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首 都 医 科 大 学 学 报
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·专题报道·
常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用
王雅杰? % 王% 璨!,@ % 方% 芳? % 史从宁? % 蒋% 迪! % 张国军? % 吕% 虹? % 杨华卫! % 常% 铮?
韩金利? % 赵传赞!,@ % 耿慧娟? % 唐明忠? % 王美容? % 张% 艳? % 刘亚楠? % 康熙雄?! %高华方!!
(?<首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心;!<博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心;
@<清华大学医学院)
【摘要】! 目的! 利用基因芯片技术进行常见革兰阳性细菌的细菌鉴定和耐药性检测。方法! 用生理生化鉴定和药敏纸片法确
定 $$A 份革兰阳性细菌菌株的细菌种类和耐药性,盲法进行革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的检测,用 BCBB ?"< " .(*
D1+5(E9软件统计分析。结果! 与临床常规方法相比,耐药检测基因芯片鉴定指标的灵敏度均 F GHI,特异度均 F G&I;耐药检
测指标的灵敏度均 F G$I,特异度均 F G"I。!! 检验结果 !值均 F "< "A,基因芯片检测结果与临床常用方法检测结果差异无统
计学意义。J,00,值均 F "< #A,! 种方法一致性较好。结论! 基因芯片技术对细菌鉴定和耐药检测有一定的临床应用价值。
【关键词】! 细菌鉴定;耐药;基因芯片
【中图分类号】! K $$H< A
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基金项目:&H@(!""!;;!R!"??)资助项目
! 通讯作者(/(**490(+51+L ,)2P(*)
% % 随着感染性疾病发病率的升高,临床对细菌的鉴
定和耐药检测的要求越来越高[?,!]。目前从标本采集
到得出明确的细菌学鉴定和耐药检测结果往往需要
@ ‘$ 5甚至更长时间,给临床及时诊治带来了一定的
困难。目前临床上对细菌的常规检验手段包括形态学
检查、分离培养鉴定和药敏实验等,但这些方法操作繁
琐、分段进行、耗时长且准确性不十分理想。为了更好
地为临床提供细菌鉴定和耐药检测结果,本研究利用
基因芯片技术,对常见革兰阳性(S*,[ 0(912184,S a)
细菌的细菌鉴定和耐药检测进行了尝试[@]。
"! 材料和方法
"# "! 材料
?)菌株来源:临床分离的 $$A 株 S a细菌,北京天
坛医院分离并保存。
!)仪器和试剂:316*(B6,+ D,-^,E,:\$" 型全自动 万方数据
第 ! 期 王雅杰等:常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用
微生物鉴定仪及 "#$ %&’(& )*+, !- 检测板购自美国
./.0公司。药敏纸片购自北京天坛生物技术开发
公司。1 2细菌鉴定与耐药检测基因芯片试剂盒、3456
$789): -;<6=微阵列芯片扫描仪和基因芯片杂交盒
由博奥生物有限公司提供。
芯片的检测指标包括细菌鉴定和耐药检测指标。
细菌鉴定指标的选择:根据临床上细菌的分离率以及
引起临床感染的严重性,选择的细菌鉴定种类有:金
黄色葡萄球菌($/)、凝固酶阴性葡萄球菌(%>$)、粪
肠球菌(0?@)和屎肠球菌(0?’),其中选择 -A$ BC>/
基因作为金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪
肠球菌鉴定基因;而对于根据 -A$ BC>/ 基因难以与
其他细菌分开的菌种,则选择其特异基因设计探针,
如屎肠球菌,选用其特异基因 !"#$ 进行鉴定。耐药
检测指标的选择:根据临床葡萄球菌和肠球菌中常见
的抗生素耐药性的种类、严重程度和给临床治疗带来
的不利影响,选择了提示甲氧西林耐药性的 ’,7/ 基
因[D,E"、提示庆大霉素耐药性的 887(AF)8+G(!H)基
因[A"、提示大环内酯类耐药性的 %#!&、%#!$ 及 !"#&
基因进行检测。采用基因芯片微量点样技术,将检测
上述基因的特异探针与各种对照探针固定在经过醛
基修饰的玻璃基片上,检测探针各重复 D 个点,对照
探针各重复 D I J 个点,形成点间距为 D;; !’、点直径
为 -E; !’的 K L J 的微阵列。每张芯片上有 D 个同
样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。
!" #$ 方法
-)常规方法进行细菌种类及耐药性的确定:1 2
菌株 DDE 份利用生理生化鉴定以及药敏纸片法确定
细菌种类及耐药性。采用美国 ./.0 公司的 :M6
7B&$789 N8OP8Q8*6D; 型全自动微生物鉴定仪及其配
套的 "#$ %&’(& )*+, !- 检测板进行细菌鉴定。根据
美国临床实验室标准委员会()G, >8RM&98O %&’’MRR,,
?&B %OM9M78O 38(&B8R&B* $R89S8BS@,>%%3$)推荐的纸片
法抗微生物药物敏感试验标准操作程序第 J 版(:!6
/J),通过纸片扩散法确定样本对各种药物的敏感性,
包括
- 中各种药敏试验,以及纸片扩散法氯林可霉
素诱导耐药性药敏试验(距 -E!T 红霉素纸片边缘 -E
I !A ’’处放置含 ! !T 氯林可霉素纸片检测,孵育
后氯林可霉素抑菌圈不出现“截平”现象,提示分离株
对其敏感;临近红霉素纸片侧氯林可霉素抑菌圈出现
“截平”现象,提示分离株对其耐药)。
!)基因芯片进行细菌菌种鉴定及耐药检测:1 2
表 !$ 药敏试验判断标准(%&&’()
)*+ !$ ,-./01023 43*2.*5. 67 .5-/ 4-48093:+:;:3< 3043(%&&’()
/9RM’M7B&(M8O SB4T .B4T 7&9R,9R&? @7BM+ U !T
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-!; 09R,B&7&774@ A Z I K $-;
菌株利用生理生化鉴定以及药敏纸片法确定细菌种
类及耐药性后,样本全部随机排列盲编。利用基因芯
片对样本进行细菌菌种鉴定及耐药检测,操作按试剂
盒
进行,具体方法如下:
细菌核酸提取:挑取分离培养的细菌单菌落,加
入细菌核酸提取试剂管中,振荡 E ’M9,再置于 KE [
水浴锅中水浴 E ’M9,取出,稍微离心将管壁液体收集
至管底。
核酸多重扩增:取扩增试剂混合物和扩增引物混
合物按试剂盒说明书中比例混合,再加入 !\ - 中提取
的细菌核酸 Y !3,混合均匀;同时按照试剂盒说明书
设置反应的阴阳性对照。配制好的 "%C 体系置于
"%C反应仪中反应。反应程序参照试剂盒说明书。
芯片杂交:取反应完成后的 "%C 产物 -; !3,加
入 -!\ E !3 杂交缓冲液,混合均匀后 KE [变性 E
’M9,置于冰水混合物中冷却 Y ’M9。取上述杂交液 -Y
!3加入芯片点阵处,盖好杂交盒上盖,扣好芯片盒铁
扣,放入 A; [水浴锅中水浴反应 -\ E G。取出反应后
的芯片进行洗涤。使用软件扫描并判读结果。细菌
鉴定结果的判读见表 !,耐药探针与耐药基因的对应
关系见表 Y。
Y)结果分析:样本解盲后,对生化鉴定的结果、常
规药敏检测结果与芯片检测结果用 $"$$ -;\ ; ?&B
NM9S&Q@软件进行比较和统计分析。
-D-
万方数据
首 都 医 科 大 学 学 报 第 !" 卷
表 !" 细菌鉴定结果的判读
#$% !" &’()*+*,- ./ %$0-*12$3 2(*,-2/20$-2., 1*4’3-
#$%& ’( )*’+&, -&,./0 ’( )*’+&,
123 4 4 5 5
1$. 4 5 5 5
6#1 5 4 5 5
7#6 5 5 4 4
7(, 5 5 4 5
7(% 5 5 5 4
8.9:& ’( %;<*’’*:$=;,% 13 6#1 7(, 7(%
表 5" 耐药探针与耐药基因的对应关系
#$% 5" 6.11*47.,(2,) 1*3$-2.,48274 %*-9**, (1’) 1*424-$,0*
(*-*0-2., 71.%*4 $,( (1’) 1*424-$,0* )*,*!
#$%& ’( )*’+&, 6’**&,)’=9;=: :&=&
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H0B&*I;,& 0B& *&,./0 ;, <’=0*$*JG
!" 结果
!: ;" 生理生化鉴定法细菌鉴定结果
KKL 份 M 4菌株,其中金黄色葡萄球菌 NLO 份、凝
固酶阴性葡萄球菌(6#1)"L 份、粪肠球菌 N!? 份、屎
肠球菌 K? 份,以及 OL 株链球菌。
!: !" 药敏纸片法细菌耐药性检测结果
!O" 份葡萄球菌中,甲氧西林耐药菌株 NPO 份及
甲氧西林敏感菌株 ?L 份(临床根据代表性药物头孢
西丁的药敏试验确定);大环内酯类耐药菌株 NQ? 份
及大环内酯类敏感菌株 K! 份(临床根据代表性药物
红霉素的药敏试验确定);氯林可霉素耐药菌株 N"L
份及氯林可霉素敏感菌株 LO 份;庆大霉素耐药菌株
NL? 份及庆大霉素敏感菌株 "! 份。NP! 份粪肠球菌
及屎肠球菌中,高水平庆大霉素耐药菌株 NNQ 份及高
水平庆大霉素敏感菌株 LO 份。
!: 5" 基因芯片检测结果
以生化鉴定和临床常规药敏检测为标准,基因芯
片细菌鉴定各项指标的灵敏度均大于 Q?R,特异度均
大于 Q"R,假阴性率均小于 KR,假阳性率均小于
!R;基因芯片耐药检测各项指标的灵敏度均大于
QKR,特异度均大于 QSR,假阴性率均小于 ?R,假阳
性率均小于 NSR(表 K、表 L)。细菌鉴定指标和耐药
检测指标的 T$))$检验结果的值均大于 SG PL(表 ?),
提示生理生化鉴定法和药敏纸片法检测结果的一致
性较好。细菌鉴定指标和耐药检测指标配对卡方检
验结果的 U值均大于 SG SL(表 ?),提示芯片检测结果
与生理生化鉴定法和药敏纸片法检测结果在 QLR水
平上差异均无统计学意义。
5" 讨论
细菌是引发大多数感染性疾病的病原体,其中需
氧 M 4球菌与革兰阴性(M*$% =&:$0;F&,M 5)杆菌是临
床最常见的两类致病菌。M 4菌和 M 5菌由于细胞壁
等结构的不同,导致了药物对其作用机理及其耐药机
制存在显著差异,临床上对这两类细菌的临床用药具
有很大差别。故临床上的细菌鉴定和药敏结果有着
较重要的意义[P]。
随着人类社会的发展,引起感染的主要菌群也发
生变化;而且由于广谱头孢类抗菌药物的应用、各种
导管的使用、免疫抑制剂的应用,各种感染菌的耐药
率和耐药性越来越高。!SS! 年全国细菌耐药检测网
的统计结果提示,分离的 KS OPQ 株菌中,阴性菌比例
大于 ?SR,M 4菌的比例大于 OLR。随着临床感染率
的增加,临床医学对感染细菌学的检验提出了越来越
高的要求。对临床应用而言,细菌鉴定和相应的耐药
性检测是相辅相成,缺一不可的。临床上对细菌的常
规检验手段包括形态学检查,分离培养鉴定和药敏实
验等。这些方法操作繁琐、分段进行、耗时长而准确
性不十分理想。微生物自动鉴定和药敏系统应用于
临床微生物检验,使这一现象在大型医院有所改观,
但它完全基于细菌培养的表型鉴定方案,仍然具有内
在的缺陷。目前从标本采集到得到明确的细菌学检
验结果的时间较长,给临床对感染性疾病的及时治疗
带来了一定困难。基因芯片技术以其分析速度快、可
多指标并行检测、所需试剂及样品量少等优势,为解
决这些问题提供了新的科技手段。
本实验的目的是利用基因芯片技术并行地进行
细菌鉴定和耐药检测,临床上革兰染色简便快捷(操
作时间不足 NS %;=),因此进行了常见 M 4细菌鉴定与
耐药基因芯片检测的尝试。通过对 KKL 例 M 4细菌进
行鉴定与耐药基因芯片检测,结果提示 M 4细菌鉴定
与耐药检测基因芯片与目前较为公认临床实验室所
常用方法检测结果差异无统计学意义,灵敏度和特异
度较高,能够较为准确地鉴定出常见M 4菌的种类,并
!KN
万方数据
第 ! 期 王雅杰等:常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用
表 !" 生理生化鉴定法和基因芯片法检测结果的比较
#$% !" &’()$*+,’- ’. )/0,+1$2 $-3 1/4(+1$2
%$154*+6( +34-5+.+1$5+’- $-3 74-4 1/+)
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H-5
8,(1+19% D? D DC
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表 8" 基因芯片检测结果
#$% 8" 94,625, ’. 74-4 1/+)(L)
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M4*(%
2,(1+19% 74+%
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E:< CGN DF CCN >F AN ?A @N BA
H-( CGN BA CCN GC AN >F @N A>
H-5 CFN BA CCN @@ !N >F >N @@
I%+1/1**1# 7%(1(+4#/%((+4203*,/,//1) CFN GC C@N FF !N A> CN !A
I4/7,*1$%( 7%(1(+4#/%((+4203*,/,//1) CDN C@ C!N BG ?N >@ FN >D
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K1.0 *%9%* .%#+451/1# 7%(1(+4#/%(%#+%7,/,//1) CGN GD C@N ?F AN AG CN DA
可同时较为准确地检测到被测样本对常见几类抗菌
药物的耐药性,可较好的辅助临床诊断、治疗。
运用此项技术进行菌种的鉴定和进行耐药性的
检测,有多种优势:如多通量检测,检测一份标本,可
以同时获得包括菌种鉴定和该菌对多个临床常用抗
生素的敏感性等信息;简捷可靠的样品制备方法,使
提取细菌核酸快速简便、无需酶和有害化学试剂;多
重不对称 8E’ 技术进行特异扩增,使用长度不同的
上下游引物进行不对称扩增,可以较容易的进行多
重、一致的扩增。但本研究也有其缺点,即所设计芯
AD>
万方数据
首 都 医 科 大 学 学 报 第 !" 卷
表 !" 差异性和一致性比较
#$% !" &’()$*+,’- ’. /$*+$%+0+12 $-3 4’-,+,15-42
#$%&’ ()**) !
+),-&./)0 /%&$-/1/,)-/2$
34 56 789 :6 59
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K/FH 0&L&0 F&$-)B/,/$ .&@/@-)$,&
9(&$-&.2,2,,/) 56 "88 :6 59
片检测细菌须经过革兰染色确定为阳性,用该芯片检
测革兰阴性菌是没有意义的。在今后的研究中我们
会继续深入进行研究,以得到能够更好的应用到临床
细菌鉴定和耐药性检测的基因芯片。
6" 参考文献
[:]9 马越,李景云,张新妹,等6 !55! 年临床常见细菌耐药性
监测[M]6中华检验医学杂志,!55C,!8:A" C=6
[!]9 申正义,孙自镛,王洪波6湖北地区临床分离菌耐药性监
测[M]6中国抗感染化疗杂志,!55C,C:!>A !>86
[A]9 ;)00 D N,+)OO2 G (,(.EF G M,&- )06 #%&$-/1I/$F )$-/B/P
,.2Q/)0 .&@/@-)$,& F&$&@ R/-H D<4 B/,.2)..)I@[M]6 4$-/B/P
,.2Q 4F&$-@ ;H&B2-H&.,!55A,C8:A!75 A!7=6
[C]9 G).-/$&)E S,T/,).% S M,U)$@), <,&- )06 ;2..&0)-/2$ Q&P
-R&&$ -H& .&@/@-)$,& F&$2-I*& %&-&.B/$&% QI BE0-/*0&’ T;N
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[=]9 V&2$H&& U&&,;H22$FP3/O U&&,V&2PME$F (/B6 D&L&02*P
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[>]9 W)OE0&$O2 3 +,D2$)Q&%/)$ 3 G,W2@O.&@&$@O/I 4 G,&-
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(收稿日期:!558 5: :8)
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