猪精液冷冻保存研究
猪精液冷冻保存研究
人工授精是一项发挥优秀公畜遗传潜力的重要现代动物生物技术,而精液冷冻的目的正是为了提供人工授精所需精子产品的一种精子库。冷冻以后精子的受精能力是保障哺乳动物高妊娠率的重要因素,与冷冻-解冻后精子质量密切相关。在复杂的冷冻-解冻过程中,精子细胞的生化成分和内部结构可能发生改变,致使目前猪精液冷冻保存的效果不够理想。冷冻-解冻后,精子活力、质膜完整性、顶体完整率以及发育能力远远不如鲜精,利用冷冻精液人工授精后母猪较低的繁殖率及较少的窝产仔数等导致猪冷冻精液不能应用于商品化养猪生产。因此,精子冷冻的首要目标,包括稀释液的应用、糖类的选择以及精液的冷冻-解冻程序等,都需要阻止对精子产生危害的致命冰晶的形成,以提高精子活力、活率,降低冷冻对精子顶体和质膜的损伤。为了保护精子免遭低温打击,卵黄在家畜冷冻精液中普遍应用,且其保护作用归功于低密度脂蛋白。关于卵黄低密度脂蛋白对牛和鱼精子冷冻保护的研究已有报道,但是没有研究评估低密度脂蛋白对猪冷冻精液活力和其它质量指标的影响。葡萄糖和果糖等添加物对哺乳动物冷冻-解冻后精子活率的影响报道较多,海藻糖、蔗糖和乳糖等双糖对小鼠、牛、绵羊和山羊精子冷冻-解冻后精子运动能力和受精能力也有一些报道,但是迄今为止,关于海藻糖对冷冻-解冻后猪精液质量的影响没有系统的研究报道。此外,在冷冻精液的生产中,精子细胞面临许多潜在的危险。精液的稀释、孵育,精子染色,荧光、精液的离心以及冷冻等,可能损伤精子DNA,影响精子的存活能力和受精潜力。然而猪精液不同的处理程序和技术对精子DNA完整性的影响几乎没有研究报道。为了进一步提高冷冻-解冻后猪精液的质量,保护精子抵抗低温打击的能力,开发中草药冷冻保护剂,本研究以蛋黄低密度脂蛋白(LDL)、双糖(海藻糖、蔗糖、乳糖)、中草药添加剂等作为冷冻保护剂,以冷冻解冻后精子的活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率、精卵体外受精的卵裂率作为评定标准,利用碘化丙啶(PI)、罗丹明12
3、异硫氰酸荧光素连接的花生凝集素(FITC-PNA)、氯四环素(CTC)染色以及低渗膨胀测试(HOST)分别检测冷冻-解冻后精子的活率、染
色线粒体活性、顶体完整率、获能处理前获能率、获能潜力以及质膜完整性,同时研究了猪细管冷冻精液的冷冻温度曲线、常温保存液预处理与冷冻基础液之间的配伍效应、冷冻-解冻对精子DNA的损伤以及精子体外受精卵裂率与精液参数(精子活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率)之间的相关和回归关系。结果
明: 摘要4-8ABSTRACT8-17文献综述17-48第一章 精液冷冻保存的机理17-24
1.1 精子细胞的特殊性17
1.2 精液冷冻保存机理17-24
1.
2.1 精液冷冻保存的理论基础18-19
1.
2.2 冷冻对细胞的损伤19-20
1.
2.3 精液冷冻过程中的变化20-22
1.
2.4 玻璃化冻结的保护作用22-24第二章 家畜精液冷冻保存技术研究进展24-30
2.1 精液冷冻保存的发展简况24-25
2.2 精液冷冻保存的现状25-26
2.3 精液的冷冻过程26-28
2.
3.1 降温26-27
2.
3.2 冷冻与细胞损伤27-28
2.4 精液稀释液中的添加剂28-30
2.
4.1 咖啡因28
2.
4.2 氨基多糖类28
2.
4.3 己酮可可碱28-29
2.
4.4 生殖激素29
2.
4.5 细胞因子29
2.
4.6 维生素29-30第三章 猪精液冷冻保存研究进展30-34
3.1 猪精液冷冻保存研究的发展简况30-31
3.2 猪冷冻精液的稀释液31
3.3 猪精液冷冻的冷冻保护剂31-32
3.4 冷冻对猪精子的损伤32-33
3.5 猪精子冷冻损伤的机理33-34第四章 家畜精液品质评定方法
研究进展34-41
4.1 精子活率34-35
4.2 精子活力35
4.3 精子质膜完整性35-37
4.4 精子顶体完整性37-38
4.
4.1 电镜观察法37-38
4.
4.2 荧光染色法38
4.5 精子线粒体活性38-39
4.6 精子获能与 Ca~(2+)内流39
4.7 精子受精能力检测39-41第五章 猪精液质量评定技术研究进
展41-48
5.1 精液品质评定的最终标准41-42
5.2 精液品质评定的常规指标42-43
5.
2.1 精子密度42
5.
2.2 精子的形态学特征42
5.
2.3 精子活率42
5.
2.4 精子质量评定的其他指标42-43
5.3 精子质量评定的新方法43-48
5.
3.1 精子质膜完整性43-44
5.
3.2 精子核 DNA 完整性44-45
5.
3.3 精子线粒体功能45
5.
3.4 精子获能45-46
5.
3.5 顶体完整性46
5.
3.6 精子受精能力46-48试验研究48-144第六章 猪精液冷冻技术
研究50-69第一节 猪细管精液冷冻温度曲线研究50-60
6.
1.1 材料与方法51-53
6.
1.2 结果与
53-55
6.
1.3 猪细管冻精的冷冻温度曲线55-58
6.
1.4 结论与讨论58-60第二节 猪精液预处理稀释液与冷冻基础液
配伍效应研究60-69
6.
2.1 材料与方法61-64
6.
2.2 结果与分析64-67
6.
2.3 讨论与结论67-69第七章 猪精液冷冻保护剂研究69-106第一节 蛋黄低密度脂蛋白对猪精子冷冻保存的影响69-80
7.
1.1 材料与方法72-74
7.
1.2 结果与分析74-77
7.
1.3 讨论与结论77-80第二节 海藻糖、蔗糖和乳糖对猪精子冷冻保存的影响80-92
7.
2.1 材料与方法82-84
7.
2.2 结果与分析84-91
7.
2.3 结论与讨论91-92第三节 猪精液中草药冷冻保护剂研究92-106
7.
3.1 材料与方法95-97
7.
3.2 结果与分析97-102
7.
3.3 讨论102-106第八章 冷冻对猪精子遗传物质的影响106-123
第一节 冷冻对猪精子染色质结构的影响106-113
8.
1.1 材料与方法109-110
8.
1.2 结果与分析110-112
8.
1.3 结论与讨论112-113第二节 超低温冷冻对猪精子核 DNA 完整性的影响113-123
8.
2.1 材料与方法116-119
8.
2.2 结果与分析119-121
8.
2.3 讨论121-123第九章 猪精液冷冻后体外受精能力研究123-144第一节 猪冷冻精子体外受精能力研究123-1329.
1.1 材料与方法125-1279.
1.2 结果与分析127-1309.
1.3 讨论130-132第二节 猪精子体外受精能力与精液参数的关系研究132-1449.
2.1 材料与方法134-1369.
2.2 结果与分析136-1419.
2.3 结论与讨论141-144结论144-147
参考文献
147-168附表168-170附图170-178致谢178-179个人简介179-183