全国艾滋病检测技术规范

全国艾滋病检测技术规范NationalGuidelineforDetectionofHIV/AIDS（2015年修订版）中国疾病预防控制中心二○一五年十二月前言艾滋病在我国的流行已数十年，随着感染者和临床病人的不断增加、感染人群的变化，艾滋病检测工作量逐渐加大，对监测和检测的需求也不断增加，承担艾滋病检测的实验室已遍及全国各级医疗、疾病预防控制、采供血、妇幼保健机构，出入境检验检疫、军队等各个系统。为了尽早发现HIV感染者和艾滋病病人，及早提供咨询、治疗，同时为适应基层艾滋病检测工作需求，在新的形势下，根据《关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见》、《中国预防与控制艾滋病中长期规划（1998—2010年）》、《中国遏制与防治艾滋病十二五行动计划的通知（国办发[2012]4号）》、“四免一关怀”等国家艾滋病防治重要方针政策和十三五防治工作重点，在广泛征求各省、市疾病预防控制机构和医疗机构意见的基础上，在中华人民共和国卫生和计划生育委员会艾滋病专家及省级专家的参与下，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心对《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》进行修改、增补和完善，制定出《全国艾滋病检测技术规范（2015年版）》（以下简称《规范》），使其既能满足目前艾滋病检测工作的实际需求，又能体现检测技术的发展。本次《规范》修订工作立足于我国目前检测状况，结合发达国家使用的指南，主要对以下几个方面内容进行了修改、增补和完善：（1）完善了不同的检测策略，并将其整合为独立的一章；（2）增加了HIV-1新发感染检测一章；（3）新增了补充试验概念,其内容包括抗体确证试验（WB，RIBA/LIA等）和核酸试验（定性和定量试验）；（4）增加了第4代试剂（抗原抗体联合检测试剂）的检测；(5)增加了核酸检测流程；(6)完善了检测报告。将抗体筛查和复检报告整合为HIV抗体筛查检测报告，增加了HIV-1核酸检测报告和婴儿艾滋病病毒感染早期诊断检测报告，取消了流行病检测HIV抗体检测报告单、艾滋病病毒抗体检测数和阳性人数统计报表、艾滋病职业暴露个案登记表和艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表；（7）取消了实验室生物安全一章和艾滋病检测实验室质量管理一章。所有附表的检测报告仅供使用实验室参考。本《规范》由中国疾病预防控制中心批准,下发至全国艾滋病检测实验室及有关单位。本《规范》将为国家、相关部委下发的艾滋病防治工作各项政策法规的有效实施提供强有力的技术支持，并具体指导艾滋病实验室技术人员开展日常工作。本《规范》起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。本《规范》参加编写单位：中国人民解放军军事医学科学院、上海市疾病预防控制中心、中国医科大学、北京出入境检验检疫局、云南省疾病预防控制中心、四川省疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心、河南省疾病预防控制中心、北京市红十字血液中心、卫生部临床检验中心、江苏省疾病预防控制中心、陕西省疾病预防控制中心、安徽省疾病预防控制中心、首都医科大学附属北京佑安医院、北京市疾病预防控制中心。本《规范》编写组人员：蒋岩、汪宁、李敬云、钟平、尚红、邵一鸣、肖瑶、朱红、邢文革、姚均、潘品良、邱茂锋、马艳玲、梁姝、郭志宏、王哲、葛红卫、王盈、李金明、徐晓琴、常文辉、吴建军、张福杰、吴昊、苏雪丽、廖玲洁。本《规范》参加编写主要国际机构：世界卫生组织（Po-linCHAN、张岚）。美国疾病预防控制中心GAP项目（ColinShepard、郝玲、齐明山）。本《规范》编写工作联系人：肖瑶。本《规范》自发布之日起实施，同时终止《全国艾滋病检测技术规范(2009年版)》。本《规范》适用于全国艾滋病检测实验室。本《规范》解释权属于中国疾病预防控制中心。致谢：感谢盖茨基金会在《规范》修订过程中给予技术和人力等方面的支持。目录1第一章样品的采集和处理1范围12规范性文件引用13样品种类及相应的用途14操作步骤24.1采样前准备24.2样品的采集和处理24.3样品的保存44.4样品的运送44.5样品的接收5第二章HIV抗体检测61范围62规范性文件引用63HIV抗体检测实验室要求64HIV抗体检测的目的和要点64.1HIV抗体检测的目的64.2HIV抗体检测的要点75常规HIV抗体检测方法75.1试剂和样品75.2方法76结果报告96.1筛查报告96.2确证报告97质量控制107.1酶免或发光法抗体检测的室内质量控制107.2快速法抗体检测质控12第三章HIV-1新发感染检测141范围142规范性文件引用143新发感染检测实验室要求144目的145新发感染检测方法145.1方法学原理145.2方法155.3样品的入选标准和排除标准155.4结果处理和解释165.5数据分析176质量控制196.1人员培训196.2样品质控196.3试剂质控196.4实验过程质控20第四章HIV-1抗原检测211范围212规范性文件引用213HIV-1P24抗原检测的意义214实验室要求215检测方法及程序215.1试剂215.2样品215.3定性检测215.4定量检测235.5结果报告和解释236质量控制236.1定性检测236.2定量检测24第五章HIV核酸检测251范围252规范性文件引用253核酸检测的意义263.1HIV-1感染诊断263.2治疗效果监测263.3病程监控及预测263.4耐药性监测274HIV核酸检测实验室要求274.1实验室的及工作基本原则274.2实验室人员和要求274.3实验室生物安全275HIV-1核酸检测方法及程序275.1HIV-1核酸定性检测275.2HIV核酸定量检测285.3集合核酸定性检测305.4　HIV核酸即时检测316　质量保证和质量控制316.1实验室分区和环境316.2　仪器设备质量控制316.3检测过程质量控制316.4外部质量控制32第六章艾滋病病毒感染实验室检测策略331范围332规范性文件引用333疫情监测相关的检测策略及结果报告333.1　HIV匿名无关联检测流程333.2HIV实名关联检测流程344临床诊断相关的检测策略及结果报告344.1使用抗体检测试剂的筛查检测流程344.2使用抗原抗体检测试剂的筛查检测流程354.3补充试验检测策略375血液筛查相关的检测策略及结果报告406婴儿HIV-1感染早期诊断相关的检测策略及结果报告426.1核酸检测策略（RNA/DNA）及结果报告426.2抗体检测策略及结果报告44第七章HIV-1基因型耐药检测461范围462规范性文件引用463HIV-1基因型耐药检测的意义463.1群体耐药监测463.2个体耐药检测474HIV-1基因型耐药检测实验室要求474.1实验室功能分区474.2实验室人员和要求484.3设施和设备485HIV-1基因型耐药检测方法及程序485.1样品485.2检测原理485.3检测方法485.4耐药分析496质量保证与质量控制496.1室内质控506.2外部质控50第八章CD4+和CD8+T淋巴细胞检测511范围512规范性文件引用513CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的意义513.1HIV感染临床分期513.2HIV感染儿童免疫抑制分级和治疗辅助指标513.3疾病进展监测523.4机会性感染的风险评估523.5抗病毒治疗适应症选择及疗效评价523.6CD8+T淋巴细胞为抑制性/细胞毒性T细胞524CD4+和CD8+T淋巴细胞检测实验室要求524.1人员524.2功能分区534.3设施和设备535常规CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的方法和程序535.1样品采集、运输和接收535.2方法545.3试剂555.4实验资料的555.5结果报告556质量控制56第九章HIV-1的分离培养571范围572规范性文件引用573HIV-1分离的意义573.1HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断及诊断573.2HIV表型耐药检测及其他HIV生物学特征的研究573.3HIV感染的辅助诊断574实验室要求574.1实验室574.2设备574.3材料575HIV-1分离的方法及程序575.1样本575.2靶细胞制备575.3建立共培养585.4监测病毒生长585.5病毒鉴定585.6判定结果和解释586质量控制58附表1HIV抗体筛查检测报告59附表2HIV抗体确证检测报告60附表3HIV-1核酸检测报告61附表4HIV抗体确证检测报告（特定条件）62附表5CD4+T淋巴细胞检测报告63附表6HIV-1耐药基因型检测报告64附表7婴儿艾滋病病毒感染早期诊断检测报告65第一章样品的采集和处理1范围本章规定了用于人免疫缺陷病毒（HIV）检测的全血、血清、血浆、细胞、口腔黏膜渗出液、尿液以及滤纸干血斑（DBS）样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体、抗原、核酸、基因亚型、耐药检测、CD4+和CD8+T淋巴细胞数测定及HIV分离培养。2规范性文件引用《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》中华人民共和国卫生行业标准WS-293有效版本。《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量及保证指南》（中国疾病预防控制中心，2013年版）。《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》（中国疾病预防控制中心，2013年版）。《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》，（中国疾病预防控制中心，2013年版）。ConsolidatedGuidelinesonHIVTestingServices.WHOJuly2015.《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，卫生部第45号令,2006年2月1日。3样品种类及相应的用途3.1全血、血清、血浆、口腔黏膜渗出液、尿液以及干血斑样品可用于HIV抗体检测。3.2全血、血清、血浆、病毒培养上清液可用于HIV抗原检测。3.3抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。3.4血浆、DBS可用于HIV-1病毒载量、基因型、耐药检测。3.5淋巴细胞富集液、外周血单核淋巴细胞（PBMC）及全血可用于HIV核酸定性与定量、基因型检测和HIV-1分离培养。4操作步骤4.1采样前准备根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术要求操作，遵守生物安全相关要求。检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间及唯一编码。采集血液样本宜选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。口腔黏膜渗出液样本应使用试剂盒提供的专用采样工具，尿液样本建议使用可保持尿液稳定的专用采尿管。4.1.1样品的编码和记录4.1.2应制定样品编码的标准操作程序（SOP），规定样品编码的原则和方法，为样品制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。4.1.3采血前，先对试管或滤纸进行标记，核对后编码。要将标签贴在试管的侧面，推荐使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。干血斑滤纸应使用具有资质的产品。4.1.4口腔黏膜渗出液样本应采集口腔渗出液,不是唾液。4.1.5尿液样本准备好带有唯一编码的采尿管，并保留唯一编码。4.1.6应使用专门的样品记录本或登记表记录样品，同时录入电脑保存。4.2样品的采集和处理4.2.1血液4.2.1.1抗凝全血：消毒局部皮肤，用加有抗凝剂（EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠）的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀6～8次，备用。4.2.1.2末梢全血：消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指。1岁以下儿童采用足跟部）。用采血针刺破皮肤，用无菌纱布擦掉第一滴血。收集滴出的血液，备用。4.2.1.3血浆：将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15分钟，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。4.2.1.4血清：根据需要，用不含抗凝剂的真空采血管抽取5～10ml静脉血，或一次性注射器抽取静脉血，转移至无抗凝剂的试管中，室温下自然放置1～2小时，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15分钟，吸出血清，置于合适的容器中，备用。4.2.1.5淋巴细胞富集液：将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15分钟，吸取血浆层下的淋巴细胞富集液，置于合适的容器中，备用。4.2.1.6PBMC：使用淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心，吸出PBMC层，置于合适的容器中，备用。4.2.1.7抗凝剂的选择：根据检测要求选用适当的抗凝剂，如CD4+和CD8+T淋巴细胞测定可选用EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠；HIV-1病毒分离、核酸定性/定量检测可选用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠。4.2.1.8样品采集后处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测项目而异，应参见不同检测项目要求。4.2.1.9采血完成后的穿刺针头必须丢弃于放置尖锐危险品容器内，妥善处理，防止发生职业暴露。4.2.2滤纸干血斑4.2.2.1根据需要，可将采集的各种血液样品制备成滤纸干血斑，用于检测。最常用的是用抗凝全血、末梢全血和血浆制备滤纸干血斑。4.2.2.2用移液器从样品管中吸取100μL抗凝全血（或血浆），对准滤纸印圈的中心处，将样品滴在滤纸上，或将穿刺后自皮肤伤口流出的末梢全血直接滴加在滤纸印圈的中心处。4.2.2.3根据需要，连续在数个印圈上滴加样品。4.2.2.4于室温下自然干燥至少4小时（潮湿气候下至少干燥24小时），不要加热或堆叠血斑，勿与其它界面接触。4.2.2.5血斑充分干燥后，将其放入密封袋中，每张干血斑单独保存，避免血斑之间的相互污染，同时放入干燥剂及湿度指示卡，密封包装，保存备用。4.2.3尿液和口腔黏膜渗出液4.2.3.1尿液：推荐使用专用采尿管，保持尿液稳定。尿液样品可采集随机尿，女性经期应取中段尿。4.2.3.2口腔黏膜渗出液：使用试剂盒提供的容器收集样品。存放时间和是否冻存以试剂盒说明为准。口腔黏膜渗出液应采集口腔渗出液,不是唾液。4.3样品的保存4.3.1用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于2～8℃，一周以上应存放于-20℃以下。4.3.2用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内进行检测的可存放于4℃，3个月以内应存放于-20℃以下。3个月以上应置于-70℃以下保存。4.3.3口腔黏膜渗出液样品应即刻使用，需要保存应以产品说明书为准。4.3.4尿液样品，使用专用采尿管，室温下可保存2周，一年之内存放宜在2～8℃。长期保存（一年以上）的样本冻存条件、是否添加防腐剂等以产品说明书为准。4.3.5用于CD4+T淋巴细胞检测的全血样品，室温保存，时间不超过24小时。如果用CD45设门，样品保存不超过72小时。4.3.6筛查阳性样品应及时进行补充试验，筛查阴性样品，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存1个月。特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。补充试验阳性样品按照国家生物样品管理的有关规定执行。4.4样品的运送4.4.1全血、血浆的运送应符合生物安全要求，参照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》(卫生部第45号令,2006年2月1日执行)。4.4.2血液样品运送时应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。4.4.2.1第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。4.4.2.2第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。4.4.2.3第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，还应易于消毒。4.4.2.4用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下（18～25℃）运送。用于病毒载量检测的样品应在-20℃以下运输。DBS和尿液样品应在室温下（18～25℃）运送，可通过邮寄方式运送。4.4.2.5运送样品必须有记录。4.5样品的接收4.5.1样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的工作人员打开，打开包裹时应穿戴防护衣、戴口罩和防护眼镜，在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。4.5.2核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。4.5.3检查样品的状况，记录血液样品有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。记录干血斑和尿液样品包装是否完整，如果污染过重或者不符合接收要求，应将样品安全废弃。并立即将样品情况通知送样人，要求重新采集样品。4.5.4接收样品时应填写样品接收单。第二章HIV抗体检测1范围本章规定了HIV抗体的检测方法、结果报告及质量控制。适用于各级各类医疗、疾病预防控制、检验检疫、采供血及卫生保健机构。可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。2规范性文件引用《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》（中华人民共和国卫生行业标准，WS293-有效版本）。ConsolidatedGuidelinesonHIVTestingServices.WHOJuly2015StatementfromtheSurveillanceandSurveyWorkingGroupandtheLaboratoryWorkingGrouptotheOfficeoftheGlobalAIDSCoordinator.26Nov.2006.GuidelinesforusingHIVtestingtechnologiesinsurveillance.UNAIDS/WHO.2009.《艾滋病病毒抗体快速检测技术手册》（中国疾病预防控制中心，2011年版）3HIV抗体检测实验室要求应符合国家对实验室生物安全的有关要求。实验室的质量控制按本规范相关章节规定执行。4HIV抗体检测的目的和要点4.1HIV抗体检测的目的4.1.1HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。4.1.2以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。4.1.3以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。4.1.4以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。4.2HIV抗体检测的要点4.2.1根据目的选择检测方法及检测策略。4.2.2严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。4.2.3结果判定以试剂盒说明书为标准。4.2.4筛查试验有反应，须作补充试验。补充试验是通过检测样本中是否存在艾滋病病毒抗体、抗原或者核酸而确定艾滋病病毒感染的检测方法。补充试验包括抗体确证试验（免疫印迹试验，条带/线性免疫试验，特定条件*下的替代检测，免疫层析或免疫渗滤试验）和核酸试验（核酸定性和核酸定量试验）。替代检测包括三种酶联免疫试验、三种快速试验或酶联免疫加快速试验。*特定条件：高流行地区（流行率大于5%）、高危人群（如男男同性恋，吸毒人群）、三种试剂均经过使用地区中心实验室评价。4.2.5筛查试验无反应，不应做补充试验。4.2.6对筛查及补充试验对象均应做好咨询工作。5常规HIV抗体检测方法5.1试剂和样品必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的方法及试剂。样品可采用血清、血浆、全血、滤纸干血斑、口腔黏膜渗出液和尿液。5.2方法5.2.1筛查方法5.2.1.1酶联免疫吸附试验（ELISA）这类试验可使用血液（包含血清、血浆和滤纸干血斑）、尿液样品，ELISA多为HIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原/抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。5.2.1.2化学发光或免疫荧光试验（CIA/IFA）这类试验采用发光或荧光底物，可使用血液(包含血清和血浆)、尿液样品，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原/抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。5.2.1.3快速检测（RT）及其它试验这类试验可使用血液、口腔黏膜渗出液，操作简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测、VCT及检测点等。一般可在10～30分钟内得出结果。明胶颗粒凝集试验（PA）：是HIV抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏的明胶颗粒，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验的阴性和阳性对照质控，需符合试剂盒的规定。免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状或线状固定在膜上，加待检样品，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点或条带。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。反应时间在30分钟以内。5.2.2抗体确证试验5.2.2.1免疫印迹试验（WB）WB可使用血清、血浆和滤纸干血斑。WB采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的HIV-1蛋白分离开来，然后再把这些分离的不同蛋白带转移到硝酸纤维素膜上（或PVDF膜）。将此膜切割成条状，每一膜条上均含有经电泳分离过的HIV抗原。待测样品经适当稀释后，加至硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有HIV抗体，就会与膜条上抗原带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，根据出现条带情况,按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。5.2.2.2条带/线性免疫试验（RIBA/LIA）RIBA/LIA采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。试剂盒的膜条上包被有HIV-1/HIV-2不同的重组抗原片段，加入待测样品后，其中的相应抗体与抗原发生特异性的免疫反应；随后加入抗人IgG（碱性磷酸酶标记）与HIV特异性IgG抗体相结合；加入显色底物后，在碱性磷酸酶的催化下，特异性抗体的结合部位出现肉眼可见的条带,按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。5.2.2.3其他方法：可用于确证的特定条件下的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验，免疫层析和免疫渗滤试验。6结果报告6.1筛查报告HIV抗体筛查试验报告使用附表1（HIV抗体筛查检测报告）。筛查试验无反应报告为“HIV抗体阴性”；有反应必须进行复检，复检两次检测均无反应报告为“HIV抗体阴性”，复检检测均有反应或一个有反应一个无反应需进行“补充试验”；报告为“HIV感染待确定”，不能出具阳性报告。HIV抗体筛查报告需由一名检验人员和一名审核者签字。6.2确证报告6.2.1WB及RIBA/LIA报告HIV抗体WB及RIBA/LIA试验结果报告使用附表2（HIV抗体确证检测报告）。（1）符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。（2）符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性”。如疑似“窗口期”感染，建议进一步做HIV核酸检测或2-4周后随访，尽早明确诊断。（3）符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定”，在备注中应注明“2-4周后复检”或尽快做核酸检测。（4）HIV抗体确证检测报告应在收到样品后的7个工作日内发出。6.2.2特定条件的用于确证的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验报告。见附表4。7质量控制7.1酶免或发光法抗体检测的室内质量控制7.1.1试剂盒内部对照试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。如内部对照结果无效，必须重新试验。7.1.2室内质控品为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设置的，质控品定值必须为弱阳性。外部质控品的作用是判断该批临床样品检测的可信性。因此，每次实验必须包含室内质控品，出现失控时，必须重新试验。室内质控品可以购买或实验室自行制备。质控品应稳定、无菌、且不含有影响试剂反应的防腐剂。7.1.3Levey-Jennings质控图7.1.3.1质控图参数外部质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对外部质控品重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的均值和标准差。（1）算术平均值（）：代表一组质控品测定S/CO值的均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）测得的外部对照质控品的S/CO值计算平均值。（2）标准差（s）：是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与质控品S/CO值均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表示。（3）变异系数（cv）：是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。（4）控制限：由实验室根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来确定。例如，按照12S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减2个标准差；按照13S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减3个标准差。7.1.3.2质控规则实验室在报告结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。（1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出+2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。（2）失控（13S）：当外部质控品的S/CO值超出+3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控品稳定性下降所致。7.1.3.3质控图的分析及失控处理实验室应建立质控图分析及失控情况处理的程序。当出现失控时，必须找出发生问的原因，找出解除问题的方法，并消除原因。7.1.4室内质控其他方式—“即刻法”质控“即刻法”质控方法是在对同一批外部质控品连续测定3次后，即可对第3次以后的检验结果进行质控。具体计算方法如下：7.1.4.1将质控品的测定值从小到大排列：x1，x2，x3……xn（x1为最小值，xn为最大值）。7.1.4.2计算和s。7.1.4.3计算SI上限值和SI下限值。 SI上限= X最大值- S SI下限= -X最小值 S7.1.4.4将SI上限、SI下限与SI值表（表1）中的数字比较。表1SI值表 N N3s N2s n n3s N2s 3 1.16 1.15 12 2.55 2.29 4 1.49 1.46 13 2.61 2.33 5 1.75 1.67 14 2.66 2.37 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 7 2.10 1.94 16 2.75 2.44 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 11 2.48 2.23 20 2.88 2.56（1）当SI上限和SI下限<n2s时表示处于控制范围内，可以继续测定。继续重复以上各项计算。（2）当SI上限和SI下限有一值处于n2s～n3s值之间时说明该值在2s～3s范围，处于“告警”状态。（3）当SI上限和SI下限有一值>n3s值时说明该值已在3s范围之外，属“失控”。“即刻法”只能在前20次内使用，超出即可采用L-J质控图方法。7.2快速法抗体检测质控7.2.1试剂内对照在质控窗口内出现质控带，该质控带是试剂自带的内部过程质控，说明实验操作全部完成并且实验所用材料处于工作状态。清洁的检测区背景是内部阴性过程质控。如实验完成后未呈现红色质控带，说明试剂盒内质控无效，该试验结果无效，样品须重检。7.2.2室内质控品对照外部质控品可采用商用质控品或自制质控品。质控品应包含抗体阳性样品和阴性样品。自制质控品可使用本室保留的阳性样品。下列情况需做质量控制：更换试剂批号；更换检测人员；更换包装；更换试剂厂家。除此之外，建议每个检测日检测一次阳性和阴性质控品；如果日检测量大于50份样品，至少应作2次质控。出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输包装、内盒或试剂盒的物理损伤；在单包装内存在混杂物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊（特别是产品名称或出产厂家名称，批号和货号，失效期或/和生产日期）；缺失目录；泄漏或污染；不适宜的存放条件；保护包装纸破损或污染；未达到质量控制标准（阳性/阴性控制结果以及质控条带出现与否等标志）；试剂质量问题须报告省确证中心实验室。7.2.3开展抗体相关检测的实验室须参加有资质机构组织的能力验证，或室间比对。第三章HIV-1新发感染检测1范围本章规定了HIV新发感染的检测方法、程序、结果报告及质量控制。适用于开展新发感染检测的各类实验室。2规范性文件引用Technical update on HIV incidence assays for surveillance and monitoring processes.WHO/UNAIDS.2015.GuidelinesfortheuseoftheBEDassayforincidenceestimationandsurveillanceinresource-limitedcountries.Atlanta,5June2006.UsingtheBEDHIV-1CaptureEIAAssaytoEstimateIncidenceUsingSTARHSintheContextofSurveillanceintheUnitedStates.Atlanta,Oct2007.3新发感染检测实验室要求须经过培训考核合格的艾滋病检测实验室，方可开展本项检测。4目的了解重点人群HIV-1新发感染情况，为估计艾滋病流行形势和判断疫情变化提供科学依据。5新发感染检测方法5.1方法学原理用于新发感染检测的方法包括HIV-1限制性抗原亲和力酶联免疫方法（HIV-1LAg–Avidityenzymeimmunoassay，LAg-AvidityEIA）和BEDHIV-1捕获酶联免疫方法（BEDcaptureenzymeimmunoassay,BED-CEIA）。LAg–AvidityEIA方法的原理是，人体在感染HIV后产生的HIV-1特异性抗体对相应抗原的识别和结合能力随着感染时间的延长而增加，即亲和力逐渐增加。而BED-CEIA方法的原理是，HIV特异性IgG占总IgG抗体的比例随着感染时间的延长而逐渐增高。两种方法均只适用于HIV-1抗体阳性样品。只应用于监测目的，不能用于个体诊断和临床，其用于监测及发病率计算的条件参见“《艾滋病病毒新发感染监测操作手册》”。目前对两种方法的评价结果显示，LAg–AvidityEIA方法的假阳性率较BED-CEIA方法低，受疾病状态，如CD4细胞计数，抗病毒治疗等因素的影响较BED方法小，可以更加准确地区分新近感染和长期感染者。因此，BED-CEIA方法正逐渐被LAg–AvidityEIA方法所替代。此外，也有快速新发感染检测方法的研究报道，因其具有快速、简便、价格低廉等优点，未来对其需求将会越来越多。5.2方法5.2.1样品和信息：来源于哨点监测和病例报告系统，用于检测的为抗体阳性样本。5.2.2实验室检测：首选推荐LAg–AvidityEIA，也可使用BED-CEIA。5.2.3数据分析：根据哨点监测各人群新发感染检测结果，结合流行病学相关资料，计算重点人群HIV-1新发感染率,并进行适当校正；根据病例报告系统新报告感染者新发感染检测结果，计算新发感染者占新报告感染者的比例，并根据相关背景信息，综合分析新发感染情况。5.3样品的入选标准和排除标准5.3.1入选标准（1）新发感染检测必须应用诊断为HIV-1抗体阳性的血清或血浆或DBS样品，禁止将HIV-1抗体阴性样品纳入新发感染检测。(2)每份样品量不少于1mL。样品要求清亮、无严重溶血、没有交叉污染，必须保存在-20℃以下，反复冻融次数不多于三次。5.3.2排除标准5.3.2.1LAg–AvidityEIA方法(1)如果同一人在六个月以内出现两份或两份以上确认阳性样品，将第一份样品纳入新发感染检测。(2)所有艾滋病病人的样品。(3)所有接受抗病毒治疗的感染者样品。5.3.2.2BED-CEIA方法(1)如果同一人在六个月以内出现两份或两份以上确认阳性样品，将第一份样品纳入新发感染检测。(2)所有艾滋病病人的样品。(3)所有接受抗病毒治疗的感染者样品。(4)CD4细胞<200个/uL者的样本。5.3.3相关要求(1)对于哨点样品，进行新发感染检测的样品量必须占应检测阳性样品的85%以上，否则不纳入新发感染检测。(2)哨点样品必须具有哨点问卷编号，并尽可能补充病例报告系统卡片ID号。病例报告样品应当填写病例报告系统卡片ID号。5.4结果处理和解释5.4.1LAg–AvidityEIA方法：5.4.1.1确定对照和校准品的中值OD值（中值OD值为3次OD值排序后中间的值，阴性对照的中值为两孔OD值的平均值），对照和校准品的中值OD值必须在下表范围内，两个NC样品的OD值都必须在该范围内，该试验才有效。否则，任何一个对照和校准品的中值OD值不在表2范围内，判定为无效，需要重新稀释样品进行检测。5.4.1.2计算标准OD值（ODn）对照的ODn值＝对照的中值OD值/校准品的中值OD值初筛试验：各样品的ODn值＝各样品的OD值/校准品的中值OD值确认试验：各样品的ODn值＝各样品的中值OD值/校准品的中值OD值任一对照和校准品的ODn值必须在下表显示值的范围内，该试验才有效。否则，如果任何一个对照的ODn值不在表3范围内，该试验判定为无效，需要重新稀释样本并进行检测。5.4.1.3结果的解释初筛试验：样本进行单孔检测，当ODn值>2.0时，该样本被判为长期感染样本，不需要进行确认试验。当样本的ODn值≤2.0时，该样本需纳入确认试验。确认试验：初筛试验中ODn值≤2.0的样本稀释三份并三孔重复检测。当ODn值≤1.5，该样本判为近期感染，当ODn值>1.5时，该样本判为长期感染样本。5.4.2BED-CEIA方法5.4.2.1确定对照和校准品的中值OD（中值OD为3次OD值排序后中间的值），对照和校准品的中值OD值必须在表4范围内，该试验才有效。两个NC样品的OD值在初筛和确认中都必须在该范围内。5.4.2.2计算标准OD值（ODn）对照的ODn值＝对照的中值OD/校准品的中值OD初筛试验：各样品的ODn值＝各样品的OD值/校准品的中值OD确认试验：各样品的ODn值＝各样品的中值OD值/校准品的中值OD对照和校准品ODn值的正常范围：对照和校准品的ODn值必须在要求的范围内，该试验才有效。5.4.2.3结果解释在中国的研究显示，BED的ODn为0.8时，可以指明平均血清阳转时间为168天。ODn为0.8时可以减少AIDS病人错分为近期感染的几率，进而得到较好的近期感染的预测值。在初筛试验中样本为单份检测，当ODn值≤1.2时，样本需分成三份重复检测。在确认试验中，若ODn值≤0.8时，该份样品判为近期感染。5.5数据分析5.5.1LAg–AvidityEIAHIV-1新发感染率的计算监测哨点HIV-1新发感染率是指：各省哨点监测重点人群中，每年新感染HIV-1人群占暴露人群的比例。原则上以省为单位计算各重点人群新发感染率。当样品数量足够大时，可以考虑按照地区计算新发感染率，也可以按照设定的因素（如年龄、性别、感染途径、婚姻状况、行为因素、受教育程度、地区等）对HIV-1新发感染率监测数据进行分层分析将新发感染检测数据汇总后，即可进行类似分析。新发感染率计算公式：（1）美国CDC和UNAIDS/WHO推荐用于横断面研究计算公式：（2）Hargrove校正法：中点公式：回顾公式：变量符号：①待计算的变量值：I＝新发感染率（高危人群中每100人年新感染的数量）；②在横断面调查中测量的变量值：T＝调查的总人数，P＝HIV-1检测为阳性的总人数，N＝HIV-1检测为阴性的总人数，R＝实验判定为新近感染的总人数；③从单独的校准研究中获得的变量值：w＝窗口期（从血清阳转到实验方法能够判为新发感染的最长时间），FRR=错分率。ODn等于1.5为界值判定新发感染计算LAg方法的窗口期为130天。感染时间超过一年且未接受ART治疗HIV感染者获得的FRR为2.30%。5.5.2BEDHIV-1新发感染率的计算监测哨点各类人群HIV-1新发感染率。同亲和力方法。新发感染率有McDougal和Hargrove两种计算法（在中国推荐优先使用McDougal计算法），每种方法均有中点公式和回顾公式。回顾公式是对在横断面抽样前一年的新发感染率估计，中点公式是对在横断面抽样约+/-6个月时的新发感染率估计。（1）McDougal法（调整灵敏度/特异度）中点公式：回顾公式：校正因子F：（2）Hargrove法(调整特异度)中点公式：回顾公式：变量符号：①待计算的变量值：I＝新发感染率（高危人群中每100人年新感染的数量），F＝调整灵敏度或特异度的调整因子；②在横断面调查中测量的变量值：T＝调查的总人数，P＝HIV-1检测为阳性的总人数，N＝HIV-1检测为阴性的总人数，R＝实验判定为新近感染的总人数；③从单独的校准研究中获得的变量值：w＝窗口期（从血清阳转到实验方法能够判为新发感染的最长时间），α＝实验方法检测新发感染(＜1w)的灵敏度，β＝实验方法对感染时间在1w-2w天样品的特异度，γ＝实验方法对感染时间超过2w天样品的特异度，ε＝实验方法对感染时间超过2w天样品的误判率。我国BED方法HIV-1新发感染相关的校正系数值是基于分析来自1565个已知血清阳转日期（大约）样品的BED检测值，这些值为：w=168天，α=0.8098，β=0.7571，γ=0.9315，ε=0.06856质量控制6.1人员培训进行新发感染检测的实验人员必须经过严格的技术培训，而且在正式开展新发感染检测工作之前，至少要做5次预实验，除阴性对照外，其他样本ODn值的CV值均需小于15%。必须参加能力验证，如结果不合格，需仔细分析原因，纠正后方可继续开展检测。6.2样品质控所有样品的采集、运输、检测及保存必须严格按照本规范执行。样品检测之前要核对正确，并完全融化，充分混匀。稀释样品以及将稀释好的样品加入酶标板时，必须使用带滤芯的枪头，避免交叉污染。6.3试剂质控6.3.1试剂内对照每个试剂盒内均含有厂家提供的阴性、低值阳性、高值阳性和校准品，用于判断每次实验的有效性，要求每次实验的OD和ODn值均需在要求范围内，否则结果视为无效，必须重新进行检测。每次检测样品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能应用在同批号的试剂盒中，并对内部对照建立Levey-Jennings质控图，以保证检测的准确性和精确性。6.3.2试剂外质控新发感染试剂必须按照要求运输和保存。采购后，需进行平行实验验证，确保符合质量要求之后，才可进行实验。每次实验须同时做外部对照，如外部对照不通过须重新实验。此外，开启试剂盒时，需在包装盒上注明开启日期，同时注意在有效期内使用，避免使用临近有效期的试剂。6.4实验过程质控实验过程中，环境条件（主要指室温）要恒定（15-30℃）。严格按照试剂盒说明书操作，控制每一步骤的孵育时间和温度。时间应准确计量，禁止估算。必须定时维护和校准仪器设备，尤其是加样器、孵育箱，以保证结果准确性。保留所有的原始实验记录，并有检测人以及复核人的签字。如果初筛实验和确认实验同一份样本的ODn值相差较远，一致性较差，需要3孔复检，做第三次检测，以两次相关性较好的结果为最终结果。第四章HIV-1抗原检测1范围本章规定了HIV-1p24抗原检测的方法和用途。适用于对人血液样品和病毒培养上清液中HIV-1p24抗原的检测。2规范性文件引用NIAIDVirologyManualforHIVLaboratory,NIHPublication,No.97-3828,Jan1997.NielConstantine，HIVViralAntigenAssays,HIVInSiteKnowledgeBaseChapter,September2001, http://hivinsite.ucsf.edu3HIV－1p24抗原检测的意义3.1HIV-1感染窗口期、HIV-1抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。3.2第四代HIV检测试剂（抗原抗体检测试剂）的阳性结果的辅助诊断。3.3HIV-1分离培养、病毒复制状况的监测。4实验室要求同HIV抗体检测。5检测方法及程序5.1试剂：原理一般是抗体夹心法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA法）、酶联荧光分析法（ELFA）、电化学发光法（ECLIA）、抗原抗体快速检测法等。应使用经国家药品监督管理总局批准注册的试剂。5.2样品：血清、血浆、全血或病毒培养上清液。5.3定性检测5.3.1筛查试验酶联免疫吸附实验（ELISA法）：抗体包被固相反应孔（管）的底部，待测样本中P24抗原与包被抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读取结果。酶联荧光分析法（ELFA）：待测样品的p24抗原与包被在固相孔（管）内的p24抗体结合，并被生物素标记的p24抗体识别。经过碱性磷酸酶复合物孵育后加底物，酶复合物催化底物水解成荧光产物，此荧光可在450nm波长处检测。对每份标本的固相孔（管）测量两次，第一次是加入底物前的背景读数，第二次是酶复合物催化底物水解后的读数。仪器自动分析计算相对荧光值（RFV）并自动报告判读结果。电化学发光法（ECLIA）：待测样品的p24抗原与包被抗体的磁性微粒和发光剂标记的抗体在反应管中温育，形成磁性微珠包被抗体-抗原-发光剂标记抗体复合物。将复合物吸入流动室用TPA（tripropylamine三丙胺）缓冲液冲洗，流经电极表面时，结合了的磁性微珠被电极下的磁铁吸附，而游离的磁性微珠及发光剂标记抗体被冲走。同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。仪器根据发光值（COI）判读结果。抗原抗体快速检测法：待检样本中的HIV抗体、HIV-1p24抗原分别与样品垫中的HIV-1/HIV-2抗原、HIV-1p24单克隆抗体结合形成复合物，在毛细作用下沿着硝酸纤维膜向上移动，至相关抗体、抗原包被区域后，分别与之结合，组成有色复合物线条。质控线用于检测过程质量控制，肉眼判读检测结果。筛选试验依据试剂盒说明书提供的标准判断有反应或无反应。5.3.2中和试验中和试验主要是p24抗原检测的补充试验，还可做HIV-1RNA的定性或定量检测，以排除筛查试验的假阳性。中和试验：（1）酶联免疫吸附实验（ELISA法）：待检样品先与中和剂（p24抗原的抗体）共同孵育，如果样品中存在p24抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。之后，用这样处理过的样品重复筛查实验，同时做一孔未中和的原始样品对照，将中和与未中和孔的OD值进行比较，如果中和孔的OD值下降50%以上，认为样品中的p24抗原是真阳性；如果中和孔没有出现OD值的下降或下降的幅度不到50%，认为筛选试验p24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。（2）酶联荧光分析法（ELFA）：原理和检测步骤同上述酶联免疫吸附实验（ELISA法）。结果判断方法为，比较中和与未中和样品的荧光值（RFV），根据说明书提供的方法计算中和率，如果中和率大于或等于60%，认为样品中的p24抗原是真阳性；如果中和率小于60%，认为p24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。（3）电化学发光法(ECLIA)：原理和检测步骤同上述酶联免疫吸附实验（ELISA法）。结果判断方法为，比较中和与未中和样本的COI值，根据说明书提供的方法计算中和率，如果中和率大于50%，认为样品中的p24抗原是真阳性；如果中和率小于50%，认为p24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。HIV-1RNA检测按照相关章节执行。5.4定量检测将p24抗原的标准物质稀释成包含0.0和125pg/ml两个浓度在内的六个不同浓度的系列标准，进行检测。横坐标为p24抗原的浓度（pg/ml），纵坐标为OD值（酶联荧光分析法为RFV值、电化学发光法为COI值），绘制出标准曲线。测出未知样品的反应值（OD值、或RFV值、或COI值）以后，可在标准曲线上查出抗原的浓度。如果未知样品的反应值超出标准曲线上最高抗原浓度的反应值，则需用正常人血清将样品稀释以后再行检测。自动化检测试剂及其配套的仪器，可根据储存于仪器中的标准曲线自动计算反应值并自动报告p24抗原的浓度（pg/ml）。5.5结果报告和解释应按照试剂盒说明书报告和解释。5.5.1对于定性检测，HIV-1p24抗原筛查试验有反应的样品必须经过中和试验确证以后才能判断阳性或阴性。5.5.2HIV-1p24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据。5.5.3HIV-1p24抗原阴性结果不能排除HIV感染。6质量控制6.1定性检测酶联免疫吸附试验（ELISA）的内部对照应满足试剂盒规定的条件，还可以使用含有中等浓度p24抗原的质控品（血浆或病毒培养上清液）作为外部对照，按照常规的质控方法绘制质控图。中和试验应使用试剂盒提供的中和抗体，使用已知p24抗原阳性的样品作为阳性对照阳性对照中的中和孔，OD值应下降50%以上。酶联荧光分析法（ELFA）：每更换批号后或每间隔14天时，必须用试剂盒提供的校准品进行校准，校准值必须在设定的相对荧光值内，若超出范围，必须重新校准。每次校准还需要同时检测试剂盒提供的阴性对照和阳性对照。