马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量测定方法研究

Nov. 2011，Vol.8 No.11 马来酸噻吗洛尔是一种非选择性 β 肾上腺能受体阻 断药，无明显的内源性拟交感活性和局麻作用，对心肌无 直接抑制作用。其滴眼液对高眼压患者和正常人均有降低 眼内压作用。其处方中所含的羟苯乙酯为抑菌剂，其用量 过大会对眼组织产生较大的刺激，因此，我们为进一步控 制本品的质量，建立了抑菌剂羟苯乙酯高效液相色谱法 （High-performance Liquid Chromatography，HPLC）含量测定 方法。通过方法学研究，结果该方法简便、灵敏、准确，重 现性好，可用于本品羟苯乙酯的质量控制 。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公 司；ESJ180-4 型电子分析天平，龙腾电子科技有限公司； 7530G 紫外可见分光光度计，上海分析仪器有限公司；迪 马 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱。 1.2 试剂 乙腈(上海陆都化学试剂厂，色谱纯，批号：20081118)； 水为二级反渗透水再经多效蒸馏水机蒸馏制得；羟苯乙 酯对照品（批号：100847-200501）由中国药品生物制品检 定所提供；马来酸噻吗洛尔滴眼液（批号为：070103， 080501，080502，080503） 由江西珍视明药业有限公司生 产；阴性溶液由江西珍视明药业有限公司生产。 2 方法与结果 2.1 色谱条件及测定方法 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈 ∶水（40 ∶ 作者简介:辛继跃，男，工程师。研究方向：药品研发与注册。E-mail：xinjiyue1959@163.com 马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量测定方法研究 辛继跃 朱样根 危雪晖 黄志元 （江西珍视明药业有限公司，江西 抚州 344000） 【摘要 】 目的 ：用高效液相色谱法测定马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯的含量。方法 ：用十八烷基硅烷 键合硅胶为填充剂；以乙腈 ∶水（40 ∶60）为流动相；流速为 1 mL/min；检测波长为 254 nm；进样量为 20 μL。 结果 ：羟苯乙酯在 3.048 ~ 24.384 μg/mL 范围内呈线性关系，Y = 125.417 3X－23.462 2，r = 0.999 9；回收 率为 99.8%，RSD = 0.66%。结论 ：该法操作简便，快速、准确、灵敏度高，重复性好，可用于马来酸噻吗洛尔 滴眼液中羟苯乙酯的含量测定。 【关键词 】 高效液相色谱法；羟苯乙酯；马来酸噻吗洛尔滴眼液；含量测定 The Study on the Content Determination of Ethylparaben in Timolol Maleate Eye Drops Xin Jiyue，Zhu Yanggen，Wei Xuehui，Huang Zhiyuan (Jiangxi Zhenshiming Pharmaceutical Co.，Ltd，Jiangxi Fuzhou 344000，China) ABSTRACT Objective: To determine the content of ethylparaben in the timolol maleate eye drops by HPLC. Methods: 18 alkyl silane bonding silica gel was taken as the filling agent; the mobile phase was acetonitrile： water (40 ∶60)；the flow rate was 1.0 mL/min；the detection wavelength was at 254 nm；the injection volume was 20 μL. Results：Calibration curves of ethylparaben ranging from 3.048 ～ 24.384 μg/mL had a good linearity (Y = 125.417 3X－23.462 2，r = 0.999 9). The recovery was 99.8% (RSD = 0.66%). Conclusion：The method is simple， fast， and accurate with high sensitivity and good repeatability. It can be used for the content determination of ethylparaben in the timolol maleate eye drops. KEY WORDS HPLC；Ethylparaben；Timolol Maleate Eye Drops；Content Determination 33 中国执业药师· 60）为流动相；流速为 1 mL/min；检测波长为 254 nm；进样 量为 20 μL。 取羟苯乙酯对照品适量，精密称定，用水稀释成每毫 升含羟苯乙酯 12 μg 的溶液作为对照品溶液；精密量取样 品溶液 1 mL，置 25 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀， 作为供试品溶液；分别吸取对照品溶液和供试品溶液 20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，计算，即得。 2.2 方法学研究 2.2.1 流动相的选择 参照文献 [1]用流动相组成为乙腈 ∶ 水（25 ∶75），结果羟苯乙酯的保留时间较长 (48 min 左右) 不利于含量测定。调整流动相的比例为乙腈∶水（40 ∶ 60），结 果羟苯乙酯的保留时间为 12 min 左右，色谱峰分离理想， 峰形良好，可满足本品羟苯乙酯含量测定的需要。 2.2.2 测定波长的选择 取羟苯乙酯适量，精密称定，加 乙醇定量稀释成每 1 mL含羟苯乙酯 5 μg的溶液，在 220 ~ 400 nm 范围内扫描，该样品在 257.4 nm 波长处有最大吸 收；另取羟苯乙酯适量，精密称定，加水定量稀释成每 1 mL 含羟苯乙酯 6 μg 的溶液，在 220 ~ 400 nm 范围内扫描， 该样品分别在 255.2、255.8、256.4 nm 波长处有最大吸收。 而文献[2]选择 254 nm作为测定波长，综合考虑系统误差原 因，确定 254 nm 波长作为检测波长。 2.2.3 处方成分的干扰考察 ①按处方量配制除羟苯乙酯外的溶液作为阴性溶液。 ②取羟苯乙酯对照品适量，精密称定，用水稀释成每毫升 含对羟基苯甲酸乙酯 12 μg 的溶液作为对照品溶液。 ③精密量取阴性溶液 1 mL，置 25 mL 量瓶中，加水稀 释至刻度，摇匀，作为空白供试品溶液。 取②、③项下两种溶液分别取 20 μL 注入液相色谱 仪，记录色谱图，结果明阴性溶液对羟苯乙酯含量测定 无干扰，见图 1 ~ 3。 2.2.4 线性试验 精密称取羟苯乙酯对照品 30.48 mg， 加适量水加热溶解后，冷却，移至 100 mL 量瓶中，加水稀 释至刻度，摇匀，作为储备液；取该储备液，分别稀释成 3.048、6.096、12.192、18.288、24.384 μg/mL的溶液，取 20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，相应的 峰面积为纵坐标，进行线行回归得回归方程为：Y = 125.417 3X－23.462 2，r = 0.999 9，结果表明该法线性关 系良好。结果见表 1。 2.2.5 精密度试验 精密吸取按 2.1 测定法项下配制的 对照品溶液 20 μL 注入液相色谱仪，连续进样 5 针，测定 其峰面积，结果见表 2。 2.2.6 重复性试验 取 070103 批样品，按供试品制备方 法制备 5 份供试品，依法测定，计算羟苯乙酯的含量，结 果见表 3。 图 1 阴性溶液 HPLC 色谱图 图 2 羟苯乙酯对照溶液 HPLC 色谱图 图 3 马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯对照溶液 HPLC 色谱图 浓度（μg/mL） 3.048 6.096 12.192 18.288 24.38 峰面积 376.2 723.9 1 495.8 2 280.5 3 034.0 表 1 线性试验结果 表 2 精密度试验结果（RSD=0.74%） 次数 1 2 3 4 5 峰面积 1 474.3 1 475.5 1 479.5 1 480.2 1 501.1 质量控制 34 Nov. 2011，Vol.8 No.11 表 3 重复性试验结果（RSD=0.36%） 次数 1 2 3 4 5 含量(%) 96.6 96.6 97.4 96.6 96.8 2.2.7 耐用性试验 2.2.7.1 调柱温 分别将柱温调至 20、25、30℃，然后分 别测定 070103 批马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含 量，结果见表 4。 2.2.7.2 调流速 分别将流动相流速调为 0.8、1.0、1.2 mL/min， 然后分别测定 070103 批马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙 酯含量，结果见表 5。 2.2.7.3 调流动相比例 分别将流动相比例调为乙腈 ∶ 水 =35 ∶65、乙腈:水 = 40 ∶60、乙腈 ∶水 =45 ∶55，然后分别测定 070103 批马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量，结果 见表 6。 综上所述，耐用性试验结果表明，在流动相比例小幅 改变、柱温及流速等有所改变的情况下，羟苯乙酯色谱峰 仅是出峰时间略有差异，所测得的含量无明显差异，即色 谱条件的改变并不影响马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙 酯含量测定。 2.2.8 待测溶液稳定性 取供试品溶液，分别于 0、2、4、 6、8、24 h 吸取 20 μL，连续进样 6 次，检测其峰面积。结果 表明，供试品在 24 小时内稳定。 结果见表 7。 2.2.9 回收率试验 取处方量原辅料，加水制成处方浓 度的不含羟苯乙酯的空白溶液，按 80%、100%、120%比例 分别加入羟苯乙酯对照，加入稀释成约 9.69、12.01、14.47μg/mL 的溶液各 3份，精密吸取 20 μL 进样，计算回收率。回收率 试验表明，本法回收率良好。结果见表 8。 综上所述，方法学研究试验结果表明，该法可以准确 测定马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量。 2.3 样品含量测定 测定常温留样 36 个月三批样品 （批号：080501， 080502，080503）羟苯乙酯含量，结果见表 9。 3 讨论 滴眼剂的处方工艺设计要求考虑无菌度的保持。一般 滴眼剂常为多剂量给药形式，在使用过程中无法始终保持 无菌，抑菌剂的加入是必要和重要的。《中国医院制剂规 范》[4]指出羟苯乙酯的抑菌浓度为 0.02% ~ 0.08%，即每 1 000 mL中溶入 0.2 g 羟苯乙酯可达到抑菌效果。表 2 可 见，所测样品的羟苯乙酯含量均在有效抑菌浓度范围内。 本公司所研制及生产的马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙 酯处方量为 0.3 g (即含 0.03%)，根据研究结果将马来酸 噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量范围定为：0.024% ~ 0.036%，能够控制本品质量。 由于羟苯乙酯在水中几乎不溶，因此，在配制羟苯乙 酯对照品溶液时，用适量热水溶解并冷却后再稀释至规定 浓度较好。 参考文献： [1] 朱全刚，胡晋红，孙华君，等.3 种内服液体制剂中羟苯甲酯和 羟苯乙酯的含量测定[J].中国药房，2002，13 (9)：553-554. [2] 吴淑婷. 羟苯乙酯滴眼液质量的研究及其稳定性考察[J]. 首都医药，1998，5 (7)：15. [3] 潘学田.中国医院制剂规范[M].第 2版.北京：中国医药科技出 版社，1995：26. [4] 国家药典委员会.中国药典 2005年版(二部) [M].北京：化学工 业出版社，2005：42. （收稿日期：2011-07-27） 表 4 不同柱温条件下羟苯乙酯含量测定结果（RSD=0.32%） 柱温（℃） 20 25 30 含量(%) 96.5 95.9 96.1 表 5 不同流速条件下羟苯乙酯含量测定结果（RSD=0.06%） 流速（mL/min） 0.8 1.0 1.2 含量(%) 96.3 96.2 96.3 表 6 不同流动相比例条件下羟苯乙酯含量测定结果 （RSD = 0.21%） 流动相比例 （乙腈∶水） 35∶65 40∶60 45∶55 含量(%) 96.2 96.4 96.0 表 7 待测溶液稳定性试验结果 时间（h） 0 2 4 6 8 24 峰面积 1 676.10 1 649.10 1 651.70 1 661.60 1 663.60 1 670.50 取样次数 加入量（μg） 测得量（μg） 回收率(%) 平均值(%) RSD(%) 1 9.69 9.71 100.2 99.8 0.66 2 9.69 9.78 100.9 3 9.69 9.75 100.6 4 12.01 11.91 99.2 5 12.01 11.93 99.3 6 12.01 11.90 99.1 7 14.47 14.35 99.2 8 14.47 14.47 100.0 9 14.47 14.45 99.9 表 8 回收率试验结果 表 9 常温留样羟苯乙酯含量测定结果 批号 080501 080502 080503 含量(%) 99.7 99.1 100.2 35