半数致死量及其计算方法概述

基金项目:国家科学技术委员会 /九五 0科技攻关项目 ( 9629062042 11);江西省卫生厅科技计划项目 ( 20072036) 作者单位: 1. 江西科技师范学院药学院,江西 南昌 330013; 2. 江西 中医学院药学院, 330006; 3.南京医科大学公共卫生学院, 210029 作者简介:顾兵 ( 1971) ),男,博士后, 副教授、硕士生导师, 主要从 事药理学、食品毒理学教学和神经精神药物学研究 文章编号: 1000 - 6486( 2009) 06 - 0507- 03 =综 述 > 半数致死量及其计算方法概述 Summary ofmedian lethal dose and its calculation methods 顾兵 1, 张政 2, 李玉萍 1, 余日跃 2, 王心如 3 GU Bing1, ZHANG Zheng2, LIYu2ping1, YU R i2yue2, WANG X in2ru3 关键词: 半数致死量; 毒性参数; 计算方法 中图分类号: R965. 3 文献标识码: A 在毒理学、药理学、微生物学等领域和新药筛选中,往往需 要研究某个因素对生物体的作用,通过 1个量化指标直观地 述其药效、毒性或效价 [ 1]。 1927年 TREVAN首先采用半数致 死量 (Med ian le tha l dose, LD50 )作为检定分析的方法, 该量度方 法有助于减少所需实验次数, 减少量度极端情况所带来的 问题。 1 LD50的概念 根据医学主题词表的定义, LD50是指能杀死一半试验总体 之有害物质、有毒物质或游离辐射的剂量。它是一个经过统计 学处理计算得到的数值,通常以有毒物质质量与实验生物体质 量之比来表示, 如 mg /kg体质量。 2 LD50的计算方法 目前计算 LD50的方法很多,有的计算简便, 但结果粗略;有 的结果较准确, 但计算复杂。国外多采用 L ITCH FIELD和W IL2 COXON的坐标纸图解法。在我国普遍采用的方法可以归纳为 2类:一类是死亡率 - 剂量反应相关, 要求为正态分布, 其中概 率单位图解法和改良寇氏法较为常用;另一类是不要求为正态 分布, 计算时只查对有关表格即可得到 LD50值, 如霍恩氏法等。 现就常用的计算方法及其优缺点作一概述。 2. 1 寇氏法 寇氏法 (Karber氏法 )是在 1931年由 KARBER提出, 由于 它计算复杂, 当时并没有得到广泛推广。 1963年孙瑞元了 合理的实验, 改进并发展了寇氏法, 使其计算简化, 即为 LD50 的综合计算方法, 后称之为改良寇氏法。主要计算公式为: logLD 50 =Xm - i(E p- 0. 5); SE50 = i E p- E p2 n- 1 ; b= Yh - Y1 i(N - H ) ; logLDK = logLD50 - 5- YK b ; SEK = (SE50 ) 2 + 2nH (N - H ) ( 5- YK b2 i ) 2。 在简洁度上优于累计法、寇氏法等方法,在精确度上亦较寇氏 法有所进步, 计算结果与 Bliss机率单位法很接近。 1974年杨 世洪 [ 2]将其运算过程进一步简化, 缩减了计算量, 推导出了新 的公式: LD50 = lg- 1 [Xn - i ( 2E m + h2n - 0. 75 ) ]; SE50 = i n nE m - E m2 n- 1 ; 95%的平均可信限: LD50 ? 4. 5 @LD50 @SE 50; 式中: Xn为最高反应组剂量的对数; i为相邻 2组对数剂量之差 值 (即组距 ); m为各组动物反应数; E m为各组动物反应数的 总和; E m2为各组动物反应数的平方和; n为每组动物数; h为 首末 2组反应数的平均值。在实际运用中, 由于寇氏法及其改 良法都是根据结果直接按公式计算,不需要因为数据不精确而 进行各种修改, 省去了其他更复杂的统计计算。其计算结果精 确, 能求出标准误,只是应用时必须满足 3个条件: ¹反应量大 致呈正态分布; º剂量必须按等比级数分布; »各组动物数相 等。虽然有条件限制, 但还是有很多研究者为能运用该法计算 而合理地设计实验。因此, 寇氏法仍是最常用的 LD50计算方法 之一。钟以禧 [3]用该法计算大鼠灌胃马拉硫磷的毒性, 同时进 行了区间估计, 实验结果和其他方法很接近。 2. 2 累计法 累计法又称 Reed2Muench法,是用呈等比级数排列的剂量 进行实验, 要求每组动物数相等。它是先将实验死亡动物数和 存活动物数进行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。在死 亡率中有 2个数据 A和 B, 且 A刚好大于 50% , B 刚好小于 50%。由于累计死亡率的直线性较不累计时的好, 在这里用上 述 2个数据可以得出 1条直线, 且将该直线近似为死亡率与剂 量关系的直线, 即 50%死亡率的点在该直线上。根据数学计算 可以得出比例系数 r,即 r= (A - 50% ) / (A - B ), r与等比数列 公比的乘积, 就是 50%死亡率时的剂量与死亡率为 A时的剂量 的差, 所以可以求得 50%死亡率时的剂量, 即 LD50。累计法计 算方便, 更多地运用在微生物学中, 尤其在稀释分析中 [4] ;但此 法最大的缺点是不考虑操作误差, 有个 /近似 0, 使得计算结果 不够精确, 只可以作为实验过程中 LD50的粗略判断。 2. 3 加权法 加权法又称 Bliss法,创建于 1938年, 后为 FINNEY [ 5]所发 展的加权机率单位法。大体计算过程为: ¹在坐标纸上, 根据 对数剂量与概率单位 ( yem )构成点, 并绘制出 1条直线, 并 由直线找出各对数剂量相当的概率单位称期望概率单位 (Y) ; º计算出作业概率单位 (y),对 Y进行校正, y= (Y- P /Z ) + P /Z 或者 y = (Y+ Q /Z ) - Q /Z; »将各点加权 ( nw), 用 X2作直线性 检验。如果各点不显著偏离直线, 即可计算回归直线方程, 如 果由直线方程得到的期望概率单位 (Y1 )与前次的不够接近, 则 #507#中国职业医学 2009年 12月第 36卷第 6期 Ch in O ccupM ed, December, 2009, Vo.l 36, No. 6 对 Y1再次校正; ¼将各 X值代入直线方程 Y2 = €y + b(X - €x)。 反应率等于 0. 5时, Y2= 5代入方程: Y2= €y+ b(X - €x)得到的值 即 LD50的对数值 (m )。Bliss法是目前最为精确、可靠的 LD50 测定方法。由于其在数理上严谨精密, 甚至称其为机率单位 正规法 [ 6]。在早期,因为其计算过程太烦琐, 很难推广。随着 计算机的普及 ,研究者更多运用基于 Bliss法的计算程序计算 LD50。1988年我国学者应用 Basic语言开始在 Apple机上计 算 LD50。 2. 4 霍恩氏法 霍恩氏法又称目测图解法, 与回归直线法的统计思想一 样, 各种能转换成在几何上呈规则图形的数据都能运用。计算 LD50时, 一般是将剂量变换成对数剂量 X作为横坐标, 将死亡 率 (% )转换成概率单位 Y作为纵坐标,使得死亡率与对数剂量 呈线性关系 [ 7]。霍恩氏法根据实验数据直接在坐标纸上描点 画出直线。直线上相当于概率单位为 5 (反应率为 50% )的剂 量即为 LD50; 95%平均可信限: LD50 ? 1. 4@(LD84 - LD16 ) / m, 其中 m为 5% ~ 95%死亡率所用动物数。直线回归法较目测图 解法精确, 但相应的计算量较大。先求出各组数据的平均值 €x、 €y, 再计算 (X - €x ) ( Y- €y )和 (X - €x) 2及 E (X - €x ) ( Y- €y )和 E (X- €x) 2求得回归系数 b, 将 €x和 b代入直线回归方程 Y= €y+ b(X- €x) ,就能得到回归直线方程 [ 8]。这 2种方法的特点是简 单易行, 节省动物,不足的是所得 LD50的可信限范围较大, 不够 精确。但经多年来的实际应用与验证, 同一受试物与寇氏法所 得结果极为相近 [ 9]。因此对其测定的结果应认为是可信与有 效的。目测法能够用概率单位 - 对数纸直接求出 LD50, 不必查 对数表和反应率 - 概率单位表,从而使计算更为简便。 2. 5 序贯法 序贯法其名称源出于 WALD在 1948年发表的一本同名著 作, 它的研究对象是序贯抽样, 以及如何用这种抽样方案 得到的样本去作统计推断。应用在 LD50的计算时,序贯法也称 上下法 (Up2and2down procedure, UDP), 最早由 DIXON和MOOD 提出。 BRUCE [10]于 1985年在 Fundam App l Tox icol上对 UDP 进行了改进, 用于获取大概的 LD50。经济合作与发展组织 ( OECD)经过多次修订 , 于 2001年正式采纳 UDP法以评价受 试物的急性经口毒性 [ 11]。此外, UDP还被美国食品药品管理 局 ( FDA)和美国环保署 ( EPA)接受作为标准试验方法。我国 国家食品药品监督管理局 ( SFDA )颁布的 5化学药物急性毒性 试验技术指导原则6也推荐使用该方法, 其主要的计算原理是 通过阴性、阳性反应的数目来估计 LD50。UDP由限度试验和主 试验组成, 要求先把剂量集中使用在 50% 反应率的上下, 这样 可以节约实验动物。方法是选择一系列按等比级数排列的剂 量, 将动物逐只序贯地进行实验, 即先通过预实验得到一个近 50%反应率的剂量, 此时开始计算实验次数。当动物出现阴性 反应的时候, 就选用较高一级的剂量给予下一只动物;当动物 出现阳性反应的时候, 就选用较低一级的剂量给予下一只动 物。实验所需的有效动物总数 n, 应在实验开始前决定。UDP 现有计算机程序, 操作更为便利, 节约动物, 能够观察毒性表 现, 得到 LD50的估计值及相应的置信区间, 所需的受试物量 少 [ 12] ;但是实验的剂量要求成等比级数排列, 而且不能求得误 差, 无法对 2种不同处理所求得的结果进行显著性检验。 2. 6 固定剂量法 (F ixed dose procedure, FDP) 1984年英国毒理学会提出 FDP。布鲁塞尔后, 由欧洲 委员会出资在世界 33个实验室,对 20个化合物急性毒性实验 的新旧方法进行对比研究, 结果其毒性分级一致率为 87. 2% 。 可以用其代替一直沿用的 LD50法,而且可为危险度评价提供较 为足够的资料, 包括中毒作用性质、中毒发生时间、持续时间和 实验结果等 [ 13]。FDP法设固定剂量以观察动物的实验反应 , 不以死亡为依据, 而是按毒性症状来判断受试物质的毒性。一 个实验只需 10~ 20只动物, 首先采用 1只动物 (多为雌性 )顺 次间隔一定时间进行 5、50、500、2 000 mg /kg固定剂量的毒性 测试, 采用流程图和结果判别表格, 操作过程大大简化。应用 本法分级结果与我国毒性分级基本相似。OECD提出, 如果 500mg /kg处理时,无毒性反应时则做 1次 2 000 mg /kg的限度 试验, 仍无毒性反应且动物全部存活时即可终止实验 [14]。 2. 7 logistic模型法 章元明等 [ 15]提出用 logistic模型来确定 LD50的方法, 并于 1997年给出了抽样方差。 log istic回归是一种概率模型, 它以疾 病、死亡等结果发生的概率为因变量, 影响疾病发生的因素为 自变量建立回归模型, 通过寻找合适的模型进行 logit变换, 即 logit(p) = ln[ p /( 1- p ) ]来确定其方程。后经许多实例证明 , log istic模型法的结果可靠, 且多数毒性实验 LD50估计值的误差 不大。在测定 LD50的实验数据中, 因剂量 ( x )与死亡率 ( y, % ) 呈 S型曲线, 故可用模型 f ( x, H) = k /( 1 + ea - bx )拟合剂量与死 亡率的曲线。 LD50即 y = 50(% )时所对应的剂量 x。在毒性实 验中最大死亡率为 100% , 根据 log istic模型参数 k的生物学意 义可知, k= 100% ,于是 50% = 100% /( 1+ ee - bLD50 )。根据实验 数据, 用非线性模型参数估计的麦夸脱 (Marqua rdt)法, 估计模 型参数 a和 b,就可以得到 LD50 = a / b。同理,也可以获得稀释 度剂量的 LD50。由于稀释度一般较小 ,在模型拟合时可能产生 计算误差, 为使变换后的变量与死亡率仍呈 S形曲线, 故分别 采用对数剂量 ( - LD)和对数剂量相反数的倒数 ( 1 /LD)为自变 量, 用 log istic模型进行拟合其曲线以确定 LD50。当自变量取 - LD时, LD50为 y取 50(% )时所对应的 - x, 则 LD50 = - a /b;当 自变量取 1 /LD时, LD50为 y取 50(% )时所对应的 1/x, 则 LD50 = b/a。章元明等 [ 15]用此法计算马拉硫磷对雌性大鼠灌胃, LD50 为 1 314 mg/ kg, 与 K arber氏法的结果 ( 1 307 mg/kg)很接近。 相比 Karber氏法,此法的计算较为简单, 但若求置信度 95%的 区间估计, 则较难。 3 展望 以上介绍的各种方法同样也适用于与 LD50相似的毒性参 数的计算, 如半数致死浓度 ( LC50 )、半数感染量 ( ID50 )、致死中 浓度 ( IC50 )、半数耐受限量 (MTL48 )等 [ 16]。随着计算机的普 及, 用计算机程序计算 LD50成为最直接、最准确、最有效的方 法;但是,由于 LD50的求算造成了不必要的动物等资源浪费, 受 到了广泛的伦理学批评。动物权利国际组织一直批评用动物 进行 LD50测试, 特别是一些物质可能令动物在长时间痛苦的状 态下死去 [ 17]。英国等一些国家已开始禁止口服 LD50测试。 OECD亦在 2001年废除对口服毒性测试的要求, 而开展各种离 体和替代方法的研究和论证 [ 18]。新药的开发, 通常没有必要 求出精确的 LD50, 所要关注的是动物出现的毒性与剂量间的量 效关系。对于啮齿类动物, 不再需要给予致死水平的剂量。只 是在特殊情况下, 从科学的角度需要测定出较为精确的 LD50, 如细胞毒类抗癌药物通常用 LD50的 1/10来估计Ñ期临床试验 的安全起始剂量。 (下转第 511页 ) #508# 中国职业医学 2009年 12月第 36卷第 6期 Ch in O ccupM ed, December, 2009, Vo.l 36, No. 6 can t act ion and iden tificat ion of cand idate tox icity2related b iomarkers [ J]. 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