临沂大学实验教学教案

临沂大学实验教学教案所属学院生命科学学院课程名称微生物学实验课程类型（本科/高职）本科适用专业生物科学、生物技术临沂大学生命科学学院微生物学课程组生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验一微生物学试验常用玻璃仪器洗涤及干热灭菌实验目的1.认识微生物实验所需要的各种器皿，了解常用工具和仪器的名称、用途。2.掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干热灭菌的操作过程。实验原理1.微生物学实验要求较高的无菌状态，因此，实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌从而用以培养微生物，所以对其质量、规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。2.清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌实验材料1．培养皿、大试管、三角瓶6只、烧杯（500ml）2只、烧杯（1000ml）1只、小试管6只、吸管（0.2ml2支，0.5ml2支，1ml2支，5ml2支）共8支。2．去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷。3．棉花、扎绳、包扎纸。教学方法讲授式+讨论式+启发式教学实验内容步骤及时间安排实验内容与实验步骤时间第1章绪论1.仪器的认识、清洗与包扎（1）学习下列常用仪器的种类、规格和应用范围：①培养皿；②试管；③三角瓶；④烧杯；⑤吸管；⑥量筒。（2）学习玻璃器皿的洗涤方法（3）学习各种器皿的包扎2.干热灭菌操作1．装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。2．升温4学时接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。3．恒温当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。干热火菌过程，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。4．降温切断电源、自然降温。5．开箱取物待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。注意事项1.干热灭菌的温度不能超过180℃，否则引起包装纸或棉塞的着火。2.干热灭菌中物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。思考题1.通过本次实验你认识了微生物学实验常用的哪些器皿？2.简述玻璃器皿洗涤的基本要求。3.简述干热灭菌的操作步骤。生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验二培养基的制备和灭菌实验目的1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。2.学习并掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作技术。实验原理1.由人工方法配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质称为培养基。主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏或积累代谢产物等方面。2.高压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的高压蒸汽灭菌锅中进行的，通过加热，产生大量蒸汽使其中压力升高，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。实验材料1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂教学方法讲授式+讨论式+启发式教学实验内容步骤及时间安排实验内容与实验步骤时间1.牛肉膏蛋白胨培养基培养基的配制与分装(1)配方：NaCL0.5％、蛋白胨1％、牛肉膏0.3％，琼脂1.5-2.0％，pH7.4-7.6(使用10％NaOH和5％HCL调节)。(2)配制：称量及加热溶化----加琼脂----定容----调pH----分装、加塞、包扎。(3)分装:每组装3个三角瓶，150ml/瓶，包扎、灭菌。将剩余的250ml分装大试管（装量为试管长度的1/5），加棉球，包扎、灭菌。2.察氏一号培养基的配制与分装(1)配方：K2HPO40.1%MgSO4.7H2O0.05%FeSO40.001%（加3滴即可）KCL0.05%NaNO30.2%葡萄糖3%琼脂2%。(2)配制：称量及溶化----加琼脂----定容----分装、加塞、包扎(3)分装：平均分装在两个三角瓶中，包扎、灭菌。3.高压蒸汽灭菌(1)灭菌器内加入一定量水，将包扎好的物品放入其中。(2)接通电源，进行加热。(3)排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；（或关闭排气阀，待压力上升到4学时0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。）(4)当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。（对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。）(5)灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。注意事项1.湿热灭菌时一定要排净空气，湿热灭菌时间维持20-30min。2.要严格按配方配制。思考题1.你所作的培养基是否有异常现象出现？试分析其原因。2.培养微生物的培养基应具备哪些条件？能否以这次试验的方法配制其他培养基？3.高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验三环境和人体微生物的检验及无菌操作技术实验目的1.掌握从土壤中分离微生物的方法，通过检测环境和人体中微生物的存在，体会微生物分布的广泛性。2.学习无菌操作的技术，掌握平板划线分离微生物的方法。实验原理1.自然环境中和人及动物的体表、体内都存在大量的微生物，它们一遇到适合的条件就会大量繁殖。当把取自不同来源的含菌样品接种于含有生长发育需要的各种营养成分的固体培养基时，就会形成肉眼可见的微生物集体群落-菌落。2.每种微生物菌落都有其独有的特点，如大小、颜色、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑、边缘整齐或不整齐等。因此，可以通过平板培养来检测不同环境下微生物的数量、种类和特点。。实验材料1.恒温培养箱、磁力搅拌器、移液枪2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、察氏一号培养基；地面以下5-10cm的土壤；3.酒精灯、无菌棉棒、无菌生理盐水、涂布棒、记号笔、培养皿、吸管、试管、三角瓶教学方法讲授式+讨论式+启发式教学实验内容步骤及时间安排实验内容与实验步骤时间1.无菌操作技术-倒平板在酒精灯火焰旁操作，将融化并冷却至不烫手的灭菌固体培养基倒入无菌的培养皿，倒量为容积的1/3~1/2或者覆盖皿底5毫米左右，然后平放到桌面待其凝固即为无菌平板。2.HYPERLINK"file:///E:\\微生物精品课程建设\\实验课件\\土壤稀释分离.wmv"\t"_parent"土样的稀释分离HYPERLINK"file:///E:\\微生物精品课程建设\\实验课件\\土壤稀释分离.wmv"\t"_parent"（1）制备土样悬浊液（2）稀释3.环境及人体各部位取菌样（1）口腔:将无菌平板打开适度开口，嘴对着开口咳嗽3-5次，使口腔中的微生物接种到平板中，将皿盖合上，放在桌面即可。（2）鼻腔：取一支无菌棉棒，放入无菌生理盐水中沾湿后，插入到鼻孔中转动一周，取出，在无菌平板上划线接种，取出棉棒，合上皿盖。（3）头发：将皿盖打开，轻拍头发，使头发中的微生物降落到平板表面，合上皿盖。4学时（4）空气：选好地点后，打开皿盖，手托住平板，静止5分钟，使空气中的微生物自然降落到平板表面，合上皿盖。（5）10-5、10-6的土壤稀释液：无菌移液枪分别取0.2ml，无菌操作加到两种平板上，每个稀释度做两套平板）。4.标记、培养将接种的平板分别放入细菌和霉菌培养箱中培养。霉菌保持25-27℃，3-5天；细菌35-37℃，1-2天。注意事项1.培养时要将平板反过来进行培养，以避免冷凝水的浸扰。2.将土壤浊液进行稀释的是为了在计数时能够准确计数。思考题1.无菌倒平板时注意的事项有哪些？2.平板接种后为什么要倒置培养？3.通过本次试验你学到了什么？有什么体会？生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验四微生物菌落的观察和细菌的运动性观察实验目的1.学会观察、识别各种不同的微生物菌落的方法。2.掌握平板菌落计数的方法，运用所学的知识详细的描述所分离平板上的各种微生物菌落。3.了解普通光学显微镜的构造和原理，熟悉其使用的正确方法。4.学习并掌握油镜的使用方法，学会用压滴法或悬滴法观察细菌运动性的基本技术。实验原理1.不同的微生物在平板上形成不同的菌落特征，可以通过观察、平板上形成的各种菌落来判断、识别不同的微生物。2.根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征而的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。实验材料1.恒温培养箱、培养皿、吸管、试管、三角瓶2.实验三所作的平板培养物：A，在细菌培养基上生长的各种菌落；B，在霉菌培养基上生长的各种菌落。3实验二所作的试管斜面，酒精灯、接种环等。菌种：大肠杆菌E.coli，枯草杆菌B.subtilis教学方法讲授式+讨论式+启发式教学实验内容步骤及时间安排实验内容与实验步骤时间1.观察描述菌落特征运用所掌握的各种微生物菌落的特点，观察、识别、描述所做样品的两个平板上的所有菌落,并将结果填入表.2.平板菌落计数计算结果时，常按下列从接种后的2个或3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。   （1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。   （2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜。选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。4学时计数方法:每克土壤的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数3.细菌运动性的观察（压滴法）：(1)制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。(2)取2～3环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%的美蓝水溶液，混匀。(3)用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。(4)镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。注意事项1.利用压滴法观察细菌的运动时，一定要先染色。2.如果温度过低或载玻片上有油污会影响细菌的运动性。3.油镜用后一定用二甲苯擦拭干净。思考题1.将观察到的菌落特征及平板菌落计数的结果填入相应表中。2.斜面接种要注意那些问题？3.分别绘出高倍镜和油镜下观察到的某细菌（如枯草芽胞杆菌）的基本形态。（选做）4.试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的?如果没有运动分析原因。生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验五细菌的单染色和革兰氏染色实验目的1.学习对细菌的涂片、染色和无菌操作技术。2.了解染色原理、学习并掌握单染色和革兰氏染色技术。实验原理1.细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，染色后，菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。2.由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同。G+菌，肽聚糖多，脂质少，酒精不易进入；G-菌，肽聚糖少，脂质多，酒精易进入实验材料1.菌种：E.coli（大肠杆菌）、B.subtilis（枯草芽孢杆菌）等2.试剂：石炭酸复红染色液、革兰氏染色液(草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄染色液）3.其他：显微镜、载玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、吸水纸、擦镜纸等教学方法讲授式+讨论式+启发式教学实验内容步骤及时间安排实验内容与实验步骤时间1.单染色法：滴无菌水→涂片→自然干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检（高倍镜、油镜）2.革兰氏（Gram）染色法（1）涂片（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-1.5分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。（3）媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。（5）复染：滴加番红染色液，染1-1.5分钟，水洗后用吸水纸吸干。（6）镜检：观察染色结果并绘图。4学时注意事项1.脱色时间不要过长，也不能过短，否则染色结果不准确。2.染液要现用现配。思考题1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2.涂片用的玻璃片为什么不得有油污？为什么涂片要求菌膜要均匀、薄？3.革兰氏染色的原理、依据是什么？生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验六微生物的计数、大小的测定和酵母菌的死活鉴别实验目的1.学习并掌握利用显微镜直接计数的基本方法。2.了解并掌握酵母菌的死活鉴别染色的原理和技术。3.了解测微尺的构造和使用，学习并掌握测定微生物细胞大小的方法。实验原理1.利用血球计数板，在显微镜下进行计数，由于计数室的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。2.美兰（氧化型呈蓝色，还原型呈无色），活的酵母菌具有将氧化型美兰还原成还原型的能力，故染色后是透明的，而死的酵母菌则被染成了蓝色。3.计数方法：计数时，通常数五个（或四个）中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数实验材料1.菌种1%酵母菌悬液（市售的干酵母粉）2.试剂0.1%的美蓝染色液3.其它用具目镜测微尺，物镜测微尺、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、血球计数板、盖玻片、吸水纸显微镜、接种环、分类计数器教学方法讲授式+讨论式+启发式教学实验内容步骤及时间安排实验内容与实验步骤时间1.制备菌悬液、染色用吸管吸取菌悬液（1滴）加入试管，用生理盐水（8滴）进行稀释，滴加（1滴）美兰染色液。2.加菌悬液样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液（注意一定不要有溢出和产生气泡）。3.显微镜计数加样后静止1min，先用低倍镜然后换成高倍镜，计数时，对位于线上酵母菌，一般只数上方和左边线上的，当酵母菌芽体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。4.清洗血球计数板计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。4学时5.计算利用相应公式进行计算（见前面公式或者课本公式），并将实验结果填入作业中的表格内。注意事项1.要正确使用显微镜，光线亮度要调的合适。2.菌液制备要精准，稀释倍数要合适。如果浓度过大就再稀释，如果过小再重做。3.计上不计下，计左不计右。出芽计一半4.浓度稀释标准：以每小方格内含有5-10个酵母细胞为宜，一般稀释10倍即可。5.计数室内一定不要有溢出和产生气泡。6.其他微生物孢子技术与酵母菌类似，基本操作一样。7.确保血球计数板清洗干净。思考题1.使用血球计数板计数时，应注意什么？2.将计数结果填入表格中。3.简单说明酵母菌死活染色的原理。4.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正。生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验七食用菌母种的分离及转管技术实验目的l．掌握了解食用菌组织分离的方法和实际操作技术；2．明确食用菌组织分离在食用菌生产中的重要性。实验原理1.用子实体的某一部分来分离菌种的方法，称为组织分离法。组织分离法简便，后代不易发生变异，能保持原菌株的优良特性。组织分离法是利用菇类组织块能再生成菌丝的特性获得纯种的一种简捷方法，是野外采集菌种和食用菌栽培中防止品性退化，保持优良品种特性常用的一种手段。此法适宜多数食用菌，是野外工作者和种菇专业户必须掌握的一种方法。2.在食用菌生产中，采用组织分离的方法繁殖母种是大多数菌类普遍采用的方法。而组织分离成功与否是与种菇子实体的选择、分离过程中的操作方法等分不开的，这直接关系到所繁菌种的优劣。因此食用菌组织分离是食用菌生产中的重要环节之一。3.钩悬法是一种特别适用于耳类，也适用于伞菌类的多孢分离法。4.孢子印分离法  取成熟子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在20～24℃静置一天，大量孢子落下形成孢子印，接种环沾少量孢子在试管培养基上划线培养。实验材料l．培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。2.仪器或其他用具：高压灭菌锅，超净工作台，酒精灯，接种刀，以及培养箱、冰箱等。3.实验材料：平菇、香菇、杏鲍菇较成熟的子实体，75%酒精，新洁尔灭消毒液等教学方法讲授式+讨论式+启发式教学+演示实验内容步骤及时间安实验内容与实验步骤时间排PDA培养基的配置配方：马铃薯浸粉； 5.0g/L；葡萄糖20.0g/L；琼脂 20.0g/L ；氯霉素0.1g/L。制法：称取40g溶于1L蒸馏水中，煮沸溶解。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。 种菇的选择选择无病虫害、典型、八成成熟的食用菌子实体。3.种菇消毒4学时在接种箱内，用镊子夹着燃烧的酒精棉球迅速擦拭菇体。或选用的子实体用0.1％开汞水或70％酒精表面消毒，用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。4.取接组织将菇体撕开，用无菌尖头镊在柄盖交界处取绿豆粒大组织，放入斜面培养基上。迅速塞上棉塞。或用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。培养取接组织的斜面试管放置于25℃的培养箱中培养。转管在菌丝长满斜面之前，菌丝生长最旺盛时，挑取菌丝进行转管扩繁。注意事项1.此法对于胶质的耳类及菇体较小较薄的菇类，如金针菇等不太适宜。2.此法应严格遵循无菌操作。3.子实体在升汞溶液中消毒时间应严格按规定时间进行，漂洗要迅速，否则子实体受损太大，影响效果。4.纯化菌丝长至斜面1/2时，挑尖丝转管，培养成再生母种。5.出菇试验将再生母种扩成原种、栽培种，使其出菇。看产量、质量、形态、长势、6.抗性如何，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。7.控制菌龄菌丝即将长满斜面（一般7～10天）终止培养。分别用于菌种保藏或繁衍原种。思考题1.如何避免因污染而造成的组织分离的失败？2.孢子分离的母种为何一定要做出菇试验？生命科学学院微生物学实验教学授课教案授课对象生物技术专业、生物科学专业本科教材名称《微生物学实验教程》咸洪泉、郭立忠主编，高等教育出版社，2010.9实验项目实验八酸奶制作与乳酸菌链球菌的鉴别实验目的1.鲜奶酸败的原因2.学习乳酸发酵的原理和制作酸乳的方法。3.了解乳酸菌的形态和生长特性实验原理1.牛奶中的乳糖-----乳酸菌、嗜热热链球菌、双歧杆菌发酵--变性凝固--奶液呈凝乳状态--形成酸奶特有的香味和风味（与形成乙醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸等有关）实验材料1.全脂奶粉或鲜奶、白砂糖2.酸奶菌种：从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离的乳酸菌种3.其他器材:恒温水浴锅、pH计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸奶瓶(250ml)或一次性口杯等。教学方法讲授式+讨论式+启发式教学实验内容步骤及时间安排实验内容与实验步骤时间1.配方：市售牛奶500ml倒入小锅中，加入25g砂糖，摇匀，盖上盖。本次实验：500ml/每组2.消毒灭菌：一次性口杯、吸管、大勺子等先灭菌处理把小锅置于80℃恒温水浴锅中，乳要完全泡在80℃的水中，不时摇动，保持15min。3.接种：将消毒后的牛奶迅速降温至45℃以下，以5%～10%的接种量将发酵剂（市售酸乳）加入原料乳中。4.分装、封口、发酵：100ml/酸奶瓶或一次性口杯，封口后置40℃～42℃保温发酵3～6h。当酸奶已达到凝固状态（pH达4.2～4.3）时停止发酵。5.冷却后熟：将酸奶置于4℃～6℃的条件下冷藏24h。6.取出进行品尝并检测pH。7.显微镜下观察乳酸菌链球菌的制片，初步鉴定其特征。4学时注意事项1.酸牛乳的感官指标。思考题1.分析两个发酵周期的生理变化；2.总结酸奶的制作方法，并写出品尝体会与实验心得。3.画出所作样品染色片中所观察到的菌种.（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）