用荧光染色法对柱状田头菇_Agrocybeaegerita_子实体担子和担孢子的

用荧光染色法对柱状田头菇_Agrocybeaegerita_子实体担子和担孢子的 () 南京农业大学学报 2000 , 23 3: 57,60 J ournal of N anjing A gricultural University ( )用荧光染色法对柱状田头菇 Agrocybe aegerita 3 子实体担子和担孢子的观察 3 3 33 3 鲍大鹏 南 王 谭 琦 潘迎捷 (上海市农业科学院食用菌研究所 , 农业部食用菌遗传育种重点开放实验室 , )上海市农业遗传育种重点实验室 , 上海 201106 摘要 运用荧光染色对 4 株不同地域来源的柱状田头菇子实体的担子和担孢子进行了观察 。结果显示 , 来自欧洲希 腊的 Ag8 、中国四川省的 Ag10 和台湾省的 AgT 菌株的有性繁殖结构特征是 4 孢双核 ; 而来自贵州省的 Ag9 菌株的有性繁 殖结构特征是双孢 4 核 。这种 4 核现象首次在蕈菌中观察到 。 关键词 柱状田头菇 ; 担子 ; 担孢子 ; 荧光染色 分类号 S6461190123 Observation on ba sidia and ba sidiospores of Agrocybe aegerita by fl uorescence sta ining Bao Dapeng , Wang Nan , Tan Qi and Pan Yingjie ( Key Lab of Edible Fungi Genetics and Breeding , Agricultural Ministry of China , Key Lab of Agriculture Genetics and Breeding of Shanghai , Edible Fungi Institute , )Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 201106 ABSTRACT Basidia and basidiospores of A . aegerita strains from different areas were observed by fluorescence staining and electronic () (microscope . The results showed that the structural characteristics of sexual propagation of Ag8 from Greece, Ag10 from Sichuan , ) () (Chinaand AgT from Taiwan , Chinais four basidiospores per basidium and two nuclei per basidospore . The structure in Ag9 from ) Guizhou , Chinais two basidiospores per basidium and four nuclei per basidiospore . The latter phenomenon was reported in cultivated mushroom for the first time . Key words Agrocybe aegerita ; basidium ; basidiospore ; fluorescence staining 柱状田头菇是一种不可多得的 、具有极大开发潜力的食用菌新品种 , 又是一种适于作为栽培蕈菌的 模式种和进行生理生化及遗传学方面研究的模式菌株 。国内外学者对柱状田头菇进行了多方面的研究 。 1 欧洲和日本的研究者认为柱状田头菇有性繁殖类型是属于四极性的异宗结合, 而中国的研究者则认为 2 ,3 柱状田头菇是属于次级同宗结合类型。出现这种差异很大的结论 , 是所研究的柱状田头菇属于不同 的分类种 , 还是其它原因 ? 作者运用荧光染色技术 , 对源于欧洲希腊和中国贵州 、四川 、台湾等省份的 柱状田头菇菌株的子实体进行了观察 , 了解它们的有性繁殖特征 , 以便从蕈菌有性繁殖结构的角度 , 为 澄清柱状田头菇分类上的混乱提供实验证据 。 1 和方法 111 供试菌株及培养基 柱状田头菇菌株 Ag8 、Ag9 、Ag10 和 AgT 分别来自欧洲希腊以及中国贵州省 、四川省和台湾省 , 均 3 国家科技攻关项目经费资助 。3 3 3 3 3 通讯地址 : 安徽农业技术师范学院 。通讯作者 Corresponding author 收稿日期 : 1999Ο11Ο08 由上海农业科学院食用菌菌种保藏中心提供 。 RD 培养基组成 : 葡萄糖 20 g , 蛋白胨 2 g , 酵母膏 2 g , MgSO7? HO 015 g , KHPO0146 g , KHPO422 4 2 4 1 g , 水 1 000 mL 。固体培养基在上述配方中加入 20 g 琼脂 。 112 试剂及仪器 () 荧光染料双苯并咪唑 Hoeshst 33258 Bisbenzimide为 Watson BioMedicals 产 品 。称 取 Hoeshst 3325810 mg ,加入 10 mL 重蒸水溶解 , 可适当加热 , 配制成 1 mg/ mL 母液 , 4 ?保存备用 。使用时 , 用磷酸缓 (μ) 冲液 p H712将母液稀释成 5g/ mL 的染色液 。 荧光显微镜摄像系统为 Olympus BX 60 及 PMΟ30 。 113 荧光显微镜观察材料的制备 11311 柱状田头菇菌丝形态的观察 将柱状田头菇菌种接种至平板中央 , 将无菌的盖玻片斜插在菌种 附近的培养基中 , 当菌丝长至盖玻片一半时 , 即可进行显微观察 。取一滴荧光染色液滴在载玻片上 , 用 一片附有菌丝的盖玻片覆盖在染色液上 , 5 min 后置荧光显微镜下观察 。 11312 柱状田头菇菌褶切片观察 取已经开伞并有孢子散发的柱状田头菇子实体 , 切取一部分菌盖 , 沿菌褶的横面做徒手切片 。取尽可能薄的切片置于滴有荧光染色液的载玻片上 , 盖上盖玻片 , 5 min 后 置荧光显微镜下 , 观察担子和担孢子梗的情况 。 11313 柱状田头菇孢子观察 收集柱状田头菇成熟子实体散发出的孢子 , 在载玻片上滴一滴荧光染色 液 , 取少许孢子置于其中 , 5 min 后置荧光显微镜下观察孢子中的核相 。 114 担子和担孢子扫描电子显微镜观察 取成熟柱状田头菇子实体的菌褶数片 , 置于 2 %的戊二醛中固定 7,10 d 。取出后用滤纸吸干残液 , 真空镀金后 , 用扫描电镜观察并摄影 。 2 结 果 211 柱状田头菇菌丝形态 对柱状田头菇菌株 Ag8 、Ag9 、Ag10 、AgT 的菌丝进行观察 , 结果所有菌株的菌丝细胞都含有双核和 明显的锁状联合结构 。 212 柱状田头菇担孢子梗数 其余品种绝大多数的担孢子梗数为 在 Ag8 、Ag9 、Ag10 、AgT 菌株中 , 仅 Ag9 担孢子梗数全部为 2 , () 4 , 少数担孢子梗数为 2 , 其比例在各菌株间不等 1。 表 1 柱状田头菇的担孢子梗数 aegerita Ta ble 1 Observation on basidia number of A . 观察的担孢子梗总 数担孢子梗为4 的个数 菌株 担孢子梗为2 的个数 Total number ofNumber wit hStrain Number with ΟBbiasidia observed basidia TetraΟbasidia 3()(82189 Ag8 684 ) 567 117 17111 (())Ag10 300 35 11167 265 88133 (())42 11129 330 88170 AgT 372 ()0 Ag9 419 419 100 3 ( 括号中数值为占总数的百分V率al u。esi n brackets are the percentaogf eB 2ibasidiaor Tetra2basidiai n total numbeorf observedb asidia So as in ) Table 2. 213 柱状田头菇担孢子中的核数 () 荧光染色的观察结果表明 , 担孢子梗数为 4 的品种 , 其担孢子中大多数为 2 个细胞核 图 1, 部分 () 为 1 个 ; 担孢子梗数为 2 的品种 , 其担孢子中大多数为 4 个细胞核 图 2, 部分为 2 个 , 偶尔可见 6 核 () 或 8 核孢子 表 2。 ( ) 第 3 期 鲍大鹏等 : 用荧光染色法对柱状田头菇 子实体担子和担孢子的观察 ?59 ? A grocybe aegerit a 图 1 Ag8 菌株的担孢子荧光染色照片 图 2 Ag9 菌株的担孢子荧光染色照片 ()()示 4 核担孢子 , ×1 600 示双核担孢子 , ×1 600 Fig. 2 Fluorescence photos of basidiospores from Ag9 Fig. 1 Fluorescence photos of basidiospores from Ag8 ( )show Tetra2nuclear basidiospores , ×1 600 ( )show Bi2nuclear basidiospores , ×1 600 表 2 柱状田头菇担孢子的核数 Ta ble 2 Number of nuclei in basidiospore of A . aegerita 观察数 含 1 个核 含 2 个核 含 4 个核 菌株 Numbero f spores Numbero f spores with Numbero f spores with Total number of Strain observed spor eswith one nuclea rtwo nucle ifour nucle i (())30 3166 96134 790 — Ag8 820 (())45 6179 618 93121 —Ag10 663 (())AgT 672 52 7174 620 92126 — ( ( ))162 71152 104 92185 Ag9 2 266 — 214 柱状田头菇担子和担孢子的电子显微镜观察 () ( 图 3, Ag9 菌株的担孢子梗数为 2 图 观察结果表明 , Ag8 、Ag10 和 AgT 菌株的担孢子梗数均为 4 ) 4, 与光学显微镜的观察结果一致 。4 个菌株的担孢子表面并无明显差异 , 在孢子的一端均有一个芽 孢子的一面呈凹陷状 。 孔 , 图 3 Ag8 菌株担子扫描电镜照片 图 4 Ag9 菌株担子扫描电镜照片 ()()示 4 梗担子 , ×4 500 示双梗担子 , ×4 500 Fig. 3 Scanning electron micrographs of basidia Fig. 4 Scanning electron micrographs of basidia ( )from Ag8 show Tetra2stem basidia , ×4 500 ( )from Ag9 show Bi2stem basidia , ×4 500 3 讨 论 4 个供试菌株的菌丝体中均观察到锁状联合 , 说明这些菌株均是双核菌丝体 , 并且都是通过锁状联 合的方式 , 在菌丝生长过程中将核物质平均分配给子细胞的 。在柱状田头菇的所有菌株中 , 都观察到了 孢子多核现象 。担孢子多核现象的产生主要有两种原因 : 一是对于双孢担子菌 , 核分配产生的双倍体核 经减数分裂生成 4 个单倍体核 , 平均分配到担孢子中 , 每个担孢子 2 个核 ; 二是对于 4 孢担子 , 减数分 裂生成的 4 个单倍体核 , 在孢子梗或孢子中又各自进行了一次有丝分裂 , 形成两个同性的核 , 这两个同 4 性核如果同时进入或保留在担孢子中 , 也形成双核担孢子。此外 , 减数分裂的不正常 , 核分配不均 衡 , 亦可导致多核现象的出现 。 结合上述资料推测 , Ag8 、Ag10 和 AgT 的担孢子中含有双核的原因可能有两个 : 其一 , 由于减数分裂生成的 4 个单倍体核进入 4 个担孢子后又进行了一次有丝分裂 , 并且每个单倍体核生成的两个核都保 留在担孢子中 , 从而形成了 4 孢双核 ; 其二 , 在只分化出两个担孢子梗的担子中 , 减数分裂形成的 4 个 单倍体核两两进入到仅有的两个担孢子中 , 从而形成双孢双核 , 这种情况在以上 3 个菌株中较少发生 。 至于 Ag9 的双孢 4 核现象 , 可以解释为 : 减数分裂生成的 4 个单倍体核两两进入每个担孢子中 , 然后 2 个核又均在担孢子中发生了一次有丝分裂 , 并且 4 个核都保留在担孢子中 。极少数担孢子中的 1 个或 2个单倍体核会发生两次有丝分裂 , 就形成了 6 核或 8 核担孢子 。 担孢子梗和担孢子中核的数目应该是 判定蕈菌有性生殖类型的重要依据 , 常见栽培蕈菌如草菇 、双 7 ,8 孢蘑菇 、香菇等的有性繁殖特征各不相同, 除草菇属于典型的初级同宗结合类型外 , 具有 2 个孢子 梗 、多数担孢子中具有双核的双孢蘑菇为次级同宗结合 , 而异宗结合的香菇和金针菇都具有 4 个孢子 梗 , 每个担孢子中含有 1 到 2 个核 。 本研究发现 , 在柱状田头菇中就其具有的孢子梗数和担孢子中细胞核数而言 , 可分为两类 : Ag8 、 Ag10 和 AgT 3 个菌株的 4 孢双核和 Ag9 的双孢 4 核 。前者的形态特征与异宗结合的金针菇基本一致 , 且 1 欧洲学者 Meinhardt F. 认为 , 欧洲起源的柱状田头菇属于双因子的异宗结合类型, 故笔者认为 , Ag8 、Ag10 和 AgT 这 3 个菌株在遗传上也是属于双因子的异宗结合类型 。而 Ag9 菌株较为特殊 , 其担孢子梗 数为 2 的特征与次级同宗结合的双孢蘑菇比较接近 ; 但 Ag9 菌株的大多数担孢子都是 4 个核 , 又不同于 孢子为双核的双孢蘑菇 ; Ag9 菌株双核菌丝呈锁状联合 , 又类似于异宗结合的 4 孢单核的香菇 。因此 , 双孢 4 核是 Ag9 特有的遗传现象 , 该现象也是首次在栽培蕈菌的担孢子中发现 , 推测 Ag9 菌株可能具有介于次级同宗结合和异宗结合之间的一种生活史类型 。但要证实这一切 , 还需进一步收集菌株 , 做有关 单孢萌发菌丝的杂交 、交配型和单孢结实等方面的研究 。在一个物种内出现两种不同的担孢子梗数和担 孢子中核的数目 , 是这个物种多样性的一种表现 , 还是由于它们处于不同的进化及发育阶段 , 或者说 Ag9 菌株本身就是一个新种 , 也有待于进一步的研究 。 参 考 文 献 () 1 Meinhardt F , Leslie J F. Mating types of Agrocybe aegerita . Curr Genet , 1982 5: 65,68 () 丁文奇 1 柳环菌的生活史初探 1 食用菌 , 1987 1: 31,32 2 () 张引芳 , 王镭 1 柱状田头菇的遗传生活史及品种选育 1 食用菌学报 , 1995 , 2 2: 13,17 3 戴芳澜主编 1 真菌的形态和分类 1 北京 : 科学出版社 , 1987. 264,265 4 Shigeyuki , Murakami , Tsuneo Takeemaru. Nuclear behavior during basidiospore formation in L . edodes . Tran Mycol Soc J apan , 5 1985 , 26 : 253,260 () 李秀玉 , 颜耀祖 , 申荣段 1 草菇减数分裂和担孢子形成细胞核行为 1 真菌学报 , 1991 , 10 1: 72,78 张树庭 , 林芳灿主编 1 蕈菌遗传与育种 1 北京 : 中国农业出版社 , 1997. 65,119 6 杨新美主编 1 中国食用菌栽培学 1 北京 : 农业出版社 , 1988. 93,102 , 247,493 7 8 () 责任编辑 张耀栋 是雅蓓