药用植物第九章

第九章 现代农业技术在药用植物生产上的应用 第一节药用植物无公害栽培技术 第二节药用植物现代设施栽培技术 第三节现代生物技术在药用植物生产上的应用 药用植物无公害栽培技术 (一) 无公害中药材的概念 药用植物无公害栽培,目的是采用栽培手段调节药用植物与产地环境关系,生产无公害的优质中药材。无公害中药材是指产地环境、生产过程和药材质量符合国家有关标准和规范要求,并经有资格的认证机构认证合格获得认证证书的未加工或者初加工的中药材产品。 (二) 无公害中药材产品法规的形成和发展 随着人类回归大自然的需求,传统的草药治病在世界上重新得到了重视,但在其生产和质量控制方面,各国目前尚没有一套统一的、完整的标准体系,基本上尚处在研究和完善过程中。 药用植物栽培种类多,规模小,生产者缺乏按质量标准要求进行生产的主动性,随意性强;市场流通中,大多数中药材散装上市,既无包装,也无标识,更无商标,一旦出现用药安全问题,很难跟踪溯源,追究生产者和经营者的责任;管理方面,涉及中药材用药安全的法规内容不完整,执法主体不明确,更缺少对中药材安全监管方面的法规。 二、药用植物无公害栽培对生态环境的要求 中药材是祖国药学的宝贵遗产,其栽培地的环境质量比一般食品的质量更为重要。因此,加强对药用植物栽培基地的环境质量监测及其所产中药材的有害物质检测、建立一整套绿色中药材基地的环境质量和有害物质评价标准,是生产绿色中药材所必需的。 我国的绿色食品生产已经建立了相关机构及其产地环境质量评价体系,但国内外尚未见有绿色药用植物栽培及其环境评价的报道,暂可借鉴绿色食品的有关评价方法和体系进行。 土壤 国家环保局1995年5月1日实施了土壤环境质量标准GB15618-1995,按土壤应用功能、保护目标和土壤主要性质,规定了土壤中污染物的最高允许浓度指标值及相应的监测方法,土壤环境质量标准分为三级。2001年1月1日实施了农田土壤环境质量监测技术规范GB/T18202-2000,规定了农田土壤环境监测的布点采样、方法、质控措施、数理统计、成果表达与资料整编等技术内容。 综合污染指数全面反映了各污染物对土壤的不同作用,同时又突出高浓度污染物对土壤环境质量的影响,因此,按综合污染指数最终评定,划分质量等级。为了规范中药材生产,保证中药材质量,促进中药标准化、现代化, 2002年6月1日,国家食品药品监督管理局实施了《中药材生产质量管理规范(试行)》,要求中药材产地的环境应符合国家相应标准,土壤应符合土壤质量二级标准。 在广泛收集、整理国内外有关中药材GAP理论研究与实践经验的基础上,2002年7月出版了《中药材生产质量管理规范研究与实践指南》,其中"中药材规范化种植研究的部分参考指标",可以作为药用植物无公害栽培时对环境指标要求的参考。 空气 国家环保局1996年10月1日实施了环境空气质量标准GB3095-1996,规定了环境空气质量功能区划分、标准分级、污染物项目、取值时间及浓度限值,采样与分样方法及数据统计的有效性规定,环境空气质量标准分为三级。 2000年12月1日实施了农区环境空气质量监测技术规范NY/T397-2000,规定了农区环境空气质量监测的布点采样、分析方法、质量控制、数据处理与成果表达的基本要求。 农区环境空气质量评价一般以单项污染指数为主,可直接采用《GB9137-1988》和《GB3095-1996》中的污染物浓度限值划分为三级;但当区域内环境空气质量作为一个整体与其他区域空气质量比较,或同一个区域内空气质量在不同历史时段内比较时,应采用综合污染指数评价,划分为五级。 《中药材生产质量管理规范(试行)》要求中药材产地的空气应符合大气环境质量二级标准。《中药材规范化种植研究的部分参考指标》指出:由于中药材GAP生产基地大气监测STP、SO2、NO2和氟化物四项指标,监测工作量大,当前大多数中型城市和发达城市已开展当日大气温测工作,其数据可以直接采用。 农田灌水 水是药用植物的主要组成成分,是连接土壤-药用植物-大气这一系统的介质。根据药用植物对水的适应能力和适应方式,将其划分为旱生植物、湿生植物、中生植物和水生植物。目前栽培的绝大多数属于中生药用植物,其生长发育期间除依靠自然降水外,需要灌水满足其对水分的需要,因此,农田灌水质量对药用植物的品质起 着非常重要的作用。 三、无公害栽培管理技术 (一) 无公害中药材生产的施肥技术 (二) 无公害中药材生产病虫害防治技术 无公害中药材生产的施肥技术 1 无公害中药材生产的施肥原则无公害中药材生产的施肥原则应是:以有机肥为主,辅以其他肥料;以多元复合肥为主,单元素肥料为辅;以施基肥为主,追肥为辅。 2 无公害中药材生产的施肥技术无公害中药材生产的施肥技术主要包括以下几个方面: (1) 注重施肥方式。应以底肥为主的原则,增加底肥比重。一方面有利于培育壮苗,另一方面可通过减少追肥(氮肥为主)数量,减轻因追肥过迟距临近成熟对吸收的营养不能充分同化所造成的污染,还可提高中药材的无公害程度。生产中宜将有机肥料全部底施,如有机氮与无机氮比例偏低,辅以一定量无机氮肥,使底肥氮与追肥氮比达6∶4,施用的磷、钾肥及各种微肥均采用底施方式。 (2) 注重肥料种类的选择。应以有机肥为主;宜使用的优质有机肥的种类有堆肥、厩肥、腐熟人、畜粪便、沼气肥、绿肥、腐殖酸类肥料以及腐熟的作物秸杆和饼肥等,通过增施优质有机肥料,培肥地力。农家肥以及人、畜粪便应腐熟达到无害化标准的原则。禁止使用未经处理的城市垃圾和污泥,以减少硝酸盐的积累和污染。 允许限量使用的化肥及微肥有尿素、碳酸氢铵、硫酸铵、P肥(磷酸二铵、过磷酸钙、钙镁磷肥等)、K肥(氯化钾、硅酸钾等)、Cu(硫酸铜)、Fe (氯化铁)、Zn(硫酸锌)、Mn(硫酸锰)、B(硼砂)等,掌握有机氮与无机氮之比为7∶3~6∶4,不低于1∶l。 (3) 开展进行平衡配方施肥。为降低污染,充分发挥肥效,应实施配方施肥,即根据药用植物营养生理特点、吸肥规律、土壤供肥性能及肥料效应,确定有机肥、N、P、K及微量元素肥料的适宜用量和比例以及相应的施肥技术,做到对症配方。 具体应包括肥料的品种和用量,基肥、追肥比例,追肥次数和时期,以及根据肥料特征采用的施肥方式。配方施肥是无公害中药材生产的基本施肥技术,尽量限制化肥的施用,如确实需要,可以有限度有选择地施用部分化肥。按照生产基地农田土壤的养分输入、输出相平衡的原则,做到N、P、K肥以及微肥的均衡供应。 采用平衡配方施肥,首先应分析某种药用植物生长所在地的土壤养分供应情况,同时测出该药用植物生长过程中的养分需求情况,在此基础上,根据生产目的确定适宜的施肥量。某种肥料需要量的估测,可用下式计算:肥料需要量=(一季作物的总吸收量-土壤养分供应量) ÷(肥料中该养分含量×肥料当季利用率)一季作物的总吸收量=目标产量×每千克产量养分的需要量 3 充分提高无机氮肥的有效利用率N是作物吸收的大量元素之一,生产中需施用氮肥补充土壤供应的不足。但大量施用N化肥对环境、中药材及人类健康具有潜在的不良影响,这是由于无机氮肥在土壤中易转化为NO3-—N 和NO2-—N,其中NO3-易被淋溶而污染地下水。NO2-—N除影响作物生长外,还可经反硝化途径形成氮氧化物释放至大气中,对环境造成不利影响。 无公害中药材生产病虫害防治技术 生产无公害的绿色中药材应立足于药用植物自身的保健,提高栽培管理水平,注意调节植物体内营养。这些措施不仅能提高中药材的产量和质量,而且有助于增强其抗病虫的能力,减少化学农药的使用次数和用量,在关键时期,选择使用高效、低毒、低残留的化学农药。 中药材的质量主要取决于其活性成分的含量,有些药用植物如人参、西洋参、金银花、枸杞等的病虫害发生频繁,过量施用农药,不但使中药材中农药残留超过FDA、WHO或我国规定的允许标准,直接损害人体健康;而且研究表明,某些药用植物施用农药不当,使其活性成分降低。因此,进行中药材无污染新技术的研究,生产无公害、优质的绿色中药材,是提高中药材产量和质量的重要环节。 无公害中药材生产病虫害防治应本着预防为主的指导思想和安全、有效、经济、简便的原则,采取综合防治的策略。即运用农业的、生物的、化学的、物理的方法及其他有效的生态手段,把病虫害的危害控制在经济阈值以下。 特别是其中以生物防治为基本手段的无污染新技术应用前景十分广阔,相关方面的研究已在我国"六·五"、"七·五"、"八·五"规划期间进行了全国性协作研究,取得了丰硕成果,许多成果可以有目的地引入、应用到药用植物病虫害的防治中来,并根据药用植物自身的特点开展生物防治研究、从管理及具体措施等方面有所创新、有所发 展,促使我国中药材优质高产,以满足人类健康的需要。 持续农业是当代世界农业的发展趋势。成功地管理各种资源以满足不断变化的人类需求,而同时保持或提高环境质量和保护自然资源是持续农业的基本内容。其核心是在提高农业生产率的同时,保护环境,保持资源的永续利用。 很显然,无公害生产技术在持续农业中具有明显的专业优势。世界环发大会保护环境宣言中已指出,2000年开始在全球范围内控制化学农药的销售和使用,这对应用及研究无污染新技术无疑起着极大的推动作用。 第二节 药用植物现代设施栽培技术 设施农业是指具有一定的设施条件,能在局部范围内改善或创造出适宜的气象环境因素,为动植物的生长发育提供良好的环境条件而进行有效生产的农业。设施栽培是设施农业的一个主要内容,保护地栽培和无土栽培是现代设施栽培技术的集中体现。 现代设施栽培在药用植物上的应用 (一) 保护地栽培 保护地栽培就是在不适合作物生长发育的条件下,利用保护设施,人为地创造一个适合植株生长发育的环境条件,从事作物生产的一种栽培方式。 1 简易设施 简易设施主要包括风障畦、冷床、温床和小拱棚覆盖等形式。其结构简单,容易搭建,具有一定的抗风和提高小范围内气温、土温的作用。 2 大棚 大棚是一种利用塑料薄膜或塑料透光板材覆盖的简易不加温的拱型塑料温室。它具有结构简单,建造和拆装方便、一次性投资少、运营费用低的优点,因而在生产上得到越来越普遍的应用。 主要因素有 ①通风好,但不能在风口上,以免被大风毁坏;②要有灌溉条件,地下水位较低,以利于及时排水和避免棚内积水;③建棚地点应距道路近些,便于日常管理和运输;④大棚框架可选用钢管结构、竹木结构或水泥材料,覆盖棚膜时应注意预留通风口,膜的下沿要留有余地,一般不少于30 cm,以便于上下膜之间压紧封牢。 3 温室 温室是一种比较完善的设施栽培形式,除了充分利用太阳光能以外,还用人为加温的方法来提高温室内温度,供冬、春低温寒冷季节栽培。加温温室依覆盖材料的不同分为玻璃温室和塑料温室。我国北方地区加温温室形式多样,在设施栽培育苗和冬季生产中发挥着重要作用。 无土栽培 无土栽培是一种新型的栽培方式。它是不用自然土壤来栽培植物的一项农业高新技术,因其以人工创造的作物根系环境取代了自然土壤环境,可有效解决自然土壤栽培中难以解决的水分、空气、养分供应的矛盾,使作物根系处于最适宜的环境条件下,从而发挥作物的生长潜力,使植物生长量、生物量得到很大的提高。 利用无土栽培技术进行药用植物生产,可以为药用植物根系生长提供良好的水、肥、气、热等环境条件,避免土壤栽培的连作障碍,节水、节肥、省工,还可以在不适宜于一般农业生产的地方进行药用植物种植,避免土壤污染(生物污染和工业污染),生产出符合GAP标准的药材。 无土栽培 1 栽培基质 2 营养液 1 栽培基质 栽培基质既有无机基质、有机基质,又有人工合成基质。其中包括砂、石砾、珍珠岩、蛭石、岩棉、泥炭、锯木削、稻壳、多孔陶粒、泡沫塑料、有机废弃物合成基质等。总的说来,栽培基质的基本要求是通气又保湿。常用的几种消毒方法有: (1) 蒸汽消毒。凡有条件的地方,可将待用的栽培基质装入消毒箱。生产上面积较大时,可以堆垛消毒,垛高20 cm左右,长宽根据具体需要而定,全部用防高温、防水蓬布盖上,通水蒸气后,在70~90℃条件下,消毒1 h即可。 (2) 化学药剂消毒。 福尔马林(40%甲醛溶液)一般将原液稀释50倍,用喷壶将基质均匀喷湿,覆盖塑料薄膜,经24~26 h后揭膜,再风干2周后使用。 氯化钴氯化钴熏蒸时的适宜温度为15~20℃,消毒前先把基质堆放成高30 cm,长宽根据具体条件而定。在基质上每隔30 cm打一个10~15 cm深的孔,每孔注人氯化钴5 mL,随即将孔堵住。第一层打孔放药后,再在其上面同样地堆上一层基质,打孔放药,总共2~3层,然后盖上塑料薄膜,熏蒸7~10 d后,去掉塑料薄膜,晾7~ 8 d后即可使用。 (3) 太阳能消毒。 太阳能是近年来在温室栽培中应用较普遍的一种廉价、安全、简单实用的土壤消毒方法,同样也可以用来进行无土栽培基质的消毒。具体方法是:夏季高温季节,在温室或大棚中把基质堆成20~25 cm高,长、宽视具体情况而定,堆垛的同时喷湿基质,使其含水量超过80%,然后用塑料薄膜盖上基质堆。密闭温室或大棚,曝晒10~15 d,消毒效果良好。 2 营养液 营养液是无土栽培的核心部分,它是将含有各种植物必需营养元素的化合物溶解于水中所配置而成的溶液。植物生长所必需的营养元素共有16种,其中C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S为大量营养元素,Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo、Cl为微量元素。除C、H、O三种营养元素可以从水和空气中获得之外,营养液配方中还必须含有另外6种大量元素和7种微量元素,即N、P、K、Ca、Mg、S和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo、Cl。 二、药用植物现代设施栽培的发展趋势 近些年来,随着营养液配方研究的不断深入,无土栽培获得了理论和技术上的很大进步。如:雷士敏等总结出了营养液配方换算简法;卢克成应用化肥取代试剂进行观赏植物的无土栽培取得了很大成功,成本仅为试剂配制的营养液的36%~56.3%; 杜永臣研究了无土栽培营养液中N含量及其调控方法,阐明了不同形态N对植物的影响,从而可以根据植物不同生育阶段对养分需求的特征,相应地调整营养液的配方;郑光华等通过分析北方各地的水质,探讨了北方硬水地区配制营养液应采取的措施和适宜的无土栽培系统; 沈阳展望农业科技有限公司开发的"静止法无土栽培营养液技术"实用简单,该公司研究了栽培过程中离子的变化规律,开发出了可以长期静止在栽培作物底部,供植物利用的营养液配方,只需根据栽培体的湿度补充营养液即可,实施起来像浇水一样简单。 封闭式的强化快繁通风育苗系统和自动监测大规模培养系统是近年来农业设施的新发展,在国外已应用于花卉及农作物的生产,该系统可用于21世纪药用植物的栽培。这一栽培系统还可以和大田栽培系统结合起来,以封闭式的强化快繁通风育苗系统大量、快繁优质种苗,然后移至基地去生产。日本科研人员的实验表明,用此种方式育苗,可以大大缩短育苗时间,同时所育出的幼苗质量好、成活率高。 第三节 现代生物技术在药用植物生产上的应用 生物技术是以生物体系(个体、组织、细胞、基因)和生物工程原理来生产生物产品,培育新的生物品种,或提供社会服务的综合性技术。生物技术的兴起为我国的药用植物生产、研究和发展提供了良机和手段,并将有效促进我国中药事业的发展。 应用生物技术开展药用植物快速繁殖、资源保护 (一) 采用组织培养方法进行药用植物的脱病毒、快繁、保存和纯化 植物组织培养应用于植物的离体快繁,是目前应用最多、最广泛和最有成效的一种技术。组织培养不受地区、气候的影响,比常规繁殖方法快数万倍到数百万倍,为快速获得药用植株提供了一条经济有效的途径。 1 稀缺或急需药用植物良种的快速繁殖 某些新育成或新引进的良种,由于生产上急需,可用试管快繁来解决。台湾在1988-1993年间用离体快繁技术繁殖金线莲600万株。宁夏农林科学院枸杞研究所利用试管繁殖与嫩枝扦插相结合的繁殖方法繁殖枸杞新品种"宁夏1号"和"宁夏2号"苗木100多万株,加速了新品种的推广。 2 杂种一代及基因工程植株的快速繁殖 我国在20世纪80年代,就培育出药用价值较高的杂种一代和转基因植株。如进行平贝母和伊贝母种间远缘杂交,产生的后代繁殖力低,利用组织培养方法对杂交植株进行无性快繁,既可保持杂种一代的原有性状和杂种优势,又解决了杂种后代繁殖力低的问题。 又如,百合种间远缘杂交时,对获得的杂种胚进行离体培养,直接成苗或形成愈伤组织后分化成苗。转基因技术建立在重组DNA技术基础上,通过克隆技术,由重组后的组织无性繁殖出生物个体,如转基因曼陀罗、红豆杉通过组织培养方法,保持了转基因目的性状的稳定性。 3 濒危植株的快速繁殖 试管繁殖是药用植物生物技术中一个较成熟的方法,对于珍稀濒危药用植物的资源保护、品种纯化和质量稳定具有十分重要的意义。金线莲生长在海拔600~1 800 m的森林覆盖地,药用价值极高。 野生金线莲处于濒危的处境,台湾种子公司通过用种子和茎培养繁殖出数百万株金线莲,成功种植到海拔500~ 1 800 m的山地。我国已对珍稀濒危野生植物如铁皮石斛、川贝母、紫杉等采取组织培养的手段建立起无性繁殖系来对这些物种进行繁衍和保存。 花药培养为主的单倍体育种 自1964年Guaha等获得曼陀罗花药单倍体植株以来,在国际上引起了很大重视,并广泛开展了这方面的研究工 作。我国在药用植物的花药培养方面也做了很多工作,1979年我国首先用地黄(Rehmania glutinosa)花粉诱导出了绿色植株,并对获得的植株进行了染色体鉴定。 1980年用乌头(Aconitum carmichaeli)的花药培养成功,获得了完整植株。同年,用薏苡(Clolix lacryma)花粉孢子体也培养出植株,并对花粉染色体进行了鉴定。1981年用宁夏枸杞(Lyclum berbaum)花药培养成功,获得了花粉植株。1986年人参(Panax ginseng)、平贝母(Fritilaria ussuriensis)花药培养成功,获得了再生植株。 利用组织培养技术诱导多倍体 药用植物多倍体一般具有根、茎、叶、花、果的巨型性、抗逆性强、药用成分含量高等特性,因此药用植物的多倍体育种具有较高的应用价值和增产潜力。 日本培育出的白花曼陀罗(Datura stramonium)四倍体生药重量为二倍体的1.72倍,总生物碱是二倍体的1.76倍,表现出多倍体育种的优异效果。此外,日本培育出的甘菊(Matricaria chamomilla)四倍体品种,其甘菊素含量是二倍体的1.2倍,体积是二倍体的2.3倍。 我国也对当归、牛膝、板蓝根进行了多倍体育种,取得了较好的增产效益。在组织培养中,用秋水仙碱等诱变剂处理培养的愈伤组织胚状体或丛生芽,从而获得多倍体植株,是诱发多倍体的较好方法。陈素萍等在诱导党参多倍体时将一定浓度的秋水仙碱加入培养基中,使种子在发芽中逐渐加倍,然后通过组织培养的方法获得了大批量的再生植株。 陈柏君等诱导黄芩同源四倍体时采用组织培养的方法先获得愈伤组织,然后转移到分化培养基上诱导生芽,当培养基上长出绿色芽点时,将带芽点的愈伤组织置于含有秋水仙碱的培养基上培养,或放入秋水仙素水溶液中浸泡,最后依次经分化及生根培养基培养获得再生植株。 胚乳培养产生三倍体植株 在组织培养中植物的胚乳培养是产生三倍体植株的主要方法。胚乳是由精细胞和两个极核融合而产生的,因此是三倍体细胞。在适宜的条件下能诱导产生三倍体植株,三倍体植株往往表现为无籽,在种子和果实类药材中,如山茱萸、枸杞中进行三倍体育种,培养出无核或无籽的品种无疑对其加工利用带来极大的方便。 我国已成功用枸杞胚乳诱发获得了三倍体的植株。此外,三倍体植株经自然加倍或秋水仙碱处理加倍可以产生六倍体,这也是产生多倍体植株的又一有效途径。 体细胞突变育种 在植物器官培养中往往首先产生大量愈伤组织,这是一种非组织形式继续增殖的细胞团,由于在培养过程中,外界环境及培养基成分和激素水平的改变,在组织培养的细胞团中往往出现一些突变类型。在药用植物细胞培养中,筛选或诱发次生代谢产物高的体细胞突变系,进而培养成高产细胞系是提高细胞培养产物产量的有效途径。 转基因抗病育种 基因工程是利用分子生物学和微生物遗传学的现代研究方法和手段发展起来的,由于这些领域的迅速发展,如今已有可能人工定向改变药用植物的遗传性状,培育出一些具有抗病、抗虫、抗除草剂等药用植物新品种。如在抗虫害研究方面Delannay等用HD-1菌株的毒蛋白基因转入到番茄细胞之后所做的大田试验的结果表明,转基因的番茄植株系上虫害确实得到了有效控制。 利用原生质体融合进行细胞杂交育种 自从Cooking 1960年开创了植物原生质体培养的研究新纪元以来,茄科中一些药用植物就开始作为模式系统来研究植物原生质体的培养和再生。原生质体不仅具有单个活细胞的全能性,而且它是没有细胞壁的裸露细胞,易于摄取外来的遗传物质,细胞器以及其他载体,从而为高等植物的遗传转化等提供了有利条件。由于裸露的原生质体彼此可以融合,从而使原来不能杂交的药用植物(如自交不亲和或远缘杂交不亲和)的杂交变为可能。 另外,通过原生质体培养能得到由单细胞衍生出来的体细胞克隆细胞系,这是药用植物筛选高产、稳定细胞系的较好途径。Fujita利用原生质体培养,筛选出15个紫草素高产细胞系,最高活性为亲本的两倍,且在继代培养中表达稳定。利用原生质体培养技术结合理化诱变,可选择有用的突变细胞系,将单倍体的原生质体用诱变剂处理后再进行培养可选出一定突变特性的细胞系或植株。 DNA分子标记在药用植物分类和药材鉴定上的应用 (一) 分子水平上的药用植物分类 (二) 药材的分子鉴定 分子水平上的药用植物分类 药用植物资源的研究采用经典的形态学划分物种是建立在个体性状描述的宏观观测水平基础上,易引起争议。现代的分子生物学表明,药用植物的遗传多样性是由于基因多态性所致,而DNA分子标记技术就是一种在DNA 分子水平上检测基因多态性的技术。 DNA分子标记技术又称DNA分子诊断技术,是研究DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性的技术。 目前该技术主要分三类: 第一类是以电泳技术和分子杂交技术为核心,主要有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting); 第二类是以电泳技术和PCR技术为核心,主要有随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA, RPAD)和扩增片段长度多态性(amplified restriction fragment polymorphism,AFLP); 第三类是以DNA序列为核心,主要有内转录空间(internal transcribed spacers,ITS)测序技术。 药材的分子鉴定 传统的中药鉴别方法主要依据药材的颜色、形状、气味、味道和质地等感性特征,这种鉴定方法的不足之处在于很不准确,而人们对这些特征的把握也因人而异。DNA分子作为遗传信息的直接载体,不受环境因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响,每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息,多态性几乎遍及整个基因组。 药用植物DNA分子鉴定就是运用DNA分子标记技术对生药和含有生药的中成药及其基源进行真伪的鉴定,它具有特异性强、稳定性好、微量、便捷、准确等特点,特别适合于近缘品种、易混淆品种、珍稀品种、破碎药材、陈旧药材的鉴定。 应用生物技术加快次生代谢物的生产 (一) 对次生物质代谢途径的研究 大部分中药含有的次生代谢产物是其药理作用的物质基础,因此加强次生物质代谢途径的研究显得非常重要。通过筛选高产细胞系,改进培养条件和技术,以及设计适合植物细胞培养的发酵罐来提高次生代谢物的含量。 由于植物组织和细胞培养技术的发展,以及单细胞的培养成功,使植物像微生物那样在大容积的发酵罐中进行发酵培养成为可能,并大量生产了微生物所不能合成的药用成分。 4 带病药用植株的脱毒 迄今为止,我国已经报道的药用植物病毒病有太子参花叶病、地黄病毒病、八角莲花叶病、浙贝母黑斑病等10余种。病毒病的危害是影响药用植物产量和质量的重要因素。由于病毒病的危害,一般减产幅度在30%以上,成为药材生产上的重要障碍。20世纪80年代,人们就采用了茎尖脱毒的方法,解决了病毒病的危害。脱毒苗通过组织培养克隆繁殖可获得大量脱毒优良种苗供生产上应用。 建立药用植物种质基因库 利用生物技术建立种质基因库是保存药用植物种质资源的有效手段。将离体培养的药用植物器官、组织和细胞在常温下或超低温下保存,建立集约化的细胞库,可作为种质保存的一种形式并在需要时可以随时取出利用。 在分子水平上可以建立DNA库,在低温条件下保存药用植物的基因组总DNA、克隆的基因、组装好的质粒和RFLP探针,即使在某种药用植物灭绝的情况下,其基因也可得以保存并加以利用。 二、应用生物技术进行药用植物育种 (一) 花药培养为主的单倍体育种 (二) 利用组织培养技术诱导多倍体 (三) 胚乳培养产生三倍体植株 (四) 体细胞突变育种 (五) 转基因抗病育种 (六) 利用原生质体融合进行细胞杂交育种 花药培养为主的单倍体育种 自1964年Guaha等获得曼陀罗花药单倍体植株以来,在国际上引起了很大重视,并广泛开展了这方面的研究工作。我国在药用植物的花药培养方面也做了很多工作,1979年我国首先用地黄(Rehmania glutinosa)花粉诱导出了绿色植株,并对获得的植株进行了染色体鉴定。1980年用乌头(Aconitum carmichaeli)的花药培养成功,获得了完整植株。同年,用薏苡(Clolix lacryma)花粉孢子体也培养出植株,并对花粉染色体进行了鉴定。1981年用宁夏枸杞(Lyclum berbaum)花药培养成功,获得了花粉植株。1986年人参(Panax ginseng)、平贝母(Fritilaria ussuriensis)花药培养成功,获得了再生植株。通过单倍体育种途径选育新品种,由于其来自父母本的显隐性状均可以当代表现出来,经染色体加倍后就可获得纯合的二倍体,这比常规的育种方法缩短了育种年限。 利用组织培养技术诱导多倍体 药用植物多倍体一般具有根、茎、叶、花、果的巨型性、抗逆性强、药用成分含量高等特性,因此药用植物 的多倍体育种具有较高的应用价值和增产潜力。日本培育出的白花曼陀罗(Datura stramonium)四倍体生药重量为二倍体的1.72倍,总生物碱是二倍体的1.76倍,表现出多倍体育种的优异效果。此外,日本培育出的甘菊(Matricaria chamomilla)四倍体品种,其甘菊素含量是二倍体的1.2倍,体积是二倍体的2.3倍。我国也对当归、牛膝、板蓝根进行了多倍体育种,取得了较好的增产效益。在组织培养中,用秋水仙碱等诱变剂处理培养的愈伤组织胚状体或丛生芽,从而获得多倍体植株,是诱发多倍体的较好方法。 胚乳培养产生三倍体植株 在组织培养中植物的胚乳培养是产生三倍体植株的主要方法。胚乳是由精细胞和两个极核融合而产生的,因此是三倍体细胞。在适宜的条件下能诱导产生三倍体植株,三倍体植株往往表现为无籽,在种子和果实类药材中,如山茱萸、枸杞中进行三倍体育种,培养出无核或无籽的品种无疑对其加工利用带来极大的方便。我国已成功用枸杞胚乳诱发获得了三倍体的植株。此外,三倍体植株经自然加倍或秋水仙碱处理加倍可以产生六倍体,这也是产生多倍体植株的又一有效途径。 体细胞突变育种 在植物器官培养中往往首先产生大量愈伤组织,这是一种非组织形式继续增殖的细胞团,由于在培养过程中,外界环境及培养基成分和激素水平的改变,在组织培养的细胞团中往往出现一些突变类型。在药用植物细胞培养中,筛选或诱发次生代谢产物高的体细胞突变系,进而培养成高产细胞系是提高细胞培养产物产量的有效途径。 转基因抗病育种 基因工程是利用分子生物学和微生物遗传学的现代研究方法和手段发展起来的,由于这些领域的迅速发展,如今已有可能人工定向改变药用植物的遗传性状,培育出一些具有抗病、抗虫、抗除草剂等药用植物新品种。如在抗虫害研究方面Delannay等用HD-1菌株的毒蛋白基因转入到番茄细胞之后所做的大田试验的结果表明,转基因的番茄植株系上虫害确实得到了有效控制。我们可将这种基因转入到药用植物的细胞之中以改变药用植物的品质。通过分子生物学技术可以使自身获得抗病毒的能力以提高药用植物产量,并获得高质量的药源,避免了从以往使用农药而带来的不良后果。 利用原生质体融合进行细胞杂交育种 自从Cooking 1960年开创了植物原生质体培养的研究新纪元以来,茄科中一些药用植物就开始作为模式系统来研究植物原生质体的培养和再生。原生质体不仅具有单个活细胞的全能性,而且它是没有细胞壁的裸露细胞,易于摄取外来的遗传物质,细胞器以及其他载体,从而为高等植物的遗传转化等提供了有利条件。由于裸露的原生质体彼此可以融合,从而使原来不能杂交的药用植物(如自交不亲和或远缘杂交不亲和)的杂交变为可能。地黄是自交不亲和植物,应用原生质体融合技术就可克服其限制亲和的生理因素而获得杂交种。我国目前已经对药用植物龙葵、曼陀罗、颠茄、明党参通过体细胞杂交的方式获得种间杂种和种内杂种植株,并且对枸杞、龙胆草也已开始了这方面的探索。 DNA分子标记在药用植物分类和药材鉴定上的应用 (一) 分子水平上的药用植物分类 药用植物资源的研究采用经典的形态学划分物种是建立在个体性状描述的宏观观测水平基础上,易引起争议。现代的分子生物学表明,药用植物的遗传多样性是由于基因多态性所致,而DNA分子标记技术就是一种在DNA 分子水平上检测基因多态性的技术。DNA分子标记技术又称DNA分子诊断技术,是研究DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性的技术。目前该技术主要分三类:第一类是以电泳技术和分子杂交技术为核心,主要有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting);第二类是以电泳技术和PCR技术为核心,主要有随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RPAD)和扩增片段长度多态性(amplified restriction fragment polymorphism,AFLP);第三类是以DNA序列为核心,主要有内转录空间(internal transcribed spacers,ITS)测序技术。 (二) 药材的分子鉴定 传统的中药鉴别方法主要依据药材的颜色、形状、气味、味道和质地等感性特征,这种鉴定方法的不足之处在于很不准确,而人们对这些特征的把握也因人而异。DNA分子作为遗传信息的直接载体,不受环境因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响,每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息,多态性几乎遍及整个基因组。药用植物DNA分子鉴定就是运用DNA分子标记技术对生药和含有生药的中成药及其基源进行真伪的鉴定,它具有特异性强、稳定性好、微量、便捷、准确等特点,特别适合于近缘品种、易混淆品种、珍稀品种、破碎药材、陈旧药材的鉴定。道地药材除了与栽培方法、生态环境有关外,还与物种居群的遗传特异性有关,这可能是造成道地性药材与非道地性药材品质差异的原因。 应用生物技术加快次生代谢物的生产 (一) 对次生物质代谢途径的研究 大部分中药含有的次生代谢产物是其药理作用的物质基础,因此加强次生物质代谢途径的研究显得非常重要。通过筛选高产细胞系,改进培养条件和技术,以及设计适合植物细胞培养的发酵罐来提高次生代谢物的含量。由于植物组织和细胞培养技术的发展,以及单细胞的培养成功,使植物像微生物那样在大容积的发酵罐中进行发酵培养成为可能,并大量生产了微生物所不能合成的药用成分。 药用菌物是中药宝库中的一个重要组成部分,传统名贵中药冬虫夏草、灵芝等采用发酵工程技术,从发酵产物中提取活性成分,可提高生产速度和扩大生产规模。利用发酵技术生产药用活性成分,还可使药品生产规范化,保证药源质量稳定。 (二) 对次生代谢物的生物合成途径的研究 植物的次生代谢非常复杂,是由不同的代谢途径、分许多步骤、在不同的酶类参与下产生的。在次生代谢物生物合成途径的研究中,通过改变次生代谢关键酶基因来调控次生代谢物的产生是比较理想的方法,还可以加入所需次生代谢物生物合成的前体物质,或者加入诱导子、抑制剂及激活生物合成途径的关键酶或抑制支路产物的形成,从而对次生代谢物进行调控。可以应用酶分析技术,结位素示踪方法。有关代谢基因工程的研究,先搞清次生代谢物的生物合成途径,找出形成活性成分的关键酶,确定其基因结构,再进行克隆、表达或基因重组以提高活性成分的含量。 利用发根农杆菌遗传转化获得毛状根生产次生代谢产物 发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)含有诱导生根的质粒-Ri质粒,用它来侵染药用植物可建立起"毛状根"培养系统。与传统的细胞培养技术相比,毛状根培养具有生长速度快,激素自养,分化程度高以及遗传性状相对稳定等优点。我国近1/3的传统药材的药用部位为根,通过毛状根大规模培养,从中提取有价值的次生代谢产物具有应用前景。