新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析
第43卷第7期
Vo1.43No.7
山东大学学报(理学版)
JournalofShandongUniversity(NaturalScience)
2008年7月
Ju1.20o8
文章编号:1671.9352(2008}07-0018.05
新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析
赵蕊,霍贵成
(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030)
摘要:从15份采自新疆伊犁牧民家庭传统方法制作的酸奶子中分离出71株乳酸
茵,并进行了生理生化表型特征
鉴定.对其中的28株茵测定了16SrRNA基因全序列,构建系统发生树,结合生理
生化结果,鉴定结果为,该酸奶
子中乳酸茵涉及5个属,11个种及亚种,有些菌株对生长温度适应性较强.乳杆菌
为新疆酸奶子中的优势茵属,
以瑞士乳杆菌(13.helveticus)为最优势.
关键词:传统乳制品;乳酸茵;多样性
中图分类号:TS252.56:Q93—331文献标志码:A
DiversityoflacticacidbacteriaisolatedinsourmilkfromXinjiang
ZHAORui,HUOGui—cheng
(KeylaboratoryofDairyScience,MinistryofEducation,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,Heilongjiang,China)
Abstract:Seventyonelacticacidbacterialstrainswereisolatedfi-om15samplesofnaturallyfermentedsoUl”milkcollectedfrom
thefarmyardsinXinjiang.Theywereidentifiedbyphysiologicalandbiochemicaltests,28ofthemwereful’theranaly~byse—
quencingtheir16SrRNAgenes.Basedonconstructingphylogeneticneighbor-joiningtrees,theresultsincombinationwithtradi—
tionaltaxonomicmethodsbasedonphenotypiccharacteristicsshowedthatthelacticacidbacteriaintraditionaldairyproductscoV—
ered5generaand11speciesorsubspecies./zwtobac///usWasthepredominantgenus,ofwhich13.helvetieuswasthemostpre—
dominantsll~in.Someshacouldadapttoawidetemperaturerange.
Keywords:traditionalfermenteddairyproduct;lacticacidbacteria;biodiversity
0引言
在中国及东南亚地区的传统发酵食品中,蕴藏
着大量未知微生物,是探索有用微生物菌种的绝好
宝库.中国新疆地区哈萨克族和蒙古族等少数民族
自古以来就有制作和食用发酵乳制品的习惯.他们
以牛乳,水牛乳,羊乳,牦牛乳,马乳,骆驼乳等作为
原料,采用传统的制作工艺制成各种传统乳制品,如
奶皮子,稀奶油,酸奶子,奶豆腐,奶干,奶酒,奶疙
瘩,马奶酒和黄油等J.传统的乳制品制作方法有
着明显的地域性以及户籍性,从而做成的乳制品有
着浓厚的地区特色和风味.经过几千年的驯化,这
些传统乳制品中保留了许多赋予乳制品独特风味的
乳酸菌,为发酵乳制品菌种的分离筛选以及研究开
发提供了宝贵的资源J.我国学者曾研究了内蒙
古,新疆,云南,西藏,青海等地区的传统乳制品,产
品类型涉及到乳饼,乳扇,酸马奶,开菲尔粒,发酵山
羊乳,发酵骆驼乳等?3引,并从中分离得到许多有优
良特性的菌株.这些研究中针对内蒙古传统乳制品
居多.
酸奶子(酸奶)是蒙古族,达斡尔族等少数民族
最常用的一种乳制品,是鲜奶经自然发酵制成,乳
其中酪蛋白遇酸凝固,即成酸奶.口感 发酵变酸,
清酸爽口,开胃增食,是农牧民野外,农耕,放牧
的理想食品,并且是制作奶干,奶豆腐的原料J.
-25 收稿日期:2008-04
基金项目:国家”863
”资助项目(2006AA10Z344)
作者简介:赵蕊(1982.),女,博士研究生,从事乳品微生物的研究.
*通讯作者:霍贵成0958一),男,教授,博士生导师,研究方向为乳品加工与食品微
生物.Emall:gchuo58@126.coin
第7期赵蕊,等:新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析19
新疆地区少数民族牧民制作的酸奶子历史悠久,经
验丰富,酸奶子自然发酵过程中形成的微生物类群
受多种因素影响,使用传统方法在长期自然选择保
留下来的发酵菌种,利于进行微生物多样性分
析.本试验在进行了大量生理生化试验的基础上,
选取代表菌株进行16SrRNA基因序列分析,并将两
种方法的结果结合,对菌株进行较为全面,准确的鉴
定.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1样品来源
15份酸奶子均采集自新疆维吾尔自治区伊犁
巩留地区用传统工艺制造酸奶子的牧民家庭.采集
酸奶子装于灭菌的离心管内,封严后放入冰盒.空
运至实验室,一20?保存至使用.
1.1.2
株来源
嗜酸乳杆菌ATCC4356(Lactobacillusacidophi.
),乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC19435(Lactococcus
lactissubsp.1actis),均购自中科院微生物研究所菌
种保藏中心.
1.2仪器设备
(bioer),凝胶成 光学显微镜(OLMPUS),PCR仪
像系统(uVP).
1.3各种培养基与试剂
乳酸菌富集用加富的脱脂乳培养基(10%脱脂
乳,0.5%蛋白胨,0.25%酵母粉,1%葡萄糖);分离
培养采用MRS培养基(分离乳酸菌)和M17培养基
(分离乳酸球菌)].做生理生化试验所用的培养基
均按照文献[10]的方法配制.H’s生成试验,各种
糖发酵试验的培养基均为浙江杭州天和微生物试剂
有限公司生产的细菌微量生化反应管.
1.4乳酸菌的分离与纯化
取一定量的样品,用加富的脱脂乳培养基活化
2代后,划平板,37?培养24,48h.分离明串珠球
培养24, 菌时用的是MRS培养基(pH6.2),在25?
48h.记录菌落形态,挑特征性的菌落,继续划平
板,至确定为纯菌.同时做革兰氏染色和过氧化氢
酶试验,将革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性的菌暂定为
乳酸菌.将纯化后的菌株进行斜面保存,甘油法低
温冻存和冻干保存.
1.5乳酸菌的生理生化鉴定
参照文献[4,5,10.12],将革兰氏阳性,过氧化
氢酶阴性的菌株暂定为乳酸菌.将硝酸盐还原试
验,H’S产生试验,明胶液化试验,吲哚试验结果均
为阴性的杆菌鉴定为乳杆菌属.鉴定乳酸乳球菌,
需要做硝酸盐还原试验,6.5%NaC1生长试验,4%
NaC1生长试验,葡萄糖产气试验,10?和45?生长
试验,进而区分肠球菌属,链球菌属,乳球菌属和明
串珠球菌菌属,再分别进行糖发酵试验.
1.616SrRNA基因序列分析
1.6.1DNA的提取
用Wizard@GenomicDNAPurificationKit试剂盒
提取乳酸菌的染色体DNA,按说明书操作.
1.6.216SrlLNA基因序列的测定
参照文献[13],PCR扩增的引物为16SF(5.
AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3)和16SR(5’-CTACG.
GCTACCTIGTrACGA.3).PCR反应体系如下:dNTP
400tanol/L,10×PCRbuffer(含MS)5L,弓l物各
1/~mol/L,Taq酶(aRa)0.5U,模板DNA2,去离
子水补至50.
PCR扩增条件:94?预变性4min,94?变性
1min,58?退火1min,72?延伸2min(30个循环),
72?延伸10min.
将PCR产物送至上海生工测序.
1.6.3同源性分析
将测序所得序列及GeneBank中获得的参比菌
株的16SrRNA基因序列经ClustalX序列比对后,采
用MEGA4中的邻接法(Neighbour-joining)进行系统
发育树的构建,自展值(bootstrap)为1000.
2结果
2.1乳酸菌生理生化鉴定结果
从15份酸奶子中共分离鉴定了71株乳酸菌,
包括32株球菌和39株杆菌.按照I.5所述的方法
和项目进行鉴定,发现杆菌都为乳杆菌属(Lactoba.
cillus),球菌涉及肠球菌属(Enterococcus),链球菌属
(Streptococcus),乳球菌属(Lactococcus)和明串珠菌属
(Leuconostoc).其生理生化鉴定结果列在表1中.
2.216SrRNA基因序列分析
选取各类群的代表菌株和生理生化鉴定中没鉴
定到具体菌种的菌株共28株,提取其基因组DNA,
扩增其16SrRNA基因序列,进行测序.将16SrRNA
基因序列在GeneBank中进行同源序列搜索,发现各
受试菌株与标准菌株的同源性都在99%以上.
为显示供试菌株与已知菌种之问的亲缘关系及
其系统地位,按照1.2.5的方法进行同源性分析,结
果见图1.
2O山东大学学报(理学版)第43卷
项目项目球菌菌群
肠球菌链球菌乳球菌明串珠菌
注:”,/一”是指阳性菌株数目/受试菌株总数;球菌碳水化合物发酵项目较少,空
格表示没有测定.
2.3分离菌株的综合鉴定结果
总体来说,16SrRNA基因序列鉴定结果能较好
地与生理生化结果相吻合.26株生理生化鉴定为
Lb.helveticus的菌株,经16SrRNA基因序列分析结
果再次得到证实;10株Lb.册en册中,有4株生
理生化鉴定结果与标准菌株完全相符,另有6株菌
结果与.册em啪相近,个别项目不符,且这6
株菌的16SrRNA序列分析结果都为Lb.珊em啪,
同源性都在99%以上,综合鉴定这10株菌均为.
fe,~ntu,n;生理生化鉴定结果为Lb.plantarum的3
株菌都可以在45?条件下生长,这点与Lb.planta.
的模式株不符,有1株菌的糖发酵结果与.
plantarum模式菌株完全相符,另2株菌各有1种糖
发酵结果与模式菌株不一致.16SrRNA基因测序
结果表明这3株菌与Lb.p抛兀肌和Lb.pentosus
同源性都在99%以上,但与Lb.pentosus更接近,而
3株菌的糖发酵结果与Lb.pentosus模式株有2,4
项不一致.综合看来,这3株菌仍属于Lb.planta.
兀肌0
将乳酸球菌鉴定到属,两种鉴定方法得到的结
果一致.肠球菌属,包括4株E.durans,另有3株
肠球菌两种鉴定方法都不能区分其为E.durans或
E.hirae;链球菌属中,8株为S.thermophilus,2株为
S.bov/s,生理生化鉴定结果与16SrRNA基因测序
鉴定结果完全吻合;乳球菌属的2个菌株均为乳酸
乳球菌乳酸亚种(Lc.1actissubsp.1actis),生理生化
第7期赵蕊,等:新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析21
鉴定结果与16SrRNA基因测序鉴定结果完全一致.
l广StreptococcusthermophilusX59028
83LKLDS3.O6O6EU419603
100LKLDS3.0603EU419602
--—-??---—--——
EnterococcushermanniensisAY396047
—
厂眈roc0cc?4
J肪嘲AJ276355
97LKLDS6.0601EU419600
57IKLDS1?O6Or7EU41959r7
60JLactobacillusm0sD79211
.
!ocillparaplantarumAJ306297
【do矗p,忱nmD79210
L——————一厶.6口d瑚,I.asABoo5893
49广————一LactobacillusgastricusAY253658
L—Lactobacillusm??eAF126738
广一LactobacillusingluvieiAF333975
38]JKLDS1?o6o4EU419590
100ILactobac///us扁m删MmAJ575812
97lKLDS1.0603EU419586
99IIZnheh~t/cusAM113779
55JL—LactobacillusgallinarumAJ242968
L—以ocM,lemAY253660
L—一LactobacillacidophilusM58802
98ILeuconostocmesenteroidesA13023242
97KLDS5.0606EU419608
I..........一
O.O1
1oo
lruconoatocpseudontesenteroidesAB023237
93LKLDS5.0601EU419604
99[LeuconostocholzapfeliiAM600682
lLLel’corInstocc由re’,nAB022923
100IrLeuconostocargentinumAF175403
1LeuconostoclactisAB023968
96.KLDS5
.O6o4EU4196O6
图1根据16SrRNA基因序列绘制的系统树
Fig.1PhylogenetictreebasedOilthe16SrRNAgenealignment.Bar,0.01sequencediverge
nce
明串珠菌属内多个种之间碳水化合物发酵特征
十分相似,单纯依据生理生化指标,很难鉴定到种.
13株明串珠菌中,有7株菌用两种鉴定方法得到同
样的结果,包括:3株肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(.
mesenteroidessubsp.dextranicum),3株乳明串珠菌
(Ln.1actis),1株假肠膜明串珠菌(Ln.pseudomesen.
teroides).余下的6株明串珠菌都是生理生化鉴定
结果不能与某一具体菌种完全相符:1株难以区分
为阿根廷明串珠菌(Ln.argentimum)或乳明串珠菌
(各有1项不符),2株不能区分其为假肠膜明串珠
菌或肠膜明串珠菌(各有1项鉴定项目不符),另有
3株不能区分其为假肠膜明串珠菌或是阿根廷明串
珠菌(分别有2项和1项鉴定结果不符).对这些菌
做进一步的16SrRNA基因序列分析表明,生理生化
鉴定中怀疑是阿根廷明串珠菌的菌株,其16SrRNA
序列与乳明串珠菌更接近,因此将其鉴定为乳明串
珠菌;其余的5株16SrRNA序列与假肠膜明串珠菌
更为接近,因此将其鉴定为假肠膜明串珠菌.
3讨论
3.1鉴定的方法与可靠性
生理生化鉴定结果本身具有不确定性,加之有
些菌种生理生化性质相近,单纯用传统的表型分类
及糖发酵实验难以区分,还必须依靠分子鉴定手段,
一
般来说菌株间的16SrRNA相似性>97%,可能属
于同一个种;16SrRNA基因相似性高达99%以上,
可能属于同一亚种.因此,将生理生化鉴定与16S
山东大学学报(理学版)第43卷
rRNA基因测序的结果结合起来,才能够较准确地做
出鉴定.
当几种菌亲缘关系很近时(如一个种的亚种之间
或同一菌群内的不同菌种间),生理生化指标,与16S
rRNA分子鉴定结果不一致时,有必要进行细胞全蛋
白的SDS.PAGE和AP-PCR等分子手段的分析l1引.
3.2生长温度的问题
根据文献[10,11]发酵乳杆菌在15o【=不生长,
但试验的结果却是10株发酵乳杆菌中有8株可以
?生长.与此类似,植物乳杆菌在45o【=不应 在15
该生长l1J,但试验结果却是3株植物乳杆菌都可
以在45o【=生长.这可能与分离菌株的适应能力增
强有关.由于牧民家庭制作的乳及乳制品往往存放
在自然环境中,温差变化大,菌株经过长期的适应,
形成了这种在广泛温度范围内生长的特性l1引.
3.3酸奶子中乳酸菌多样性的分析
分菌时根据菌落,菌体形态从同一样品中分出
许多不同的菌株,生理生化鉴定发现这些”不同”的
菌都归于同种菌,但彼此间生理生化特性可能略有
差异.它们可能是同一样品中不同的菌株,也可能
是同一菌株对某些碳水化合物利用结果的不确定性
造成的.传统发酵乳制品常常是混合菌株发酵,这
对抵御噬菌体的污染也起到重要的作用,因此有必
要研究,开发这些菌株,制成多菌株的混合发酵剂.
采自新疆伊犁的15份酸奶子中,只有2个样品
(2006,2016)没有分离到乳杆菌,而且在分离这2
个样品时都曾分离到肠道菌;有3个样品(2017,
2019,2o28)中没有分离到乳酸球菌,但只有2017
曾分离出非乳酸菌;另有10个既分离出乳杆菌,又
分离出乳酸球菌的样品,只有2个样品(2015,
2020,2021)从中分离到非乳酸菌,说明乳杆菌对肠
道菌有一定的抑制作用.对于没有分离出球菌的样
品,可能因为球菌的耐酸性能不如杆菌.由于采集
的样品有些已经发酵了几天,pH值已经降到很低,
这对于乳酸球菌的生长存活很不利,造成菌体的死
亡或活性下降,因此当分离时不能有效地分离出来.
分离鉴定的71株乳酸菌,涉及到乳品中常见也
是发酵工业上常用的乳酸菌.乳杆菌属中,尽管只
分离鉴定出3种乳杆菌,但它们分别代表了专性同
型发酵,兼性异型发酵或专性异型发酵3种发酵类
群,且都能发酵乳糖.培养法得到的结果表明,瑞士
乳杆菌为酸奶子中的优势菌,在酸奶子的发酵中起
重要作用.发酵乳杆菌,尤其是植物乳杆菌能够利
用松三糖,蜜二糖,棉籽糖,纤维二糖这些人体难以
利用的寡糖.
乳酸球菌中,明串珠菌分离株无论在种类还是
在数量上都占优势,可能正是它们赋予了酸奶子优
良的风味和质地.
分离鉴定的乳球菌菌株无论是种类还是数量都
很少,这可能与酸奶子较低的pH值有关,致使乳球
菌生长受到抑制,活性也不高,不能在分离培养基中
很好的生长.
链球菌中,除了有在乳品中常见的嗜热链球菌,
还分离到牛链球菌,该菌有一定的致病性,说明传统
乳制品含有一些不良因素,在今后的开发利用中要
扬长避短.
孟和毕力格,张和平等人曾研究了新疆酸马奶
中乳酸菌的多样性I4],发现.helveticus为优势菌
种,并且也分离到Lb.plantrum和Lb.斥批啪,这
点与本试验的结果相同.
3.4研究方法的局限性及改进的方向
我国现有的对传统乳制品中微生物的多样性分
析都是采用传统的培养法(culture.dependent),然而
许多情况下某些细菌由于其活力不够或不可在分离
培养基中生长,不能被有效地分离,造成对环境微生
物多样性的低估l】.宜同时采用无需培养(culture.
, independent)的分子生物学的方法,如PCR.DGGE法
直接从样品中抽提DNA,PCR扩增,再进行DGGE分
析,或是与已知的参照株比较,或是回收序列进行测
序,就可以知道样品中含有的微生物,如此可以更真
实地还原这些乳制品中微生物的多样性.
致谢:感谢师守信老师在生理生化鉴定过程中给予的指导和帮
助,感谢谷春涛老师在16SrRNA基因分析及构建系统发生树方面给
予的指导和帮助.
参考文献:
[1]乌尼,敖敦格日勒,张爱荣,等.内蒙古牧区民族乳制品
的种类及制造工艺[J].内蒙古农牧学院学报,1996,17
(1):63—67.
[2]刘计民.内蒙古传统风味民族乳食品简介[J].中国乳
品工业,1993,21(5):237.240.
[3]孙天松,刘红霞,倪慧娟,等.传统发酵酸驼乳中乳酸菌
的分离及鉴定[J].中国乳品工业,2006,36(9):4-7.
[4]孙天松,王俊国,张列兵,等.中国新疆地区酸马奶中乳
酸菌生物多样性研究[J].微生物学通报,2O07,34(3):
451—454.
[5]倪慧娟,包秋华,孙天松,等.新疆地区酸马奶中酵母菌
的鉴定及其生物多样性分析[J].微生物学报,20O7,47
(4):578—582.
[6]国立东,王欣,杜鹏,等.传统乳制品中乳酸菌的分离及
性能研究[J].食品科学2006,27(03):60-64.
(下转第27页)
第7期李艾黎,等:酵母粉质量浓度对德氏乳杆菌保加利亚亚种l(IJ)sI.9201分批
发酵动力学的影响27
长速率下降到零时,便进人生长稳定期,此时菌体的
生长速率为0,但仍有产物合成,且残糖量越高,稳
定期时间持续越长.
今后还应以生长速率时间曲线为基础建立分批
发酵数学模型,更好地描述发酵剂生长过程由生长
延迟期,指数期和稳定期构成的典型的”S”型生长曲
线,为发酵工艺过程优化和放大
提供参考.
致谢:感谢导师霍贵成教授的悉心指导和乳品科学教育部重点
实验室的刘丽波等老师的热心帮助.感谢863课题组对本
的实
施给予了及时到位的资金支持,使得试验得以顺利进行.
参考文献:
[1]HUHTANENCN,WILLIAMSWL.Factorswhichincrease
acidproductioninmilkbyLaetobaeilli[J].ApplMierobiol,
1963(11):20-24.
[2]陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农
业出版社,1995:93—103.
,肖冬光.酸奶发酵剂高浓度培养的研究[J].天 [3]史嫒英
津轻工业学院学报,1999,(1):20-25.
[4]吴荣荣,张柏林.直投式酸奶发酵剂的商品化生产研究
[J].中国乳品工业,2005,33(12):8-11.
(上接第22页)
[7]张以芳,舒相华,刘旭川,等.乳扇制品中乳杆菌分离鉴
定及其发酵性能试验[J].中国奶牛,2OOO,(2):22—23.
[8]张文羿,徐杰,云月英,等.青海省海西地区传统发酵山
羊乳中乳酸菌的分离及鉴定[J].中国乳品工业,2006,
34(11):4-8.
[9]ERCOLINID,MAURIELLOG,BLAIOTYAG,eta1.PCR-
DGGEfingerprintsofmicrobialsuccessionduringamanufacture
oftraditionalwaterbuffalomozzal~laacheese[J].Journalof
AppliedMicrobiology,2004(96):263—270.
[10]凌代文主编.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].第1
版.北京:中国轻工业出版社,1999:1-129.
[11]布坎南RE.伯杰细菌鉴定
[M].第8版.北京:科
学出版社,1984.
[12]GIOVANNAEFelis,FRANCODellaglio.Taxonomyoflacto—
bacilliandbifidobacteria[J].CurtIssuesIntestinalMicrobiol,
2005,8:44-61.
[5]DEANB,JAG,PAVELJ.Effectofyeastextractsupple—
mentationon~-galactosidaseactivityof~///usdelbrueckii
subsp.bu/garwus11842growninwhey[J].CzechJFoodSci,
2001,19(5):166-170.
[6]AKSC~A,SI’OCKARU.Theeffectofyeastextract
supplementationontheproductionoflacticacidfromwheyper-
meatebyLactob~//lushelueticuslJJ.Biotechnologyletters,
200. 1989,11:195—
[7]陈育如,夏黎明,岑沛霖.乳酸发酵动力学研究进展[J].
生物技术通讯,2002,13(3):239.241.
,王明道,宋安东,等.应加强对单细胞生物分批 [8]丘立友
培养生长曲线中减速期的认识和教学[J].微生物学通
报,2008,35(3):432_435.
[9]AMRANEA,PRIGENTY.Lacticacidproductionratesduring
thedifferentgrowthphasesofLaaobacillushelveticuscultivated
onwheysupplementedwithyeastextract[J].Biotechnology
letters,1998,20(4):379-383.
[10]GHALYAE,TANGOMSA,AdamsMA.Enhancedlactic
acidproductionfromcheesewheywithnutrientsupplement
addition[J].JSciResearchDevelopment,2003(5):1-20.
(编辑:于善清)
[13]MAUROS,DIEGOM,SILVIAC,eta1.Developmentofge—
nus/species-specificPCRanalysisforidentificationof
Carnobaaer/umstrains[J].CurtMicrobiol,2002,45:29.
[14JDEVRIESELA,VANCANNEYTM,DESCHEEMAEKERP,
eta1.眦rentiationandidentificatiOnofEnterococcusdu—
vdn$,E.hiraeandE.villomm[J].JournalofAppliedMicro-
biology,2002(92):821—827.
[15]李少英,乌尼,李培锋,等.内蒙古牧区乳与乳制品中乳
酸菌资源及其生态分布[J].生态学杂志,2006,25(12):
1495—1499.
[16]KALLIOPIRantsiou,ROSALINDAUrso,LUCILLAIacumin,
eta1.Culture-dependentand—independentmethodstoinvesti—
gatethemicrobialecologyofItalianfermentedsausages[JJ.
AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2005,71(4):
1977—1986.
(编辑:于善清)