GBT 14926.46-2008 实验动物 钩端螺旋体检测方法
ICS65.020.30
B44
囝宦
中华人民共和国国家标准
GB/T14926.46—2008
代替GB/T14926.462001
实验动物 钩端螺旋体检测方法
Laboratoryanimal--MethodforexaminationofLeptospiraspp.
2008-12-03发布 2009—03—01实施
宰瞀粥紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会议19
刖 罱
GB/T14926.46—2008
GB/T14926《实验动物》共54个部分,为不同微生物和病毒检测技术方法。
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ICS65.020.30
B44
囝宦
中华人民共和国国家
GB/T14926.46—2008
代替GB/T14926.462001
实验动物 钩端螺旋体检测方法
Laboratoryanimal--MethodforexaminationofLeptospiraspp.
2008-12-03发布 2009—03—01实施
宰瞀粥紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会议19
刖 罱
GB/T14926.46—2008
GB/T14926《实验动物》共54个部分,为不同微生物和病毒检测技术方法。
本部分自实施之日起代替GB/T14926.46—2001《实验动物钩端螺旋体检测方法》。
本部分与GB/T14926.46—200l相比主要技术差异如下:
a) 原理部分增加显微镜凝集试验原理;
b)原标准中“6.1试管凝集实验”修改为“显微镜凝集实验”;“6.1.2.2表1钩端螺旋体定量
显凝试验操作方法”更改为“钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法”;
c) 修改原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的
;
d)在原标准中增加了“7结果判定”。
本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。
本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。
本部分主要起草人:范薇、田克恭、贺争鸣。
本部分所代替标准历次版本发布情况为:
——GB/T14926.46—2001。
实验动物 钩端螺旋体检测方法
GB/T14926.46—2008
1范围
GB/T14926的本部分规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法。
本部分适用于犬钩端螺旋体的检测。
2
性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文
件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成
协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本
部分。
GB/T14926.42实验动物细菌学检测标本采集
GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂
GB/T14926.50实验动物酶联免疫吸附试验
3原理
钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇,在适宜的电解质存在下发生凝集现象,此种凝集一般须用
暗视野显微镜检查。
钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合,形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保
持其抗原活性,可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应,产生有色物质。
颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。
4主要设备和材料
4.1普通恒温培养箱。
4.2实体显微镜。
4.3恒温水浴箱。
4.4高速离心机。
4.5超声波细胞粉碎器。
4.6酶标仪。
4.7微量加样器,容量5pL~50pL和50pLy200pL。
5培养基及试剂
5.1犬型钩端螺旋体标准抗原。
5.2标准阳性血清。
5.3标准阴性血清。
5.4生理盐水。
5.5显微镜凝集抗原:各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基,28℃培养5d~7d。取样作暗视
野显微镜检查,每400倍视野不少于50条,运动活泼并无自凝现象者,可作为抗原。
5.6 ELISA抗原
5.6.1钩端螺旋体培养:各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基,28℃培养5d~7d。
】
GB/T14926.46—2008
5.6.2生长良好的培养物用10000r/min离心30min,沉淀用PBS在相同条件下洗2次。
5.6.3上述沉淀用PBS悬浮,超声波打碎后,10000r/min离心20rain,上清即为ELISA抗原。
5.7酶结合物:辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬IgG抗体,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)。
5.8阳性血清:钩端螺旋体免疫SPF犬所获得的血清,或自然感染犬后所获得的血清。
5.9阴性血清:无钩端螺旋体感染犬血清。
5.10培养基和试剂溶液的配制:参照GB/T14926.43和GB/T14926.50执行。
6检测方法
6.1显微镜凝集实验
6.1.1检测程序
检测程序见图1。
图1检测程序
6.1.2操作步骤
6.1.2.1采样
采血、分离血清。采样方法参照GB/T14926.42执行。
6.1.2.2血清稀释
参照表1进行。
表1 钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法
凹孔板编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1l 12
生理盐水/mL 0.16 0.1 O.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
待检血清/mL 0.04/0.1夕0.1夕0.1,0.1夕0.1夕0.1/0.1夕0.1≯ 弃去 0.1
阴性血清/mL 0.1
阳性血清/mL 0.1
标准抗原/mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0 1 0.1 0.1 0.1 O.1
血清最终稀释度 1/10 1/Z0 1/40 1/80 1/1601/320l/6401/12801/Z560
GB/T14926.46—2008
6.1.2.2.1待检血清灭活:将待检血清以56℃水浴灭活30rain后备用。
6.1.2.2.2取96孔板,第1孔加人生理盐水0.16mL,以后每孔加入生理盐水0.1mL,一直加到
第9孔。
6.1.2.2.3在第1孔中加入血清0.04mL,混匀后,吸取o.1mL到第2孔,如此类推,直到第9孔,弃
去0.1mL。
6.1.2.3对照
另标明10、11、12孔,第10孔加人阴性血清0.1mL,第11孔加入阳性血清0.1mL,第12孔加人
生理盐水0.1mL。
6.1.2.4加入抗原
将各孔加入标准抗原0.1mL,混匀,此时各孔血清稀释度为1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,
1:320,1:640,1:1280,1:2560。具体操作见表1。置37℃温箱2h,取出后摇匀,用接种环挑取
各孔中的反应物置于载玻片上,在暗视野下观察结果。
6.1.2.5结果判定
结果判定如下:
a)++++:几乎全部钩端螺旋体呈蝌蚪状或折光率高的团块,或有大小不等的点状或块状残
片,仅有少数游离的钩端螺旋体;
b) +++:75%的钩端螺旋体被凝集,大部分呈块状或蜘蛛状,尚有25%菌体游离;
c)++:50%左右的钩端螺旋体被凝集,尚有50%菌体游离;
d) +:25%左右的钩端螺旋体被凝集,尚有75%菌体游离;
e) 一:全部菌体正常,分散,无凝集块,菌数与对照相同。
待检血清凝集效价在1:20达到“++”或以上时,均判为阳性反应。
6.2酶联免疫吸附试验(ELISA)
6.2.1包被抗原
根据滴定的最适工作浓度,将抗原用包被液稀释。每孔100pL,置37℃1h后再4℃过夜。
6.2.2用洗涤液洗3次,每次5rain,叩干。
6.2.3加样
待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1:160稀释,每孔100pL,37℃1h,洗涤同上。
6.2.4加酶结合物
用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度,每孔加入100pL,37℃1h,洗涤同上。
6.2.5加底物溶液
每孔加入新配制的底物溶液100pL,置37℃,避光显色10min~15min。
6.2.6终止反应
每孔加人终止液50“L。
6.2.7测A值
在酶标仪上,于490nm处读出各孔A值。
6.2.8结果判定
在阴性和阳性血清对照成立的条件下,进行结果判定。
6.2.8.1同时符合下列2个条件者,判为阳性:
a)待检血清的A值大于等于0.2;
b) 待检血清的A值/阴性对照血清的A值大于等于2.1。
6.2.8.2均不符合上述2个条件者,判为阴性。
6.2.8.3仅有1条符合者,判为可疑,需重试。如仍为阳性则判为阳性。
6.2.8.4对阳性结果需重试,如仍为阳性则判为阳性。
GB/T14926.46—2008
7结果判定
7.1基础级犬
如接种疫苗后,经ELISA检测抗体效价大于等于1:160,或显微镜凝集检测抗体效价大于等于
1:20判为合格。被检动物免疫抗体合格率大于等于70%可判为该犬群免疫合格。
免疫抗体合格率一(被检动物抗体阳性数/被检动物总数)X100%
7.2 SPF级犬
不应进行疫苗接种,或未进行免疫的基础级犬,对阳性检测结果,选用同一种方法或另一种方法重
试。如仍为阳性则判为阳性。
8结果
根据判定结果,作出报告。
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