葡多酚对肝细胞内Ca^2＋浓度和增殖活性的影响

葡多酚对肝细胞内Ca^2＋浓度和增殖活性的影响 葡多酚对肝细胞内Ca^2，浓度和增殖活性 的影响 第35卷第5期 2006年9月 卫生研究 JOURNALOFHYG1ENERESEARCH Vo1.35No.5 Sep.2006567 文章编号:1000—8020(2006)05—0567—03 葡多酚对肝细胞内Ca浓度和增殖活性的影响 钟进义李杰刘辉张社华 青岛大学医学院医学营养所,青岛266021 ? 论着? 摘要:目的探讨葡多酚(GPC)对正常肝细胞和受乙醇损伤肝细胞内Ca2浓度与细胞增殖活性的影响. 将大鼠正常肝细胞和乙醇损伤肝细胞加入不同剂量GPC共同培养,用Fura一2荧光测定肝细胞内ca2 浓度,用M1Tr法测定细胞增殖活性.结果?正常对照组和乙醇对照组的Ca2浓度分别为(108.26?14.17) 和(651.24?47,95)nmol/L,二者差异有显着性意义(P<0.05);中,高剂量GPC组均较乙醇对照组显着性降低 (P<0.05).?加入GPC的正常肝细胞内Ca2浓度依次为:细胞外液含Ca2组>外液无ca2组>正常对照 组.?正常肝细胞和乙醇损伤肝细胞的中,高剂量GPC组细胞增殖活性均较正常对照组和乙醇对照组显着 性升高(P<0.05).结论GPC可通过增加细胞外液Ca内流和胞内Ca"库的释放两 种途径升高正常肝细 胞内ca2浓度,提高细胞增殖活性,并可抑制乙醇引发的肝细胞内Ca2浓度异常升 高(超载)和细胞增殖活 性损伤. 关键词:葡多酚肝细胞增殖活性钙离子浓度 中图分类号:Q593.1R979.5文献标识码:A Effectsofgrapeprocyanidinsontheconcentrationofintracellular calciumandtheproliferationactivityofthehepatomaceHs ZhongJin—yi,LiJie,LiuHIli,ZhangShe—hua NutritionInstitute,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China Abstract:0bjectiveToinvestigatetheeffectsofgrapeprocyanidins(GPC)onconcentrationofintracellularcalcium andtheproliferationactivityofnormalhepaticcellsandthehepaticcellinjuriedbyalcoho1.MethodsRathepaticcells andthecellinjuriedbyalcoholwereculturedwithdifferentconcentrationofGPC.Theproliferationactivityand, concentrationofintracellularcalciumofthehepaticcellsweremeasuredbyMTIPassayandFura一2fluorescencemethods. Results? Theconcentrationofintracellularcalciumofthenormalcontrolgroupandalcoholinjurygroupwere(108.26 ?14.17)and(651.24? 47.95)nmol/Lrespectively,andthatofboththehighandthemediumdoseGPCgroupswere lowerthanthealcoholinjury"group,alldifferencesaresignificant(P<0.05).? Theconcentrationofintracellularcalcium inthenormalhepaticcellstreatedwithGPCisthegroupwithcalciumofextracellularfluid>thegroupfreefromcalcium ofextracellularfluid>thenormalcontrolgroup.? TheproliferationactivityofthehighandthemediumdoseGPCgroup ofnormalhepaticcellandthecellinjuriedbyalcoholwerehigherthanthenormalcontrolgroup andalcoholinjurygroup, alldifferencesaresignificant(P<0.05).ConclusionGPCcanraisetheintracellularcalciu meoncentrationofnomal hepaticcellbyincreasingextraeellularfluidcaintroaffluxionandreleasefromcalciumpool,a ndenhancetheproliferation activityofhepaticcells.Italsocaninhibittheabnormalrise(overload)ofintracellularcalcium concentrati0nandthe proliferationactivityinjury"ofhepaticcellinducedbyalcoho1. Keywords:grapeprocyanidins,hepaticcell,proliferationactivity,concentrationofintracell ularcalcium 葡多酚(grapeprocyanidins,GPC)是从新鲜葡萄籽中提取 的一种天然植物多酚物质.有研究报道,GPC具有抗氧化和 促进细胞增殖活性等多种生物学功效.钙离子(Ca2)作 为细胞信号转导的第二信使,对控制细胞的增殖有重要作 用.本研究采用体外细胞培养并应用Fura-2荧光等技术, 基金项目:国家自然科学基金资助项目fNo.30271127) 作者简介:钟进义,男,教授,博士生导师,E-mail:zh.ngjyO3@ yahoo.corn.ci1 探讨了GPC对正常肝细胞和乙醇损伤肝细胞内Ca2浓度的 影响作用及其与增殖活性的关系. 1材料与方法 1.1主要材料 1.1.1葡多酚将新鲜葡萄籽粉碎后用乙醇浸提法制备,含 量>99%,品由日本岛田株式会社提供. 1.1.2实验动物山东省实验动物中心提供昆明小鼠,体重 22,24g,许可证号:SCXK(鲁)2o03o0l0. 568卫生研究第35卷 1.1.3主要试剂RPMI.1640培养基,胎牛血清购自美国 GIBCO公司;四甲基偶氮唑盐,胶原酶,Fura一2/AM,TritonX一 100,EGTA购自德国Sigma公司.实验用水均为超净水. 1.1.4主要仪器c0培养箱为日本TABAIESOEC公司产 品;酶标仪为美国BECKMAN公司产品;RF-540荧光分光光度 计为日本岛津公司产品. 1.2实验方法 1.2.1肝细胞悬液的制备按照Seglen法略加修改:实验 小鼠戊巴比妥钠麻醉,经37~C水浴预热的灌流液和37?, 0.o5%的胶原酶肝脏灌流后取下肝脏,剪碎后于37?振荡消 化30min.三层无菌沙布过滤制成细胞密度为2×10个/ml,细 胞活力大于95%的肝细胞悬液备用. 1.2.2细胞增殖活性测定取肝细胞悬液调节细胞密度为1 ×10个/ml,接种于96孔培养板,每孔0.1ml.共分正常肝细 胞和乙醇损伤肝细胞两种处理,每种处理均设一个对照组和 3个GPC剂量组,给予GPC剂量分别为0,10,50和100mg/L. 乙醇损伤肝细胞组给予乙醇的剂量为100mmol/L.每组设5 个平行样,37?,5%co2培养24h后,每孔加入5g/LM1rr溶液 l0"l,继续培养4h,加入0.1ml的二甲基亚砜(DMSO),酶标仪 于492nm检测溶液的吸光值(A),各平行组细胞增殖活性以 平均光密度示. 1.2.3肝细胞内Ca2'浓度测定参照Fura.2荧光法进行测 定,主要步骤为:取肝细胞悬液3ml加入培养瓶中,GPC剂 量分组和处理方法同前.37?培养10h,调节密度为4×l06 个/ml,加入终浓度为5~moYL的Fura.2/AM溶液,经37?水浴 避光温孵30min进行荧光测定. 1.2.4正常肝细胞内钙库释放影响的测定设一个正常对 照组和细胞外液含Ca2与不含Ca2'两个实验组,调节细胞密 度为2×l0b个/ml,取3ml加入终浓度为lOOmg/L的GPC和 Fura-2/AM溶液(正常对照组除外),37?水浴30rain进行荧光 测定.每组设5个平行样. 1.2.5荧光测定条件与结果计算用激发光波长分别为 340nm和380nm,发射光波长为500nm测定各管荧光强度并根 据[ca'].=Kd×(R—R一)×/[(一R)×F]计 算胞内ca2浓度.式中:Kd为Ca2'结合Fura一2的解离常 数,R为各测定点F与F荧光强度比值,R和,分别 为最大和最小,即在先后加入Tritonx.100溶液EGTA溶液测 定荧光强度.F和F分别代表胞外ca2浓度为0及饱和 时,380nm激发波长的荧光强度. 1.3统计学处理 增殖活性A值和ca2'浓度以均数?标准差(;?s)表示, 并采用SPSS11.0统计软件进行数据处理. 2结果 2.1正常肝细胞 由表1可见,同正常对照组比较,中剂量组和高剂量组的 细胞增殖活性与细胞内ca2浓度均显着性升高,且两组之间 的差异亦有显着性意义(P<0.05). 2.2乙醇损伤肝细胞 由表2可见,乙醇对照组与低剂量GPC组之问细胞增殖 活性与ca2浓度的差异无显着性意义(P>0.05).中剂量组 和高剂量组细胞增殖活性均较乙醇对照组降低,而Ca2浓度 则升高,差异有显着性意义(P<0.05).乙醇对照组的ca2 浓度高于正常对照组3倍以上,呈超载状态. 表1正常肝细胞增殖活性与Ca2浓度测定结果 Table1Theresultofthenormalhepaticcellproliferation activityandintracellularcalcimconcentration{i?s1 注:(1)与正常对照组和低剂量GPC组比较P<O.05,(2)与中剂 量GPC组比较P<0.05 表2乙醇损伤肝细胞增殖活性与Ca浓度测定结果 Table2TheproliferationactivityandintrB.eu'llarcalcium concentrationofthehepaticcellinjuriedbyalcohol(i?) 注:(1)与乙醇对照组和低剂量GPc组比较P<0.05,(2)与中剂 量GPC组比较P<0.05 2.3GPC对肝细胞内钙库释放的影响 细胞外液钙为O时,肝细胞ca浓度为(142.75?19.64) nmol/L,高于正常对照组(1l0.23?12.34)nmol/L,但低于细胞 外液含Caz组(181.51?l8.56)nmol/L,差异均具有显着性意 义(P<0.05). 3讨论 生理情况下,肝细胞外液ca浓度较细胞内ca浓度高 4个数量级,细胞内ca2浓度升高是许多细胞增殖分裂的早 期变化特点.本实验正常肝细胞结果显示,中剂量和高剂 量GPC组肝细胞增殖活性和ca浓度均较正常对照组有明 显升高,呈现明显剂量一效应关系,表明GPC具有促进正常 肝细胞增殖活性和升高肝细胞内ca2浓度的作用. 比较乙醇损伤肝细胞增殖活性的实验结果可见,乙醇对 照组和低剂量GPC组的肝细胞增殖活性均较正常对照组显 着性降低.中剂量和高剂量GPC组的肝细胞增殖活性则较 乙醇对照组显着性升高,且高剂量GPC组升高幅度大于中剂 量组.表明GPC可有效抑制乙醇对肝细胞增殖活性的损伤. 乙醇损伤肝细胞内ca浓度测定结果显示,乙醇对照组 和低剂量GPC组的ca2浓度均高于正常对照组3倍以上.呈 ca2超载状态,表明乙醇引发了肝细胞膜相结构的组织和功 能损伤,导致细胞内外ca2平衡失常.中剂量和高剂量GPC 组的ca"浓度均低于乙醇对照组并呈现明显剂量一效应关 系,表明GPC对乙醇引发的肝脏内ca2浓度异常升高有一定 的抑制作用. 本实验关于正常肝细胞内ca2来源结果还可见,细胞外 液钙为GPC中,高剂量组肝细胞ca2浓度高于正常对照组. (下转第572页) 572卫生研究第35卷 3周5周9周11周 四A1一A2圈B口C口D 围3不同实验阶段络组白色脂肪组织激素敏感性 脂肪酶mRNA的峰面积扫描结果 Fig.3Theratio0f~L/p-actinapex81"P~inWATat differenttreatments 脂肪组织激素敏感性脂肪酸酶表达的影响.结果表明,高蛋 白,高不饱和脂肪酸,高饱和脂肪酸构成饲料组大鼠的体重明 显低于高碳水化合物组,其中高不饱和脂肪酸组的体重,体脂 含量和血糖水平均得到了显着改善;而高蛋白组大鼠尽管体 脂含量明显降低,但血糖水平未被降低反而升高;高饱和脂肪 酸组大鼠的体脂含量和血糖水平均未得到明显改善.提示, 断乳后进食高不饱和脂肪酸构成饲料有助于缓解后续高脂膳 食大鼠的肥胖形成,改善血糖异常. 已知由肥胖并发糖尿病等症的危险与肥胖者体内脂肪含 量过高密切相关,控制体内脂肪含量可以显着缓解肥胖并发 其他疾病的风险.许多研究证实,脂肪组织HSL表达水平与 体脂含量相关.因此,本研究动态观察了不同处理阶段各组 脂肪组织HSL的表达水平,结果发现高不饱和脂肪酸组HSL 基因表达水平持续升高;提示该组动物体脂含量明显降 低与HSL基因表达持续增加有关.推测,断乳后不同饲料构 成可能通过持续影响基因表达,影响高脂膳食大鼠的体脂含 量及体重,进而程序性影响的肥胖发生.支持Alan提出的早 期营养环境可能持续影响基因表达,进而影响成年疾病的发 生的假说".当然,以上只是本研究的初步结果,对于基因表 达在早期营养影响后续肥胖中的重要作用,可通过缩短动态 观察的间隔时间,增加观察密度,绘制基因表达的动态曲线来 进一步明确. 4参考文献 1St—OngeMP,JonesPJ.Physiologicaleffectsof triglycerides:potentialagentsinthepreventionofobesity 132:329—332 2KerstenS.Mechanismofnutritionalandhormonal lipogenesis.EMBOReports,2001,2(4):282—286 medium-chain JNutr,2002, regulationof 3CurhallGC,CherowGM,WillettWC,eta1.Birthweishtandaduh hypertenssionandobesityinwomen.Circulation,1996,94:1310?1315 4SeidmanDS,LaorA,GaleR,eta1.Alongitudinalstudyofbirthweight andbeingoverweightinlateadolescence.AmJDisChild,1991,145: 782.785 5PondWG,Mersmann?,YenJT.Severefeedrestrictionofpregnantswine andrats:effectsonpostweaninggrowthandbodycompostionofprogeny.J Nutr,1985,115:179一l894 6McCanceRA.Foodgrowthandtime.Lancet,1962,2:271—272 7AlanL.Programmingbyearlynutritioninman.In:BockGR,eta1.The childhoodenviromentandadultdi8ease.Chichester:Wiley,1991.38.55 8张晓宏,孙长颢,王淑然,等.断乳后不同饲料构成对高脂膳食大 鼠肥胖发生的影响.卫生研究,2005,34(4):439.441 (2005.11.07收稿) (上接第568页) 说明GPC促进了肝细胞内钙库的释放.细胞外液含ca组 较细胞外液无钙组显着性升高,又说明GPC可能还通过促进 细胞外钙的内流升高肝细胞内Ca2浓度.故可以认为GPC 可能通过促进细胞内钙库的释放及细胞外钙内流两种途径升 高肝细胞内Ca2浓度. 结合本文结果可以认为,GPC可通过促进细胞外液ca 内流和胞内Ca"库的释放两种途径提高正常肝细胞Ca"浓 度,促进其增殖活性,对乙醇引发的肝细胞增殖活性损伤和 ca浓度异常升高均有抑制作用.正常肝细胞和乙醇损伤肝 细胞内ca2浓度与细胞增殖活性有密切关系,提示GPC可通 过肝细胞内ca2浓度的调控而影响肝细胞增殖活性. 4参考文献 1T'akahashiT,KamimuraA,ShiraiA,eta1. Severalselectiveprotein kinaseCinhibitorsincludingprocyanidinspromotehairgrowth. 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