DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤汇总

DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，需要用银染显示条带，但是找不到具体的配方和步骤，不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别，哪位师兄师姐有配方可否发一份，十分感谢！一、电泳试剂：1、30%聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。2、10%过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。3、TEMED4、5xTBETris27克，硼酸13.75克，0.5MEDTA(pH8.0)10ml，定容至500ml。二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。2、0.2%AgNO3:AgNO31克，水500ml。3、1.5%NaOH:NaOH7.5克，水500ml。4、37%甲醛。三、配胶(6%):30%聚丙烯酰胺(29:1)8ml，5xTBE8ml，定容至40ml，加10%过硫酸胺200ul;TEMED20ul。室温凝固时间＞1小时。四、银染：1、固定液固定10m。2、水洗2mx3次。3、0.2%AgNO3100ml+37%甲醛50ul，混匀，避光染色30〜50m。4、水洗20秒x2次。5、1.5%NaOH100ml，加37%甲醛0.5ml,混匀，显色3〜10m。6、水洗若干次，终止显色。电泳时间：150vx3h，溴酚兰的位置相当于40bp。银染后胶面积将膨胀10%。在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40X35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验测序凝胶的银染染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。固定凝胶：将凝胶（连玻璃板）放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没，充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜（不振荡）。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。凝胶显影：（1）.在显影溶液中加入甲醛（3ml）和硫代硫酸钠溶液（400卩以完成显影液的配制。（2）.从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注重，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长，可重复第五步用染色液浸泡。（3）.马上将凝胶转移至1升（总量的一半）预冷的显影液充分振荡直至带开始显现或开始出现第一批条带，把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟，或直至所有条带出现。固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应，固定凝胶。在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注重在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景（如纸）上观察凝胶，若需永久保存的记录，则可用EDF胶片保留实验结果。经验分享：（1）固定液：网上有好几种固定液的配制方法，我们采用的是10%的冰乙酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。可提前配制，室温放置。染色液：我们用的是0.1%的硝酸银溶液，加入3ml甲醛。硝酸银要现用现配，时间长了硝酸银会分解，一般在固定的时候配制，要有一段时间让硝酸银充分溶解。显影液：用10%碳酸钠，北化的质量就不错，完全不用买进口的，显影液要提前配制，放入4度冰箱预冷。这一步很重要，假如没有充分预冷，显色时很难控制显色时间，不是染过了导致背景很高，就是染的很浅。因此在固定前就要把显影液配好。在2L显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400卩以完成显影液的配制，这一步要在显影前加，不要提前加。原理忘记了，但是一般都是这样做的。甲醛将银离子还原为金属银，硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的，根据凝胶染色的效果决定。当时我是把甲醛调整为2.7ml，硫代硫酸钠改为420卩，两者作用不一样，所以调整的时候一个多，一个少，而且要微调。具体什么方向调整忘记了，需要摸索最合适的条件。也是比较重要的，即一定要分两次显色，第一次显色出现条带后马上转移至剩下的显影液中。显色时间第一次大概是5分钟左右，操作中一定要在边上看着。显色后马上放入终止液(10%的冰乙酸)中，两分钟后放入纯水中即可，两分中后取出即可。对我来说教训最为惨痛的，即显色时间的控制。第二次显色时不要等所有条带都出来后再终止，因为显色有一个延续效应。当时我染色时，忽然走神了，就走神5秒钟，胶全黄了，背景奇高。我两天的工作因为5秒钟全部over了，当时差点疯了。我的经验是：当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止，具体时间需要摸索，但一定要提前终止。再加一句：万一染色浅了是可以复染的，效果差不太多。十分感谢！顶下，不错求助：DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤aifuhong你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗？aifuhong你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗？