木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)测定法
木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)测定
法
印染(2011No.2)
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2
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木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)测定法
沈诚,李戎,胡婷莉,阎克路
(东华大学国家染整工程技术研究中心,上海201620)
摘要:采用DNS法研究不同稀释倍数,底物用量,pH值和反应温度对木聚糖酶活力的影响.结果表明:木
聚糖酶的活力随酶稀释倍数,底物木聚糖量的提高而增加,但应控制好酶的稀释倍数和底物用量,否则会引
起测定误差.酶处理反应的较佳
为:时间20min,pH值6,反应温度6o.木聚糖酶在6o?恒温稳定0
—
4h,相对酶活都在85%以上,稳定性较好.其它前处理用酶制剂对木聚糖酶活力的影响不明显,不同类型
的化学助剂对木聚糖酶的影响不同.
关键词:测试;木聚糖酶;活性
中图分类号:TS197文献标识码:C文章编
号:1000—4017(20110)02—0035—05
DeterminationofxylanaseactivitywithDNSmethod
SHENCheng,LIRong.HUTing一1i,YANKe—lu
(NationalEngineeringResearchCenterforDyeingandFinishingofTextiles,DonghuaUniversity-Shanghai201620,China)
Abstract:Thearticlestudiestheeffectofdifferentdilutiontimes.themassofsubstrate,pHvalueandreactiontemperatureon
xylanaseactivity.Theresultsshowthat.xylanaseactivityincreasedwiththeincreaseindilutiontimesandthemassofSUb-
strate.However,theincreaseofdilutiontimesandthemassofsubstrateshouldbecontrolledproperly:otherwiseitwilllead
tomeasurementerror.TheoptimumreactiveprocessispHvalue6.0.reactingat60oCfor20min.Thexylanaseisplacedat
6o?
for4h.withover85%ofthexylanaseactivitymaintained.andhasgoodstability.Theeffectofotherenzymepretreat-
mentonxylanaseactivityisnotobvious.Theinfluenceofdifferentchemicalagentsonxylanaseisdistinguished.
Keywords:testing;xylanase:activity
O前言
生物酶精练工艺作为节能降耗,无污染的印染清
洁生产工艺?,近年来受到国内外的普遍关注.它作
用条件温和,耗水量和排放废水COD值低,对棉纤维
损伤小,是目前公认的碱煮练的理想替代工艺,显示出
很好的应用前景.然而,酶精练工艺对棉织物中的非
纤维素杂质,如蜡质和果胶质,尤其是棉籽壳的去除效
果较差,限制了其工业化应用l3J.
木聚糖是植物半纤维素的主要成分,为自然界中
广泛存在,含量仅次于纤维素的可再生多糖资源,占细
胞干重的7%一35%t4].木聚糖酶是一类可将木聚糖
降解成低聚糖和木糖的复合酶系.它以内切方式降解
木聚糖主链架的13—1,4一木糖苷键,其水解产物主要是
木二糖和木寡糖,少量的木糖和阿拉伯糖.木聚糖酶
对棉籽壳的主要组分半纤维素有专一的降解作用.因
此,提高木聚糖酶对棉籽壳的降解作用,能够最
收稿日期:2010—08—16
基金项目:国家科技支撑项目(2009BAE88B02),中央高校基本科研业
务费专项资金资助.
作者简介:沈诚(1987一),男,硕士研究生,主要研究方向为棉织物的
生物酶前处理.
通讯作者:李戊,e—mail:lirong@dhu.edu.an.
大程度地提高复合酶对棉籽壳的降解效果.
酶活是衡量酶生物活性的重要指标,但目前尚无
木聚糖酶酶活测定的标准方法.常用的DNS(3,5-二
硝基水杨酸)法l,J,采用比色法测定还原糖的生成量,
从而获得木聚糖酶的活力J.木聚糖酶水解木聚糖底
物生成的还原性糖,可在煮沸条件下与DNS显色剂生
成棕红色的氨基化合物.在一定范围内,还原糖的生
成量与反应液的颜色强度成正比.该法操作简便,显
色稳定,重现性好,且无需特殊的仪器设备,是众多科
研单位公认的木聚糖酶检测方法.
1试验
1.1仪器设备
电子天平(精度0.0001g),pH计,可见分光光度
计,恒温振荡水浴锅,秒表,刻度试管,移液管,容量瓶,
烧杯.
1.2材料
木聚糖(Sigma公司),D(+)一木糖(国药集团化学
试剂有限公司),木聚糖酶,淀粉酶,纤维素酶,果胶酶,
脂肪酶(诺维信公司),3,5一二硝基水杨酸(DNS),酒石
酸钾钠,苯酚,偏重亚硫酸钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢
钾,醋酸,醋酸钠,氢氧化钠,十二烷基磺酸钠,十二烷
35
印染(21111No.2)WWW.c~Ifn.C011”1.Cll
基苯磺酸钠,平平加0,EDTA,JFC,阳离子助剂,硫酸
铝,硫酸亚铁,硫酸锰.
1.3试剂与溶液的配制
(1)DNS试剂
取3,5一二硝基水杨酸7.5g,充分溶解于500mL
蒸馏水(蒸馏水先沸煮10rain后,冷却近室温)中,逐
步加入14gNaOH.随后,分别依次加入216g酒石酸
钾钠,5.5mL苯酚(50?水浴溶解),6g偏重亚硫酸
钠(溶解过程中可加入适量蒸馏水).待其充分溶解
后,定容至looomL,放人棕色瓶中静置1,5d,待用.
溶液每月配制一次,平时使用时可倒少量于小瓶中,其
余放人冰箱中静置.
(2)o.25g/LD(+)一木糖
用电子天平准确称取0.025g木糖,充分溶解后,
定容至100mL.
(3)pH值缓冲溶液
分别取不同量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾,用pH
计配制pH值为5,6,7和8.8的缓冲溶液.
同理,pH值为4的缓冲液采用醋酸缓冲液配制,
pH值为l0的缓冲液采用碱性缓冲液配制.
(4)木聚糖底物
采用相应的pH缓冲液配制.
1.4I)NS法酶活测定
1.4.1D一(+)一木糖标准曲线的绘制
在刻度试管中加入2.0,2.5,3.0,3.5,4.5和
5.5mL的0.25g/LD一木糖溶液,再分别加入DNS试剂
5.0mL,加蒸馏水分别定容至12mL.加热至沸,保持
8rain,充分显色,冷却后定容至25mL.在另一容量瓶
中加入5.0mLDNS试剂,定容至25mL,作为参比溶
液.在540nm处,测定各溶液的吸光度,并以D.木糖
质量浓度C为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准
曲线.
A=m?C+n(1)
式中:A——溶液吸光度
m——绘制的标准曲线的斜率
C——D.木糖质量浓度
n——绘制的标准曲线的截距
1.4.2木聚糖酶酶活测定
试验中,1mL酶在一定温度和pH值条件下,1h
分解木聚糖产生1mgD(+)一木糖,视为一个酶活力单
位.
取1mL经稀释的酶液,加入5mL缓冲溶液,沸煮
10min(灭活木聚糖酶)后加人底物木聚糖溶液.处理
一
定时间后,加入DNS显色8min,得到参比液.
另取木聚糖溶液1mL于刻度试管中,加人不同
pH值的缓冲溶液5mL,在一定温度的水浴中平衡
5rain.加人稀释后的木聚糖酶溶液1mL,摇匀并开始
计时.酶处理t时间后,迅速加入DNS试剂5mL,并
将刻度试管放人沸水浴中显色8rain,冷却,定容至
25mL.以参比液为空白,采用分光光度计在540nm下
测定溶液吸光度.如果吸光度过大,可以进行适当稀
释后测试.按式(3)计算酶活.
c:(A—n)/m(2)
U=(c×0.025L)/(t×1mL)(3)
式中:C——生成木糖的质量浓度(mg/L)
——
溶液吸光度
——
木聚糖酶酶活
0.025L——显色后定容体积
,——酶反应时间(h)
1mL——木聚糖酶体积
2结果与分析
2.1酶稀释倍数的影响
将1mL木聚糖酶分别以蒸馏水稀释100,10000
倍,并于缓冲溶液pH值8,反应温度60?,反应时间
30rain条件下测定酶活,见图1.
700o0
60000
50000
嚣40000樊30000
20000
10000
0
酶的稀释倍数
图1木聚糖酶稀释倍数与酶活的关系
理论上,酶的活力与其稀释倍数无关,即不同稀释
倍数下测得的酶活为定值??.但图1中,酶的稀释倍
数不同,测得的酶活也不相同.这可能是由于底物木
聚糖的浓度与酶的浓度不适应引起的.由于木聚糖的
浓度相对很低,酶的稀释倍数在10000以内时,酶的
浓度仍然相对太大,底物木聚糖可全部被水解.这种
情况下,酶的稀释倍数越大,酶活越高.但需要强调的
是,稀释倍数很大,会导致较大的滴定误差.所以,本
试验中稀释10000倍后不再继续稀释.
2.2底物用量的影响
取l,2,3,4,5和6mL10.00g/L木聚糖溶液于6
个刻度试管中,然后依次向各试管中加人5,4,3,2,1
和0mLpH值为8的缓冲溶液.在60?水浴中平衡
木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)渊定法印染(2011No.2)
5min,加入稀释5000倍和10000倍的木聚糖酶溶液
1mL,反应30min,其余操作参照酶活测定方法.结果
如图2所示.
200000
180000
16O000
鉴140000露
120000
冀100000
80000
长60000
40000
20000
加入木聚糖的量/mL
图2木聚糖加入量与酶活的关系
由图2可以看出,木聚糖酶酶活与底物用量呈线
性关系,底物用量越多,酶活越大.加人同量的木聚糖
底物,酶溶液稀释10000倍时所测得酶活比稀释5O00
倍高一倍.但是,由于底物本身并非为澄清溶液,底物
用量增加会影响其吸光度的测量.因此,底物的加入
量不宜过多.
2.3木聚糖酶处理时间
取1Og/L木聚糖2mL(酶稀释10000倍和5000
倍)或4mL(酶稀释10000倍),水浴温度60?,缓冲
溶液pH值8,酶处理时间2,40min.测试不同处理
时间下的木糖生成量和酶活,结果见图3和图4.’
\
烬
罐
留
冀
长
3
\
bo
\
例
爨
长
木聚糖酶处理时间/min
图3酶处理时间与酶活的关系
木聚糖酶处理时间/min
图4酶处理时间与木糖生成量的关系
从图3可以看出,木聚糖酶处理时间越短,计算得
到的酶活越大.酶稀释10000倍,木聚糖加入量为
2mL时,酶处理2min,酶活计算值可达1.1×10.;酶处
理时间为5min时,酶活计算值为1.7X10,变化明
显.酶处理时间为2,15min,酶活计算值差异较大;
酶处理时间超过15min,酶活的计算值变化逐渐减小.
在底物分解速率呈线性条件下选择酶处理时间比
较适宜.图4中,酶处理时间0,20min,木糖的生成
速率大致在线性范围内;酶处理时间为20,30min,木
糖浓度增加趋缓.综上,选择酶处理时间为20min.
2.4木聚糖酶pH值
木聚糖酶用量1mL(稀释倍数5ooo),5g/L木聚
糖1mL,酶处理温度6O?,酶处理时间20min.调节
酶溶液pH值为4,5,6,8,8.8和10,考察pH值对木聚
糖酶酶活的影响,见图5.
\
癌
落
嚣
?受冲j积cpH
图5缓冲液pH值与酶活的关系
由图5可以看出,木聚糖酶pH值为6时,其活性
最高;pH值为5,7和8.8时,木聚糖酶也都保持较高
的活力;pH为4和lO时,木聚糖酶处理木聚糖的活力
降低,说明酸性或碱性过强都会影响酶的活力.木聚
糖酶较佳pH值为6.
2.5木聚糖酶最佳反应温度
木聚糖酶用量1mL(稀释倍数5000),5g/L木聚
糖1mL,酶处理时间20min,缓冲溶液pH值8.分别
在温度50,60,7O,80和9O?下考察木聚糖酶的活力,
见图6.
26000
24000
22000
20000
龌18000
墓16000藤14000
长12000
10000
8000
酶处理温度/~C
图6处理温度与木聚糖酶酶活的关系
由图6可见,木聚糖酶的较佳反应温度为6O?;
处理温度为50和70?时,木聚糖酶也保持有较高的
活力;但温度为80和90?时,酶的活力降低比较明
印染【2011No.2)WWWoedfn.C0111.CII
显.因此,木聚糖酶的处理温度以50—70?为佳.
2.6木聚糖酶恒温稳定性
各取1mL木聚糖酶液(稀释5000倍)于刻度试
管中,分别加入5mLpH值为6的磷酸缓冲液和pH值
为8(NaCO和自来水调节)的缓冲溶液,于6O?水
浴中恒温稳定1,6h;随后加人5L木聚糖溶液
1mL,酶处理20min,加入DNS显色测定酶活.结果
如图7和图8所示,以恒温稳定0h得到的酶活为
100%.
烬
谣
靛
粤
图7pH值6时木聚糖酶酶活稳定性
由图7可知,pH值为6时,木聚糖酶在60?恒温
0-4h,相对酶活都在85%以上,稳定性较好;恒温保
持6h,相对酶活<7O%,酶活下降明显.
\
烬
锰
靛
皿
图8pH值8时木聚糖酶酶活稳定性
图8中,pH值为8时,随着恒温时间的增加.木聚
糖酶的相对酶活下降明显,3,6h内其相对酶活降至
50%以下.因而,在纺织印染前处理应用中,需充分注
意木聚糖酶的稳定时间,尽量在酶加入的1—2h就予
以使用.否则,木聚糖酶的活力会降低.
2.7其它前处理用酶制剂的影响
在纺织品生物酶处理中,根据前处理工艺的需要,
常出现不同种类的酶剂共存的情况.这时,不同酶种
对木聚糖酶活力的影响程度,将直接影响到酶种选择
及前处理效果.针对这一问题,选择用于棉织物前处
理的脂肪酶,纤维素酶,果胶酶和淀粉酶等5种生物酶
进行研究.结果见表1和表2.
表1单种酶对木聚糖酶酶活的影响
酶种相对酶活/%
木聚糖酶1oo.oo
脂肪酶+木聚糖酶95.57
纤维素酶十木聚糖酶97.95
果胶酶+木聚糖酶102.12
淀粉酶+木聚糖酶l0o.44
表2混合酶对木聚酶活力的影响
混合酶种相对酶活/%
木聚糖酶10o.oo
淀粉酶+果胶酶+纤维素酶+脂肪酶+木聚糖酶95.97
淀粉酶+果胶酶十纤维素酶+木聚糖酶91.08
果胶酶+纤维素酶+脂肪酶+木聚糖酶95.75
淀粉酶+果胶酶+脂肪酶+木聚糖酶91.38
淀粉酶+纤维素酶+脂肪酶+木聚糖酶97.49
由表1和表2可以看出,淀粉酶,果胶酶,纤维素
酶,脂肪酶及其混合酶对木聚糖酶的活力没有太大的
影响.各混合酶的相对活力都在90%以上.因而,在
印染前处理中,木聚糖酶与淀粉酶,果胶酶,纤维素酶
和脂肪酶都能共存.
2.8化学助剂的影响
生物酶前处理中,除了不同种类酶制剂相互混合
外,还需加人渗透剂等表面活性剂.为了提高酶活力,
减少原酶用量,研究了表面活性剂以及金属离子对木
聚糖酶活力的影响,结果见表3和表4.
表3助剂对木聚糖酶酶的影响
助剂相对酶活/%
空白1o0.0o
十二烷基磺酸钠33.58
十二烷基苯磺酸钠19.12
平平加0125.61
EDTA85.41
JFC109.68
阳离子助剂104.78
由表3可知,阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠
和十二烷基苯磺酸钠对木聚糖酶的活力起抑制作用,
可将相对酶活分别降低到33.58%和19.12%.非离
子表面活性剂平平加O和JFC则对木聚糖酶的活力有
很好的促进作用.另外,阳离子助剂对木聚糖酶的活
力也有促进作用;EDTA会降低木聚糖酶的活力,但降
低程度有限.
表4金属离子对木聚糖酶活性的影响
金属盐类相对酶活/%
空白100.0o
硫酸铝80.55
硫酸亚铁28.12
硫酸锰42.7l
从表4可以看出,本试验选取的金属离子对木聚
糖酶的活力均有抑制作用.亚铁离子对木聚糖酶的活
???加??们5;
???????
木聚糖酶活力的二硝基水杨酸(DNS)测定法印染(2011No.2)
力影响最大,其次为锰离子,铝离子的抑制作用较小.
2.9参比液的影响
采用DNS法测试木聚糖酶酶活的过程中,会根据
木聚糖酶作用条件的变化选择不同的参比液,虽然各
参比液之间的差别并不是很明显.为减少试验中制作
参比液的工作量,对木聚糖酶不同作用条件下参比液
的吸光度进行比较.
制作参比液时,向1mL灭活的木聚糖酶酶液(稀
释倍数5ooo)中加入5L缓冲液5mL以及1mL木
聚糖底物,在一定温度下反应20min后,加人5mL
DNS试剂,沸煮8min,使其充分显色.
选取不同类型的参比液,以蒸馏水作空白,测量其
在540nm波长下的吸光度,见表5和表6.
表5缓冲溶液pH值对参比液吸光度的影响
I鏖I:I:望I:!I:垫l:箜!I:!I:!!I
表6反应温度对参比液吸光度的影响
0035003700350031I吸光度I.1.I.『.1
注:参比液pH值为6.
由表5和表6可以看出,不同pH值缓冲溶液,反
应温度参比液的吸光度均为0.03,0.04,在测量误差
范围内,说明参比液没有太大的影响.因而,在测定过
程中,可以适当地用一个pH值的缓冲溶液,同一个反
应温度作为参比液,无需每个pH值和反应温度都制
备参比液.
3结论
(1)木聚糖酶的活力随着酶稀释倍数和底物木聚
糖加人量的提高而增加,但二者不能无限增加,否则会
引起测量误差.本试验最终选取酶的稀释倍数为
5000,5g/L底物木聚糖溶液用量1mL;酶处理反应时
间20min,pH值6,反应温度60?.
(2)木聚糖酶在pH=6磷酸缓冲体系60?恒温
保持0,4h,其相对酶活在85%以上,稳定性很好;时
间超过6h,酶活下降明显.在pH=8(NaCO+自来
水调节)条件下,3,6h内,相对酶活会下降至50%以
下,相对酶活下降明显.
(3)淀粉酶,果胶酶,纤维素酶和脂肪酶等对木聚
糖酶的活力影响均不明显.
(4)对于木聚糖酶的活力,阴离子表面活性剂十
二烷基磺酸钠和十二烷基苯磺酸钠起抑制作用;非离
子表面活性剂平平加0,JFC则起到了很好的促进作
用;阳离子助剂也有促进作用;EDTA起抑制作用,但
效果不明显.
(5)金属离子中,亚铁离子对木聚糖酶的酶活影
响最大,锰离子次之,铝离子的抑制作用较小.
(6)不同pH值缓冲溶液和不同反应温度的参比
液,其吸光度差别不大.因而,为减少操作量,试验中,
参比液可以选取同一种缓冲溶液和同一个反应温度.
?
参考文献:
[1]靳贺玲,范雪荣,王强.响应面分析法优化棉针织物的国产碱
性果胶酶精练工艺[J].江南大学(自然科学版),2006,4:
229-231.
[2]阎贺静,华兆哲,堵国成,等.碱性木聚糖酶降解棉籽壳的热动
力学[J].印染,2009,35(19):1-4.
[3]Csisz6rE,SzakOcsG,KoezkaB.Biopreparatlonofcottonfabricwith
enzymesproducedbysolid—statefermentation[J].En~meMierob.
Techno1.,2007(4o):1765—1771.
[4]CollinsGerdayC,FellerG.Xylanases,xylanasesfamiliesandex-
tremophilicxylanases[j].FEMSMicrobiolRev,2005,29(1):3—
23.
[5]李彩霞,房桂干,刘书钗.木聚糖酶酶活的具体测定方法[J].林
产化工通讯,2001,35(1):20-23.
[6]罗长才,李莲,刘亚力,等.琼脂扩散法测定加酶饲料中微量
纤维素酶活力的研究[J].饲料工业,2003,24(1O):39-41.
[7]禹慧明,林勇,徐有良,等.常用饲用酶制剂测定方法的比较
[J].广东饲料,2002,l1(3):25—28.
[8]李富伟,汤海鸥,汪勇.不同条件下木聚糖酶稳定性研究[J].
中国饲料,2008(15):27-29.
[9】冯培勇,左言美,袁腾飞,等.木聚糖酶活性测定方法的研究
[J].生命科学仪器,2Oo9,4(7):40-42.
[1O]李清峰,马向东.于锋.不同运输条件下液态木聚糖酶的稳
定性研究[J].饲料工业,2009,30(10):15—17.
[11]张娟,王莹,王博.果胶酶活力与稀释倍数的测定与研
究[J].陕西农业科学,2009(2):54-56.