兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究
兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞
转分化的实验研究
重庆医科大学学报2O06年第31卷第2期(JournalofChongqingMedicalUniversity2O06.Vo1.31No.2)一231一 文章编号:0253—3626(2006)02-0231-05 兔眼虹膜色素上皮细胞向品状体上皮细胞转分化的实验研究
汤永强,李立,黄瑶
(重庆医科大学附属第二医院眼科,重庆400010)
【摘要】目的:在体外成功分离培养虹膜色素上皮细胞,并观察其在特定条件下转分化为晶体上皮细胞的现象.方法:采用酶
辅助机械分离法分离并培养兔眼虹膜色素上皮细胞.传代过程中在DMEM培养基内加入苯硫脲,透明质酸酶,重组人成纤维细
胞生长因子-4及L-抗坏血酸一2一磷酸完成转分化过程.分别对培养起始和终末的细胞进行光镜,电镜观察和免疫组化染色
鉴定.结果:成功分离并培养出原代的虹膜色素上皮细胞,经过特定条件的培养最终转分化为晶体上皮细胞,免疫组化鉴定虹
膜色素上皮细胞和晶状体上皮细胞均有其各自特异染色.结论:酶辅助机械分离法是进行虹膜色素上皮细胞原代培养较好的
方法.在体外培养条件下,虹膜色素上皮细胞可转分化为晶状体上皮细胞,而透明质酸酶,苯硫脲,L一抗坏血酸一2一磷酸,重组
人成纤维细胞生长因子一4等因素可能参与了对上述转分化过程的调节. 【关键词】兔;虹膜色素上皮细胞;晶状体上皮细胞;转分化
【中国图
分类法分类号】R77【文献标识码】A【收稿日期】2005—12—27 TheexperimentOntheCOurseOfthetransdI仟erentIationfrOmIrIs pigmentedepithelialcelltolensepithelialcell
?GYongqiang.et
(Departmentofophthalmology,theSecondAffiliatedhospitalofcollege,ChongqingMedic
alUniversity)
【Abstract】
Objective:Toaccomplishtl1edetachmentandcultureofIPEinvitroandtoinvestigatetl1ecourseoftl1etransdifferentiati0n
fromirispigmentedepithelialcelltolensepithelialcellduringthespecificcondition.Methods:TheIPEofrabbitsweredetachedandcu1..
tivatedaccordingtothemethodofenzyme-assistedmicrodissection.ThentheIPEwerecultivatedintheculturemediumappendingwith
PTU,Huase,rhFGF—4,Asc一
2PandSOon.Finallytheinitiativeandtheultimatecellswererespectivelyidentifiedbymicroscope,elec—
troscopeandthemethodofimmunohistochemistry.Results:TheIPEofrabbitsweresuccessfullydetachedandcultivatedandthecourseof
tl1etransdifferentiationWasobserved.TheIPEandLECwereidentifiedbytheirparticularreactiontoimmunohistochemistry.
Conclusion:
ItisagoodmethodtodetachIPEbyenzyme-assistedmicrodissection.Duringinvitroculture,IPECanundergothecourseoftransdifferen—
tiationandturnintoLECfinally.ThisexperimentsuggestthatthosefactorssuchasPrU,Huase,rhFGF-4,Asc一2PandSOonmaybein—
volvedtheregulationofthecourseoftransdifferentiation.
【Keywords】
Rabbit;IrisPigmentedEpithelialcell(IPE);LensEpithelialCell(LEC);Transdifferential 当Wolff在1895年对晶状体再生进行描述后,
蝾螈的晶状体再生现象便引起了全世界生物学家
的浓厚兴趣和广泛关注.对于这种已完全分化的细
胞,在某些条件刺激下,从其原有的特定分化类型
转入另一完全不同的分化途径,从而在
现型上从
色素上皮细胞转变为晶状体细胞的现象,人们称之
为"Wolff晶状体再生".然而对较高等的生物,上 述虹膜色素上皮细胞的转分化过程则研究甚少,本 实验以常见哺乳动物兔为对象,观察了体外培养条 作者介绍:汤永强(1974-),男,主治医师,硕士, 主要研究方向:晶状体疾病.
件下的上述转分化过程.
1
和方法
1.1实验动物
新西兰大白兔,雌雄不拘,兔龄2O,3O天,体重250, 350g(296?14g).由重庆医科大学实验动物中心提供. 1.2主要试剂
DMEM培养基(美国Hyclone公司);
胎牛血清,透明质酸酶(HUase),苯硫脲(刖),L-抗 坏血酸一2一磷酸(Ase一2P),重组人成纤维细胞生长因子 (rhFGF-4),鼠抗兔角蛋白多克隆抗体,鼠抗兔一晶状体
232重庆^学学报2IHlbjl卷弟(JournalolChongqlngMedicalUn,ve~ity2.?V.l3IN.2)
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I3王皿培养鞋配制
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13.2IIPH柞II}腑砟坫/Jlr苯硫[IM请
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2I仆外培养状态下丸llE细胞的彤态观察(囤 i2)
味代埔莽的龟L细胞,托景浓懈龇黑色索 圩离肝球】悬浮常:接种24-481]内岵 肇生K.世ftWrHfJ~莲倚行忡艇变尢.为小挑州 蚋痛分I培养7,Io细胞逐渐融合
K胞轮廓模糊他f"r刊伸m仙越K梭 形州也此时'?胞叭壁时缔州为1—2h.细咆1. 划l台的时lfJ也缩艇为5,7夫f纠斤IPE_胞 呐色索州牡j茎渐溅,一般绛过5-6代包素锕粒 l0_.减少
2.2体卟培乖IPE知盹的逢导}电镜靶样(固3) IPEflIl~fJ胞浆内细胞F富.1lJJ,If见较多电 惭恒敢的包采1粗.地凡部分呵肜.少数可 }Ij6叫彤不规则形迁i-J刮}富的错1粒, {体柑面内厩网溶惝体等圳胞表面可澈城 E』,F_If撇艏结构.郫分州恤底可发观 #忻粒样}10构
3ifF如胞允疽细袍化学染色【闺4) IrI~III)I甜埔lL色均匀免疫复台物
啪岫浆.棕黄色懵喊细小牲状.
胞核ieJ漩淝
圈2II,E细胞的HE染色I(1~4t)
蓖_盍大学学报2IHm年第3I卷蕈:M【JournalofChongqingMedicalUnivemltv2l?
"Vol31No2
图IIE细胞的透射电镜像×I…?
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图4IlI细胞的免疫细胞化学染色I4n .
x40 图5转分化培养过程中的细胞cI】
图6转分化培养过程中的细胞{2l40 24特分化过程巾细胞彤态观察(闺5.6) 倒?垃镜F蚍察.IlEfitf眦转移刮川--,IH靖 掉斌开.1胞浆内色求特J艟减少.直三I后定 消失,细连渐蹙得缃托.时IIrJ约为15火左右(传 代^一8ftj
2.5特分后细胞的形态观察(旧7.) 倒做镜F观察,培养帆中的细胞渐变为 镗形,长条形等.细胞生旺盛,1wfII】lJnr铺满晰i 底.弛浆IJ,J色素惭粒完全失.细胞问可蝇扎州 现象
2.6转旁_乜后细饱的进射电链观察I旧g} 睦电镜下可见咆浆l,色采牲消失
细胞表仃少胞匝蹙起.呈劂彤幢自质内 细胞器r富.岛尔蛙惟篮.常化f-fill咆中啦:; 面内脏网十钳.多傅J边:湍廊怍数髓多少 一
{_{《柑f隹中锋量.线粒悼lE辕少见;穷一1-特就 是怆匝做丝J一富,自帕密集成靠位J胞帻附近 』盹剧边,
27转夸化后如胞的免症知咆化学染色囤10) 转分化的细胞抗"一晶状件蚩门色日…: 胜似镜下脱察胞柴内可见棕色},牲状?C积 图7转分化后的细胞×4?
囤R转分化后细胞的fie染色II)x4( 掣
234重科学报211~6莆31卷第
2{JoumalofChongqlngMedicalUniversity211U6VOI31NO2)
图9转分化后细胞的透射电镜像~80(XJ 圈Il_转分化后细胞的免疫细胞化学染色lOx40 翱.】地}靠壮举小也
3IlT'E细胞的兮离培齐
1PE身[『胞属J'神经嵴求晾的包豢l_应.近求 仃越来越多的J能诎几发规.闩上纪
f?眦求凡们一商尝试剥IPE进行分离坫井,fFl均 未能状谢化的IIE细胞:能世}传代和心
的功雌研究随到I992IhiI'推'r一升
离{i业化培养iPE川胞帅,.确定丁廊辅m均艟 微解剖法是5'离蚺奔IPE~'11I胞口0昂法怛工}莪疗 浊难"扳僻九鲢的II,E咆:能满『床自?_ l移植的要求J'址一些1=l?精…的分离培养体录 f刚『I'奉j=骑参照}"内千兆电等ii采用的f晦辅 助机撇分离,_r…I1…it…I?{lr…州?)成 功分离纯化旧[PE细胞.ti进fr了传代培养4:11梢 关研究
32体外培养中儿?E细胞的转分化过程分析 3.21培养基的选择车窑螗参K,~akaM的h 浊II完成整个转分化过程共用-二种培养簟.每种
揶址F~;J-种的琏f=}Ij上添巾些辅助冈于.H刑 于培养H程n勺:阶段足DF培养蛙.片{J 代IPE钏胞砭其传fLJ;"i掉1lJI'川忸传代生K旺盛 按ll}I,H培养啦州J.II'E眦晌脱色素阶 胜.II,E}胞舱过【衰阶段培养.由儿兑乜索的"去补 f也乜索r戍咆(delPE)处I去分化状惑 的1PE胞?叶进人最后阶段岫培柞.1]rPIn培 车堆恒ir]完战转舒化越社.最彤战I状伴卜. 魁lLEI)f肋述埔荐系统哉们的宴骑
ifi成J圳成了从IPE胞I;i』LE(:胞的转舒化 过I察到两利叫,l_】j丧的胞彤盘学n区制 龟《聿?l化学}刊小同机的反应
22prI1HI日『^I一等计转Y4"fl~j.t租的话 lM1,J州I凡为IPE钏眦转分fE过ll】细胞一 j乜之IH厦细胞一』I鼍物之间晌接触状盘受列胞 微州,崦的胴.jf凡是侏特细胞分化状怠的必瞄麓 州蚺挥旗内lj?凡??{l?l咆辰I"I特m至影 III;,j.胞尬汛减少.圳胞分化状忘随之改变.从… 利1噬转分化吐程f_{J艟_"外.PTI是种 瓴瞧刚li'J利,它IIT完抑制IPEhi[胞巾色素 的l成.陋啦托甩为去分化的状Ul?速 圳地n々粘丹化iat慢
…舡0埘卜迷转舒化过程堆没竹摧稠节 件fII皿ii"f"艘几"1,1'【if逊转舒化过的杖也 f'i~J}Jl是:HT】分衅圳胞质内的坐n多 精.而J抒i是维持绷胞表而IE常一划导性的璺 案,舭即可导数flFI]]~蠢i特I细胞J同做 环境Il1堑,恒I.II发挥竹i
抗坏陵的竹?主鉴文趣在转分化过船的蛙
阶段发现在不岔卜21,的埘养内.小骨时
IPEfillJ]NI'T~])IF莽时蜒K多九.均小能看到柯品状 体样小体mJ巾于机坏血艘在符种培养细胞中 均川盐腔原的合成I.『此徊J能E电址面j刺 触一I川胞的合成求促进转仆化程的
13转舒化过侄中的计段?IIPE证上进转
舒f七t』程ll_IIE宣II胞培养于幽牧硫脲计f透…_ 匝腋酶(1ilTa*e)的培养蟮内叫细胞会悦去色素. 失去接触抑制"的生长特Pl&上f!_1=不同于 -
世始阶段的T【1E胞世不同r分化站柬的I …崛敞称勾",分化的IPE细胞"分比址程
一l处J…-l一问阶殷",只垂列培养基件IJfJ政变艇 J拄制其分化逢径:或者继续完成转舒化过程.向 lE(细胞?分化:或者发/分化逆转甫新堂叫
重庆医科大学学报21)06年第31卷第2期
(JournalofChongqingMedicalUniversity2006.Vo1.31No.2)一235一 IPE细胞(reIPE)[41.
3.2.4细胞因子FGF对转分化过程的调节作用FGF 家族的各种蛋白质在晶体发育过程中起着十分重 要的作用,在来源于IPE细胞的晶状体再生过程 中,作为FGF活化后信号转导通路的下游阶段,其 受体FGFRs的作用也是必须的【81.本实验在FGF的 协同作用下观察到了IPE向LEC细胞的转分化过 程,可认为FGF对上述过程具有一定的调节和促进 作用.但是,该细胞因子对转分化过程的具体作用 尚未阐明,作用机制也知之甚少,有待进一步研究. 本实验观察到了高等哺乳动物兔的IPE细胞
向LEC细胞的转分化现象,和以往利用低等生物
IPE细胞所进行的体外培养相比,还远未达到类似
的研究程度,在体外培养中也没有发现转分化后的
LEC细胞形成晶状体泡及其他晶状体样结构,这可
能主要与物种差别有关,所需要的条件和时间也可
能大相径庭.我们的实验只是提出了这样一种可能
性,做了最初的探索,至于是否能通过改变有关条
件来实现体外培养条件下的晶状体再生,以及再生
过程如何调控,尚需大量的实验来论证.
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一—--+-+-+-+一+一+一+一+一
(上接第210页)膜做进一步漂洗,术后全身或局部
应用抗生素等.
(通讯作者:赵敏联系方式:重庆医科大学附属第一医院
眼科,邮编400016E-mail:minzhao2002@yahoo.eom.en) 参考文献
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