来说，分辨率上的损失在可接受范围内。在一些实验中，例如大群细胞的同时成像，获得视野内更多的信息要比空间分辨率重要。在没有中间变倍体的情况下，CCD 的矩形传感器无法获取目镜视野内所有的信息，通常只有30-80% 左右，大小取决于芯片尺寸。如果要获取更大的图片，需要添加一个具缩小功能的耦合器（如前所述）。通常0.6x 的透镜就可以使整个视野内的图片投影到芯片上，但同时会降低一些分辨率。如果要保有图像分辨率，可以通过x-y扫描获取多张图片然后用软件进行拼接。光学显微镜上使用近紫外光源来获得最高分辨率。近紫外后，分辨力的顺序是蓝，绿，红。在大多数情况下，研究人员使用金属卤素灯产生的宽光谱进行照明，但是在活细胞成像中，照明光谱通常被滤色片控制在很窄的波段。可见光谱中部波长大约为550nm，人眼最敏感的绿色。Table1 中的分辨率就是在这个波长下测定的。所以在不同波长下，这些值是不同的。数值孔径也是重要因素，如表中所列，放大倍数相同的条件下，数值孔径越高，分辨率越高。 也许在活细胞成像中最关键的就是在获得最高光学分辨率的同时平衡试验中信号强度（降低放大倍数），分辨率（提高放大倍数）及细胞活性间的关系。研究人员还必需选择尽量少的透镜来配合光学放大及检测器像素尺寸。配合不同物镜（放大倍数及数值孔径）的各种类型的中间变倍体都可以购买得到，以满足弱光及高分辨率试验的要求。在选择物镜放大倍数时，必需严格遵守Nyquist 分辨率标准。每个像素不得大于分辨率极限的一半；由于显微镜中衍射极限，工作距离通常不能小于50nm。活细胞成像用标准物镜通常为10x 及40x 干镜，及40x， 60x，100x 油镜或水镜。经济的低放大倍数的干镜通常用来进行初步检测，比如找到细胞的位置，因此过高不需要光学矫正。然而浸润镜头则需要高数值孔径（油镜1.3-1,4，水镜1.2），及高光透过性。由于图片采集与视场中部，多以高平常物镜并没有多大意义，而同时这样的物镜昂贵并且光透性比其它物镜低。所有用于荧光成像的物镜都需要用荧光珠检验其点扩散函数。无论落射荧光还是透射光（DIC 及相差），单色冷CCD 是成像的最佳选择，这包括培养中的活细胞。在选择相机时需要考虑的是量子效率，噪音水平（暗电流及读出噪音），像素大小（及满肼容量），及扫描频率。为了减少光对样品的损害，当选择高敏感度的相机，即高量子效率，低噪音，大像素尺寸，和低扫描频率。因此，敏感度还需与分辨率（高分辨率，低像素尺寸）及显像率（高扫描频率）之间平衡。低扫描CCD 的帧速率通常不高，因此，除非样品的亮度极高，在低曝光条件下信噪比会很低。这些因素都限制了CCD 在高速成像中的应用（30帧/s），并是样品成像变得令人挫败。另外还需避免光漂白及光毒性，一些产品在拍摄时可以在细胞活性与亮度之间取得平衡。处于以上考虑，相机应无光闸，具帧转移或插值传感器，这样除了低速数字信号扫描外，可以持续地在录像速率下拍摄图像。在荧光探针亮度很低或量子产量很低等极弱光条件下，如果要求高速成像，可选择增益型或电子扩增型CCD。