免疫组化步骤(脱蜡到封片)

免疫组化操作步骤 1.切片使用防脱载玻片 2.将脱蜡修复液(CBS pH6.0)以1:20蒸馏水稀释,分别置于A缸和B缸中;(即: 各取10ml浓缩的脱蜡修复液与190ml蒸馏水配成200ml脱蜡修复工作液两缸。) 3.将配好的工作液(A缸和B缸)放在加水高压锅中,锅盖无需盖紧,盖上染色缸盖 子煮沸后,打开将切片放入A缸中并盖上染色缸盖子,盖紧高压锅锅盖继续开火煮,高压喷气后3分钟停止。关闭电磁炉电源,室温冷却15分钟。 4.将切片从A缸中取出,放入B缸中,然后自然冷却至室温,才能将组织切片取出。 *使用过的脱蜡修复液不能重复使用;抗原修复时必须保证组织切片完全浸泡在液体中。 5.用PBS清洗液洗3次,每次3分钟。 6.用蒸馏水将浓缩型内源性过氧化物酶阻断剂稀释10倍,滴加1-2滴(50-100ul) 覆盖组织或细胞,室温孵育10-20分钟。蒸馏水冲洗30秒X3次。 7.滴加5% - 10%的山羊血清封闭液(用PBS按1:10~ 1:20稀释),室温孵育5 –10 分钟。甩去血清,勿洗。 8.滴加第一抗体:鼠抗人Actin(α-SMA)室温孵育60分钟。 9.用PBS清洗液洗3次,每次3分钟。 10.甩去PBS液,滴加二抗增效剂,室温下孵育20分钟。 11.用PBS清洗液洗3次,每次3分钟。 12.甩去PBS液,滴加二抗羊抗鼠,室温下孵育20-30分钟。 13.用PBS清洗液洗3次,每次3分钟。 14.DAB显色剂 于1ml蒸馏水中分别滴加A液、B液、C液各50ul,混匀后既得显色剂工作液,须于30分钟内使用。甩去PBS液,滴加50ul显色剂覆盖切片组织,孵育5分钟,蒸馏水冲洗终止显色;(显色时间为2 – 5分钟,可在显微镜下观察显色情况。) 15.自来水冲洗,苏木素复染,PBS冲洗返蓝。 16.切片梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 (以上操作步骤仅适用于购买自广州深达生物制品技术有限公司的相关试剂)