转基因小鼠基因型鉴定小鼠组织DNA的取材及抽提
1 蛋白酶K储存液的配制
用超纯水彻底溶解蛋白酶K粉剂,使终浓度为10mg/ml,每管1ml分装,-20度保存备用。
2 裂解液配制
尿素 4M(240.24g/1000ml)
EDTA-2Na-2H2O 10mM ( 3.722g/1000ml)
Sarkosyl 0.5% ( 5g/1000ml)
...
小鼠组织DNA的取材及抽提
1 蛋白酶K储存液的配制
用超纯水彻底溶解蛋白酶K粉剂,使终浓度为10mg/ml,每管1ml分装,-20度保存备用。
2 裂解液配制
尿素 4M(240.24g/1000ml)
EDTA-2Na-2H2O 10mM ( 3.722g/1000ml)
Sarkosyl 0.5% ( 5g/1000ml)
Tris/HCl ( 1M, PH 8.0 ) 0.1M ( 100ml/1000ml )
NaCl 0.2M ( 11.688g/1000ml )
H2O 补足至1000ml
1000ml
3 小鼠组织取材
使用乙醇擦拭的手术剪刀剪少许鼠耳尖部组织,半个火柴头大小足够;或取小鼠尾部组织2-3mm即可。每次取材需用乙醇重新擦拭,如有条件可更换手术器械。
4 小鼠组织DNA抽提
将取材完毕的组织置于1.5ml 离心管中,加500ul 裂解液其中含有50ul蛋白酶K储存液,使用1ml移液器反复吹打后封管置于56℃水浴过夜,或期间反复拿出震荡。次日样本于室温12000rpm离心10min,转移上清于1.5ml 离心管中,加1ml无水乙醇,盖后振摇可见絮状沉淀。12000rpm 4℃离心20min。弃上清,加入预冷的70%乙醇洗涤,摇晃后12000rpm 4℃离心10min。重复洗涤步骤。
完全弃去上清,通风橱内待乙醇挥发,加500ul纯水吹打溶解(看DNA沉淀的量,300ul亦可。)取1- 2ul做PCR。
5 小鼠基因型的PCR鉴定
反应体系:
10×Taq buffer 1.0μl
dNTP (10mM) 0.2μl
MgCl2 (25mM) 1.0μl
Primer 1(10nM) 0.5μl
Primer 2(10nM) 0.5μl
Primer 3(10nM) 0.5μl
Tissue DNA 1.0μl
Taq polymerase 0.3μl
ddH2O 5.0μl
10.0μl
反应条件:
Step 1: 94℃ 5min
Step 2: 94℃ 1min
58℃ 30sec
72℃ 1min
重复Step 2 35个循环
Step 3: 72℃ 10min
Step 4: 4℃ Hold
本文档为【转基因小鼠基因型鉴定】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑,
图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。