书书书
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
犛犖/犜2525—2010
食品中肉毒梭菌的犘犆犚检测方法
犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿犫狅狋狌犾犻狀狌犿犻狀犳狅狅犱狊犫狔犘犆犚
20100302发布 20100916实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
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书书书
前 言
本标准参照美国FDABAM第17章第5部分:A、B、E、F型肉毒梭菌PCR检测方法[U.S.FDA,
BacteriologicalAnalyticalManualOnline,Chapter17(V),2001:SpecificDetectionofClostridiumbotu
linumTypesA,B,EandFUsingthePolymeraseChainReaction(PCR).]经研究和验证后制定。
本标准的附录A、附录B均为规范性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。
本标准主要起草人:陈双雅、谢明星、张永祥、陈伟玲、王群力、刘棠、彭小莉、周赞虎、张孟璋。
本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。
Ⅰ
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食品中肉毒梭菌的犘犆犚检测方法
1 范围
本标准规定了食品中肉毒梭菌的PCR检测方法。
本标准适用于食品中A、B、E、F型肉毒梭菌的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有
的修改单(不包括勘误的
)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成
的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T4789.12 食品卫生微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验
GB/T6682 分析试验室用水规格和实验方法
GB19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
SN/T1193 基因检验实验室技术要求
3 术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本标准。
3.1 术语和定义
3.1.1
肉毒梭菌 犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿犫狅狋狌犾犻狀狌犿
肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌,厌氧,在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一
类具有很强毒性的神经麻痹毒素,即肉毒毒素。
3.1.2
聚合酶链式反应 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀,犘犆犚
模板DNA先经高温变性成为单链,在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下,根据模板序列设计
的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合,接着在DNA聚合酶
的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸
这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。
3.2 缩略语
3.2.1
犫狆 犫犪狊犲狆犪犻狉
碱基对。
3.2.2
犇犖犃 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱
脱氧核糖核酸。
3.2.3
犱犖犜犘 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲
脱氧核苷三磷酸。
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3.2.4
犱犃犜犘 犱犲狅狓狔犪犱犲狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲
脱氧腺苷三磷酸。
3.2.5
犱犆犜犘 犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲
脱氧胞苷三磷酸。
3.2.6
犱犌犜犘 犱犲狅狓狔犵狌犪狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲
脱氧鸟苷三磷酸。
3.2.7
犱犜犜犘 犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲
脱氧胸苷三磷酸。
3.2.8
犜犪狇 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌
水生栖热菌。
3.2.9
犜狉犻狊 狋狉犻狊(犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾)犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲
三(羟甲基)氨基甲烷。
3.2.10
犈犇犜犃 犲狋犺狔犾犲狀犲犱犻犪犿犻狀犲狋犲狋狉犪犪犮犲狋犻犮犪犮犻犱
乙二胺四乙酸。
4 生物安全
为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌,所有培养物和废弃物应小心
处置,并按照GB19489和GB/T27403中的有关规定执行。
5 防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。
6 方法提要
样品经增菌后划平板分离单菌落,挑取可疑菌落到TPGY培养,对培养物采用热裂解抽提DNA
法,或商品化细菌基因组DNA提取试剂盒抽提DNA法制备PCR模板,进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电
泳检验PCR产物是否有特征条带,从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。
7 设备和材料
7.1 天平:感量0.001g。
7.2 生物安全柜。
7.3 厌氧培养装置。
7.4 恒温培养箱:35℃±1℃和28℃±1℃。
7.5 高压灭菌锅。
7.6 恒温水浴:37℃±1℃和60℃±1℃。
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7.7 高速台式冷冻离心机:14000犵。
7.8 冰箱:-20℃和-70℃。
7.9 PCR仪。
7.10 电泳仪。
7.11 凝胶成像分析系统。
7.12 紫外分光光度计。
7.13 微量可调移液器:0.2μL~2μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。
7.14 离心管:1.5mL。
7.15 PCR反应管:200μL~500μL。
8 培养基和试剂
除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,水应符合GB/T6682中一级水的规格。
8.1 庖肉培养基:见附录第A.1章。
8.2 胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤(TPGY):见附录第A.2章。
8.3 厌氧卵黄琼脂:见附录第A.3章。
8.4 无水乙醇和95%乙醇。
8.5 PBS缓冲液:氯化钠7.650g/L、磷酸氢二钠0.724g/L、磷酸二氢钾0.210g/L(pH7.4)。
8.6 TE缓冲液:10mmol/LTrisHCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。
8.7 蛋白酶K溶液:用TE配制,使用浓度为10mg/mL。
8.8 溶菌酶溶液:用TE配制,使用浓度为10mg/mL。
8.9 3mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)。
8.10 20%SDS溶液。
8.11 引物:根据附录B中表B.1的序列合成引物,加超纯水配制成100μmol/L储液,用于PCR测试
的引物浓度为10μmol/L。
8.12 犜犪狇DNA聚合酶。
8.13 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
8.14 琼脂糖:电泳级。
8.15 溴化乙锭。
8.16 DNA分子量标准。
8.17 阳性对照:含有扩增片段的质粒或A、B、E、F型肉毒梭菌的基因组DNA。
8.18 商品化细菌基因组DNA提取试剂盒。
8.19 10×PCR缓冲液:200mmol/LTrisHCl(pH8.4)、200mmol/L氯化钾、15mmol/L氯化镁。
8.20 5×TBE电泳缓冲液:Tris54g、硼酸27.5g、0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,加蒸馏水至
1000mL,使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。
8.21 6×加样缓冲液:30mmol/LEDTA,36%(体积分数)甘油,0.05%(质量浓度)二甲苯腈蓝FF,
0.05%(质量浓度)溴酚蓝。
9 检验程序
检验程序见图1。
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图1 肉毒梭菌犘犆犚检测程序
10 检验步骤
10.1 样品制备和增菌培养
接种前,先将增菌培养基煮沸10min~15min,以排除溶解于培养基中的氧,并迅速冷却,切勿摇
动。每15mL增菌肉汤中接种1g~2g固体食品或1mL~2mL液体食品,接种时将接种物慢慢接入
肉汤液面以下。每份样品接种两管庖肉培养基,置35℃±1℃,同时接种两管TPGY培养基,置28℃±
1℃,厌氧培养5d。检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。若有生长,按10.2分离纯培
养物。若未见生长,则继续培养10d。
10.2 分离纯培养物
取1mL~2mL培养液置于螺旋帽试管中,加入等量过滤除菌的无水乙醇。混匀,在室温下放置
1h。或80℃加热10min~15min以破坏其繁殖体。
用接种环取1环~2环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种,置厌氧条件下
35℃±1℃培养48h。
挑取约10个单个的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平,光滑或粗糙,容易蔓延生长并有不
规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时,菌落表面通常呈虹彩样,亦称为珠色层。彩带通常向外延
伸,继而菌落产生不规则外形。
接种可疑菌落到TPGY培养基中,置35℃±1℃厌氧培养24h。
10.3 模板犇犖犃的制备
以下两种方法任选一种进行。剩余培养液置4℃保存,以备确证试验使用。
10.3.1 热裂解抽提犇犖犃法
取1.4mLTPGY培养物转移至1.5mL离心管中,14000犵离心2min,弃去上清液。加入1.0mL
PBS悬浮菌体沉淀,14000犵离心2min,去上清。用400μLPBS重悬沉淀,加入10mg/mL溶菌酶溶
液100μL,37℃±1℃水浴15min,期间每5min~7min颠倒混匀离心管。加入10mg/mL蛋白酶K
溶液10μL,60℃±1℃水浴1h,期间每10min~15min颠倒混匀离心管。沸水浴10min,14000犵离
心2min,上清液转移至新的灭菌小离心管中。加入3mol/LNaAc溶液50μL和95%乙醇1.0mL,颠
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倒混匀,-70℃或-20℃放置30min,14000犵离心10min,弃去上清,沉淀干燥后溶于200μLTE溶
液。按10.4进行纯度和浓度测定后置于-20℃保存。
10.3.2 试剂盒抽提犇犖犃法
取1.4mLTPGY培养物转移至1.5mL离心管中,14000犵离心2min,弃去上清液。菌体沉淀用
1.0mLTE缓冲液洗两次后重悬于120μL的25%蔗糖溶液中。加入10mg/mL溶菌酶溶液120μL,
混匀,37℃±1℃水浴30min;然后加入20%SDS溶液30μL,轻轻混匀,室温放置5min;再加入
10mg/mL蛋白酶K溶液9.0μL,混匀后37℃±1℃水浴30min。悬浮液采用商品化细菌基因组
DNA提取试剂盒提取DNA,使用时按照试剂盒说明书进行操作。提取的DNA按10.4进行纯度和浓
度测定后置于-20℃保存。
10.4 核酸纯度和浓度的测定
取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测
260nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照式(1)计算。
犮=犃260×犖×50 …………………………(1)
式中:
犮———DNA浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
犃260———260nm处的吸光值;
犖———核酸稀释倍数。
当浓度为0.34μg/mL~340μg/mL,犃260/犃280比值在1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。
10.5 犘犆犚扩增
10.5.1 采用分别针对A、B、E、F型肉毒梭菌肉毒毒素基因设计的型特异性引物(附录B中表B.1),进
行多个PCR扩增,每个PCR反应管检测一种类型的肉毒梭菌。
10.5.2 PCR反应体系和参数见附录B中表B.2和表B.3。反应体系中各试剂的量可根据具体情况
或不同的反应总体积进行适当的调整。
10.5.3 PCR检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有扩增片段的质粒或A、
B、E、F型肉毒梭菌的基因组DNA作阳性对照,用非肉毒梭菌基因组DNA作阴性对照,用无菌水作空
白对照。
10.6 凝胶电泳检测犘犆犚产物
用0.5×TBE缓冲液制备1.2%~1.5%(质量浓度)的琼脂糖凝胶(凝胶加热融化后冷却至60℃
左右加入溴化乙锭至0.5μg/mL,或者在电泳后用0.5μg/mL溴化乙锭溶液进行染色),将10μL的
PCR产物与2.0μL6×加样缓冲液混合,点样,其中一孔加入DNA分子量标准,以判断PCR产物的片
段大小。0.5×TBE电泳缓冲液,10V/cm恒压电泳,电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定,电泳检
测结果用凝胶成像系统
。
11 犘犆犚结果判定
阴性对照和空白对照均未出现条带,阳性对照出现预期大小的扩增条带,待测样品出现预期大小的
扩增条带,判定为PCR结果阳性,按第12章进行确证试验;待测样品未出现预期大小的扩增条带,判定
PCR结果为阴性,按第13章直接
结果。
实验中设置的阴性对照、空白对照和阳性对照PCR检测结果应符合上述情况。否则,任一种对照
如果出现非上述正常结果,应重做实验。
12 确证试验
取10.3剩余培养液,按GB/T4789.12规定的方法进行确证试验。
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13 结果报告
PCR结果阴性,直接报告“未检出A、B、E、F型肉毒梭菌”。
确证试验结果为检出肉毒梭菌,则报告“检出某型(A、B、E、F型)肉毒梭菌”。
确证试验结果为未检出肉毒梭菌,则报告“未检出A、B、E、F型肉毒梭菌”。
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附 录 犃
(规范性附录)
培养基和试剂的配制
犃.1 庖肉培养基
犃.1.1 成分
新鲜牛肉 500.0g
蛋白胨 30.0g
酵母浸膏 5.0g
磷酸二氢钠 5.0g
葡萄糖 3.0g
可溶性淀粉 2.0g
蒸馏水 1000mL
犃.1.2 制法
将新鲜除脂肪和筋膜的牛肉500g切碎,加入蒸馏水。加热至沸点,再以文火煮1h。充分冷却,经
纱布过滤,挤出余液。加入其他成分,用蒸馏水将液体体积补足至1000mL。调节pH至7.4±0.1,经
粗滤纸过滤。在15mm×150mm试管中先加入碎肉渣至3cm高,然后加入肉汤,超过肉渣表面约
4cm,上面覆盖一层液体石蜡,厚度为0.3cm~0.4cm。在121℃高压灭菌20min。
犃.2 胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤(犜犘犌犢)
犃.2.1 成分
胰酪胨(trypticase) 50.0g
蛋白胨 5.0g
酵母浸膏 20.0g
葡萄糖 4.0g
硫乙醇酸钠 1.0g
蒸馏水 1000mL
犃.2.2 制法
将固体成分溶于1000mL蒸馏水中,再分装15mm×150mm试管,每管15mL。上面覆盖一层
液体石蜡,厚度为0.3cm~0.4cm。在121℃下高压灭菌10min。最终pH为7.0±0.1。放冰箱内保
存,若2周内不用则弃掉。临用前,将基础液用蒸汽或煮沸加热10min~15min,以排除游离氧,迅速
冷却。
犃.3 厌氧卵黄琼脂
犃.3.1 琼脂基础
酵母浸膏 50.0g
胰胨 5.0g
蛋白胨 20.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 1000mL
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在121℃下高压灭菌15min。最终pH为7.0±0.2。
犃.3.2 卵黄乳状液
用硬刷洗刷2个~3个鸡蛋,沥干。将鸡蛋放在0.1%氯化汞溶液中浸泡1h,再用70%乙醇浸泡
30min。取出鸡蛋,以无菌操作打开,弃去蛋白。用注射器取出蛋黄,放入灭菌容器,加等量灭菌生理盐
水,充分混合,存于4℃备用。
犃.3.3 制法
每500mL琼脂基础液(48℃~50℃)加80mL卵黄乳状液,充分混合,制成平板。室温放置2d,
或35℃放置24h。剔除污染的平板,将无菌平板存于冰箱。
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附 录 犅
(规范性附录)
肉毒梭菌犘犆犚检测方法参照表
表犅.1 肉毒梭菌肉毒毒素基因犘犆犚检测的引物序列
检测肉毒梭菌类型 引 物 序 列 扩增长度/bp
A型
正:5’GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG3’
反:5’AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT3’
983
B型
正:5’GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG3’
反:5’GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG3’
492
E型
正:5’CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT3’
反:5’TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC3’
410
F型
正:5’GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT3’
反:5’GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG3’
1137
表犅.2 肉毒梭菌肉毒毒素基因犘犆犚检测的反应体系
试 剂 终浓度 加入体积/μL
10×PCR缓冲液 1× 5.0
25mmol/LMgCl2 2.5mmol/L 5.0
10mmol/LdNTPs 0.2mmol/L 1.0
10μmol/L正向引物 0.5μmol/L 2.5
10μmol/L反向引物 0.5μmol/L 2.5
5U/μL犜犪狇酶 0.05U/μL 0.5
DNA模板 — 1.0
ddH2O — 32.5
总体积 — 50.0
注:反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。
表犅.3 肉毒梭菌肉毒毒素基因犘犆犚检测的反应参数
预变性 扩 增 循环数 后延伸
95℃,5min 94℃,1min;60℃,1min;72℃,1min 40 72℃,10min
注:PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。
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0102—
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行 业 标 准
食品中肉毒梭菌的犘犆犚检测方法
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中 国 标 准 出 版 社 出 版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码:100045
网址 www.spc.net.cn
电话:68523946 68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷
开本 880×1230 1/16 印张 1 字数 17 千字
2010年5月第一版 2010年5月第一次印刷
印数1—1600
书号:155066·220858 定价 18.00 元
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