杠板归的化学成分及其生物活性的研究

杠板归的化学成分及其生物活性的研究 ’. : : : . , .. 了浙江工商大学硕士学位 ‘’『: 杠板归的化学成分及其生物活性研究 摘要 ‘, 杠板归又名贯叶蓼,为蓼科蓼属植物杠板归的全草。杠板归分布 较广,具有清热解毒、散结消肿、活血止痛、顺气解痉、收敛止泻、 通经利尿等功效,用于治疗百日咳、扁桃体炎、带状疱疹皮炎、淋浊、 疮疖毒、虫蛇咬伤等病症。现代药理研究明,杠板归体具有抗癌活 性,而对其化学成分的研究相对较少。为研究杠板归中的有效活性成 分,本文主要对原料杠板归的化学成分进行系统地提取分离及纯化, 从中共分离得到了个单体化合物,并通过质谱、一维和二维核磁共 振谱鉴定了它们的结构,其中有个为新化合物,个为首次从杠板归 ’’’ 中分离得到,并对部分化合物单体进行了初步的活性研究。本文的主 要实验结果如下: 、杠板归石油醚萃取相采用正相硅胶柱色谱等方法进行了分离, 从中分离得到了一谷甾醇,。 、杠板归乙酸乙酯萃取相采用正相硅胶柱色谱、.柱色谱、 .和制备型等方法进行了分离,从中分离得到个 化合物,即化合物、化合物、化合物?和化合物。通过.、 图谱分析鉴定了它们的结构,分别为二十五烷酸 ,、槲 ,、二羟基苯甲酸,一 皮素,、.羰基一松脂酚?,。其 ..?‘‘‘’浙江工商人学硕上学位论文 中化合物为新化合物。 、杠板归正丁醇萃取相采用型大孔树脂分离,用水、%、 %、%和%的乙醇溶液洗脱得到不同极性的组分:%乙醇洗 脱部分通过.反向硅胶柱色谱分离得到化合物?;%乙醇沈脱 .分离得到化合物?和化合物;而%乙醇 部分通过 .分离得到化合物?和 洗脱部分通过正相硅胶柱色谱、 化合物?。经过分析鉴定其结构分别为:槲皮素..??.葡萄糖醛酸 一??,、槲皮素一’一葡萄糖醛酸 ?’一?,和芦丁,?。化合物 和?为首次从杠板归中分离得到。 、杠板归化学成分的生物活性研究 研究发现杠板归中黄酮类化合物具有较强的抗氧化能力,在低浓 度./下测得样品对自由基的清除能力较高, 自由基的清除率可达%以上;并对黄酮类化合物的结构与其抗氧化 活性的关系进行了探讨。 利用法测定了化合物?和的体外抗肿瘤活性,化合物? . 对人前列腺癌细胞具有较好的的抑制作用,旷. /;化合物人前列腺癌细胞及人肝癌.细胞均 具有较好的体外增殖抑制作用,其中对于人肝癌.细胞的 体外增殖抑制作用明显好于对人前列腺癌细胞的抑制作用, 分别为.士./和.士.斗/。 此外,论文还对近年来蓼属植物的化学成分研究进行了综述,本 一 浙江工商大学硕七学位论文 实验对杠板归化学成分进一步的研究及物质的生物活性提供技术支 持和科学依据。 关键词:杠板归;化学成分;提取分离;结构鉴定;生物活性浙江工商大学硕: 上二学位论文 眦 /. ,. . , ,,,. .,.. ,, ,. ,, , . ,: . . 浙江商人学硕学位沦文. .., , ?, : ,,一 ,, . . ;.。,。。? . ?. % %,%,%%. % 一’一??; ,?.. ... ..。。.,『『.% ./。 , ? .,. . , 浙江丁商人学硕:学位论文. . , . . .; ; :; ; 一 ?“~一一~??“一~一一一??~~?~一一?‘‘?~~‘‘‘‘ ......?? 浙江商人学硕二学位论文 目录 第章引言 .杠板归的研究概况 ..杠板归概况 ..杠板归化学成分研究的进展 ..杠板归药理研究概况 .蓼科蓼属植物化学成分研究进展 ..蓼属植物系统分类 ..蓼属植物化学成分研究进展 ..蓼属植物的生理活性 .蓼属化学成分的分离检测方法 .本课题研究的意义和内容 第章实验部分 屯叫叫呜埒 .实验、试剂与仪器 ..实验材料 ..试剂 ? ..仪器 .显色方法 ..紫外检测 ..碘蒸气 .. %硫酸一乙醇显色系统 ..茴香醛一硫酸显色系统 ..盐酸一镁粉试验 ..反应 ..溴甲酚绿 .杠板归化学成分的提取 ..杠板归原材料的预处理 .杠板归石油醚相化学成分分离纯化 ..硅胶装柱 ..一卜样方法 ..样品粗分 .杠板归乙酸乙酯相化学成分分离纯化 ..样品粗分 ..组分.~的细分 ??『?『 ..组分.的细分 ..组分.~的绌分 .杠板归正丁醇相化学成分分离纯化 ..大孑树脂的装备及上样 ..乙醇洗脱 ..正一组分分离纯化?一一 ..正一组分分离纯化 坫坫埔坞坞怕博懈拇均加加毖盟筋舱拍砑勰凹 浙江工商人学硕.:学位论文 ..正一组分分离纯化 第章化合物的结构鉴定与讨论 .实验材料与设备一 ..材料与试剂 ..仪器设备 .实验方法 .. .. ?分析 .. 测定 .结果与讨论 ..化合物的结构鉴定 ..化合物的结构鉴定 ..化合物的结构鉴定 ..化合物?的结构鉴定 ..新化合物的结构鉴定 ..化合物?的结构鉴定 ..化合物?的结构鉴定 ..化合物?的结构鉴定 ..小结 第章化合物的生物活性研究 .实验仪器与材料 ..仪器 ..材料与试剂 .抗氧化活性测定??法 ..?:验方法??一 ..结果与讨论 .抗肿瘤生物活性体外筛选试验??.法 ..实验检测方法 ..体外肿瘤细胞增殖抑制试验 ..结果与讨论 ????? 第章总结 参考文献 附图 ? 攻读学位期间发表文章 致谢 独创性声明 凹札甜札驼乾驼驼昭?姐踮拈盯?虬们蛎卯钉钾钉钉鸫鹕的的 豇豇弱融叭龇跎踮 浙江工商人学硕士学位论文 第章引言 .杠板归的研究概况 ..杠板归概况 .又名蛇倒退、蛇不过、老虎刺、贯叶蓼、 杠板归 犁尖草、三角盐酸、山养麦、老虎艽、河白草等,为蓼科属植物贯叶蓼的全 草, 系多年生蔓性草本埘。其茎有棱,红褐色,有倒生钩刺;叶互生,盾状着生; 叶片近三角形,长 ,宽~ ,先端尖,基部近心形或截形,下面沿 脉疏生钩刺;托叶鞘近圆形,抱茎;叶柄长,疏生倒钩刺。花序短穗状;苞片圆 形;花被深裂,淡红色或白色,结果时增大,肉质,变为深蓝色;雄蕊;花 柱裂。瘦果球形,包于蓝色多汁的花被内。花期~月,果期~月。 杠板归牛于海拔 米以下的山坡路旁、房屋附近,在全国各地均有分布【~, 主产于江苏、浙江、福建、江西、厂‘东、广西、四川、湖南、贵州等地, 夏、 秋季采收。 ..杠板归化学成分研究的进展 ...杠板归中黄酮类 黄酮类为杠板归的主要化学成分之一。张荣林等从杠板归 巾分离到种黄酮类化合物:山奈酚、槲皮素、蓄苷 葡萄糖醛酸甲酯 、芦丁、槲皮素.? 一葡萄糖醛酸正丁酯、槲皮素.? ? 一?一? 、山奈酚一..芸香糖苷一? 王定勇、卢江红从中分离到槲皮素一..葡萄糖甙 ?一?【】。刘家明等从杠板归的地一卜部全草获得了 ?? 。 个新的黄酮碳甙 等从 和 中发现了一个新黄酮一二氢..羟基.’.羟基苯基一.甲氧基香豆素 ????。?浙江商人学硕士学位论文 。 ,一..... ...杠板归中蒽醌类 王定勇等从杠板归中分离到蒽醌类的大黄素、大黄素甲醚 。 、芦荟大黄素 ...杠板归中苯丙素糖酯类 等报道了该植物中个新苯丙素糖酯类化合物,其中有个新成分:’, ,?; ’,一,; ,.,.;’,’..,.’。 ...其他化学成分 等报道了该植物中的香豆素的衍生物‘?】。王定勇等报道,杠板归含 .??????????..、.. 有.谷甾醇、反式.对羟基肉桂酸甲酣】;刘家明等从杠板归的地上部全草获 得 了个苦木素类化合物;此外,据报道杠板归中还含有含靛甙 、阿魏酸 、水蓼素、.香豆酸. 、香草酸 、原儿茶酸 、咖啡酸 ??, 等常见物质【】。 ?. ..杠板归药理研究概况 据《中药大辞典》记载,该植物全草人药,秋季采收全草,洗净,晒干或鲜 用;性酸、苦、平,具有清热解毒、杀虫.卜痒、祛风.:咳、利水消肿之功效, 民 间广泛用丁.治疗水肿,黄疸,疟疾,痢疾,百日咳,溃疡,丹毒,湿疹,疱疹, 疥癣及毒蛇咬伤等,疗效确切。 ...止咳祛痰作用 顾汉冲在其镇咳和祛痰实验研究中,通过用氨水引咳方法进行小鼠实验,发 现杠板归低剂量组. 体重对小鼠具有明显的镇咳作用,且高剂量组 ./ 体重优于低剂量组;酚红祛痰实验中,只有高剂量组对促进小白鼠 呼吸道内酚红的排泌有显著统计学意义,发现只有杠板归高剂量组对祛痰具 有镀 著统计学意义【】。 顾汉冲等对海安县中医院所制的“杠板归糖浆”进行了系统的临床疗效观察, 用于治疗咳嗽的临床中总有效率为.%,疗效明显高于常用的巾成药“川贝枇 浙江商人学硕:学位论文 杷糖浆”,且无任何副作用【。 ...治疗带状疱疹作用 李嫣等采用杠板归外敷的基础.:加用局部围针治疗例带状疱疹,其促进 血液循环,效果良好,均于内治剑 。付体易用鲜杠板归茎叶捣烂,用凡士 林适量调敷于带状疱疹忠处,每 换次,例忠者.伞部消失而愈,无 神经痛等后遗症’。 ...抗癌作用 杠板归是常用的清热解毒类抗癌中药的一种。清热解毒类抗癌巾药的抗癌作 用主要体现在:直接的抑癌和抗肿瘤作用、调节机体免疫功能、抗炎排毒及对抗 肿瘤感染和痛性发热‘】。杠板归对多种动植物移植忡肿瘤有抑制作用,体外实 验显示具抗癌活性,对放疗及化疗引起的白细胞减少有防治作用?】。体外噬菌 ??? 体法筛选表明,杠板归有抗癌活性;体内实验证明,杠板归对实验性动物移植肿 瘤有抑制作用‘’。 ...其他作用 杠板归是一种中草药,其煎剂对金葡萄菌及各种细菌有抑制作用,有促进创 面水肿消退之功效,林裕韬用杠板归煎剂治疗烧伤残余创商患者例临床情况, 获得了满意的效果瞄。杠板归还在治疗痔瘘术后具有良好的防止感染和止血的 综合应用。 ???????????? 任立民等采用水培试验,研究了不同的锰营养水平。卜.,水蓼、小乜蓬、杠 板 归和美洲商陆的生理响应,通过内二醛含量、质膜透性、根系活 ?? 力、可溶性糖含量、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量等指标的进行 分析。在高浓度锰处理下./,杠板归的质膜透性极显著升高 .,根系活力明显降低.,地上部锰含量极显著增加.,丙 二醛含量明显上升.。植物通过维持较低的质膜透性和丙二醛含量、较 ????『 高的根系活力、稳定的可溶性糖及叶绿素含量来增强耐锰性,研究最终发现,杠 板归的耐锰性较强,并且杠板归已达到锰超富集植物的标准。这将弥补现有超富 集植物数量的不足,为植物修复技术的产业化提供必要的物质保证【。浙江工商人学硕学位论文 .蓼科蓼属植物化学成分研究进展 蓼属 .是蓼科的一个大属,为一年生或多 年生草本,稀为半灌小或小灌木,品种繁多,分布广泛,全世界约种,主 要分布于北温带,我同约有种变种【。蓼属植物是世界各困重要的传统 药物资源,如我国常用的中草药何首乌、虎杖和蔚蓄等都源于蓼属植物,植物药 理学活性多样,大多数种类的全草或根茎有较高的药用和保健作用,从功效上看 大多数均具有清热解毒、抗炎、抑菌等作用,极有临床价值引。近年来研究发 现该属植物具有抗微牛物、杀虫、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性,已经显示出 巨大的研究和开发潜力【。 ..蓼属植物系统分类 是第一位对中国蓼属植物进行系统研究的学者,他在年 发表的文章中,对中国分布的蓼属植物进行了详细描述,并对某些特征变异类型 及其分类价值进行了讨论,为研究我国蓼属植物提供了很有价值的参考资料。刘 ?????????, 慎谔主编的《东北植物检索表》把蓼属划分为个组,《辽宁植物志》 和年出版的《东北植物检索表》第二版把蓼属分为个组。蓼属植物资 源根据其开发利用不同也可分为类:观赏性蓼属植物资源、药用蓼属植物资源、 具有生态保护价值的蓼属植物、具有饲草价值的蓼属植物、具有食品价值的蓼属 植物、具有其他价值的蓼属植物。蓼属的研究经历了很漫长的阶段,而且一直以 来其分类处理意见分歧最大,因此在蓼属种下等级的系统分类.:还需进一‘步研 究、整理、修订【。 ..蓼属植物化学成分研究进展 ...蓼属中黄酮类化合物 黄酮、异黄酮及黄酮苷类是蓼属植物最主要的次生代谢产物,广泛地分布在 该属巾,并作为该属在化学分类卜的标示物。在蓼属黄酮苷巾,甙化作用‘般发 牛在母核的.位上,黄酮:凸:类卡要以单糖:的形式存在,包括氧。凸:型与碳:舒 型化合物,其中以氧苷型化合物较为普遍,常见的苷元有槲皮素、杨梅黄酮、茨 浙江工商大学硕卜学位论文 非醇、滕黄菌素、二羟四氨黄酮、,,.三羟黄酮、异鼠李亭、山奈酚、紫杉叶 素等,连接的糖大都为葡萄糖,也有半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等】。 例如,等从两栖蓼中分离到和【】;和.从篇蓄巾分 离到个黄酮成分~。】;等从香蓼得到个黄酮类成分 【,】:等从蓝蓼中分离到和 】;安红纲等从圆穗蓼中分离 和 ;等亦从中得到了 到两个新的黄酮苷 儿茶素,并测定了其有很强清除自南基活性,该化合物为绿茶的土要活性 成分之一。 ,.氏畸 ,,: ,, ,憎《幻. 《. , 。啕?,,? ‘.,.产 ?.,。 渊 ,浙江商大学硕士学位论文 ???、 强?? 鼬??,...木脂素类化合物 等从蔚蓄分到个木质素类化合物。等从虎杖中得 到个木质素硫酸盐化合物和。郑尚珍等从红蓼巾分到 和 。 浙江商大学硕士学位论文 ...蒽醌类化合物 蒽醌类化合物是蓼科植物的特征性成分之一,从虎杖、何首乌、夜交滕、木 ? 滕蓼中均分离得到了该类成分。和等人从虎杖中分离得到 。 和 ?、‘?『 ? .???。.? ...甾类化合物 常见甾类成分有谷甾醇、谷甾醇::和豆甾醇掣。砌等从火炭母草 中分到个化合物.【。 ,? .??浙江丁商大学硕士学位论文 ...芪类化合物 芪类是具有均二苯乙烯母核或其聚合物的一类物质总称。一般在植物中含量 较少,但当植物受到病菌感染、紫外线照射或化学污染刺激时,芪类在其受激 部 ??, 位的含量显著增加,故可以认为它是植物的应激产物,即植物抗毒素。从何首 乌、 虎杖、.、.中均分离得到了白黎芦醇 。从虎杖中分离到二苯乙烯类化合物.。 ???? :??? ...其它类型化合物 除上述类型的化合物外,蓼属中已见报道的其它类型化学成分还有有机酸、 萜类及挥发油类等。等从 , 和香蓼中分别得到 ????、?????浙江商入学硕学位论文 和倍半萜类化合物 ,和等】。 ?????【?厂 ??????『???..蓼属植物的生理活性 ,,『 蓼属植物酚类化合物大多具有抗氧化活性,其抗氧化能力的强弱与其抗肿 瘤、抗癌变、降脂、降压、抗菌、抗炎等生物活性有卣接的关系;然而蓼属 作为 药用人属,目前只有少数几种,如虎杖、何首乌等著名药用植物有详细的化学 研 究,其它大多有较好民间药崩背景的植物尚无系统的化学及生理活性研究; 所以 合理综合利该属植物,寻找该属植物新的药源,对抗氧化、抗哀老?品的开 发与研究具有深远的意义。 ...抗炎、抗过敏和清除自由基作用 ???,,。浙江丁商人学硕学位论文 蓼属植物多人具有抗炎、抗氧化和清除自由基作用。从水蓼中的黄芩素.. 葡萄糖苷,黄芩素,.羟基木犀草素,.羟基木犀草素...葡萄糖苷,异鼠李素 一..葡萄糖醛酸,没食子槲皮苷,槲皮素,槲皮苷,山奈酚...葡萄糖苷和’ 一二甲基槲皮素,异槲皮::以及 ...具有很强的抗 氧化能力‘引。从拳参中分离的.粘霉烯..酮、无羁萜醇具抗炎作用‘;从 ?,????,一????、 火炭母中分离到的种甾类物质,具抗炎、抗过敏活性‘】;蓼蓝色素对小鼠肥 大细胞有很强的抗过敏作用【。 ...抗肿瘤作用 从酸模叶蓼中分离到的 具有抗癌活性【】:从 和 珠芽蓼挥发油中分离出的.榄香烯、香叶醇和香茅醇也具有抗痛活性【; .等报道蓝蓼的乙酸乙酯及提取物有较好的防癌作用‘; 水蓼对苯并【】芘、,.二二硝基芘和,.二硝基荧葸的致癌变作用呈现一定程 度的 抑制活性。.中含有蒽醌类化合物大黄素,大黄素通过抑制蛋白酪氨 酸激酶的活性而起到抗肿瘤的作用【】;从.中分离到 的糖酯类化合物 和是蛋白激酶的抑制剂,化合物 对癌症还有预防作用【。 ..抗菌、杀虫活性 蓼属植物大多具有杀虫、昆虫拒食、驱避以及抗菌等活性,篇蓄、花蓼、水 蓼、桃叶蓼、辣蓼、杠板归等植物的杀虫功效已有资料广泛记载。姚丽芳等 测知 蓼属的中华抱茎蓼、长鬃蓼、酸模叶蓼、杠板归、珠芽蓼、拳参、支柱蓼等 具广 谱抗菌作用‘;等报道水蓼的提取物有较好的昆虫拒食活性‘; 和 在巴两和巴拉圭也被用作传统的杀虫剂治疗裔禽 螨病【】。 ...其它生理活性 水蓼能极显著地降低蓖麻油所致小鼠小肠性腹泻的发生率和频率,显著地降 低番泻叶所致小鼠人肠性腹泻的频率;等报道水蓼的己烷、乙酸乙酯 以及甲醇提取物均有止痛作用,其中.酸乙酯提取物的活性最强;小头蓼具 有较强的富集铜的能力,两柄蓼对含锌污水具较强的净化能力,戟叶蓼能从 被重 金属污染的十壤基质中吸收金属离子,酸模叶蓼能净化轻度富营养化水【。 ,?????、???????? 一 一浙江工商大学硕:学位论文 .蓼属化学成分的分离检测方法 植物中所提取化学成分单体的鉴别检测方法一般有:?与标准物质或参考文 ???? 献进行对照纸层析或薄层层析的值和值。薄层层析是一种简便、快速、 微量的层析方法,一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上,形成一 薄层 进行层析分离,其原理与柱层析基本相似。?黄酮类化学物可以分析对比样 品在 甲酵溶液中,及加入酸、碱或金属盐类如等试剂后得到的光谱, 化合物不同的结构或是所带的基团不同在紫外光谱下存在不同的吸收带。?光谱 分析法是根据物质对光的选择性吸收的特性建立的一种光谱检测方法,可作为定 性定量分析的基础。硝酸铝比色法和戴维斯法使经常用到的光谱分析方法。?高 ??,?????????厂??? 效液相色谱法作为一种分析方法已被广泛用于各个领域,成为常规分 析技术之一,有的已被列入药典,是一种能进行准确定性定量分析的检测方法, 具有样品预处理简单、色谱柱的选择范围宽、流动相的种类及比例可任意变化、 分析时间较短和灵敏度高等优点,所以发展特别迅速,也正成为分离纯化 技术在新世纪中的发展主流。但法对于对于目标产物浓度很低、.涉物较 多的、特别复杂的体系,如生物技术产品的分离与纯化,通常仍需与其他常规分 离技术配合进行原料的前期处理或初步分离,而把技术用作成品的最终 ,?????????? 纯化或是鉴别检测方法。?毛细管电泳法:可用于各种不同食品基质的分析,现 已开始用于黄酮类的分离检测。它具有简单、分析速度快和分辨率高的优点,特 。 别是对样品提取、浓缩、纯化和衍生等前处理过程尢严格要求,但易受进样量、 温度、盐的浓度、等因素的影响,重现性不高。?色谱一质谱联用技术作为 一种高新检测手段,既发挥了色谱法的高分离能力,又发挥了质谱法的高灵敏度 特性,尤其适用于微量组分的分析检测,可以对生物活性成分进行准确定性定量 分析。而在中草药成分分析中,中草药中含有的化学成分往往种类众多、结构复 杂、含量低,相当一部分稳定性差,.联用技术分析此类样品,高效快 速、灵敏度高,需简单预处理或衍生化样品。而气质联用仪.是最早商 晶化的联用仪器,适宜分析小分乞、易挥发、热稳定、能气化的化合物;用电 轰击方式得到的谱图,可与标准谱库对比。?核磁共振波谱: 解析样品或其衍生物的波谱。过去年,波谱学已全然改变了化学家、 生物学家和生物医学家的口常工作,波谱技术成为探究大自然中分子内部秘密的浙江工商大学硕士学位论文 最可靠、最有效的手段。是其中应用最广泛研究分子性质的最通用的技术。 核磁共振技术的具体运用时由于其可以给出化学位移,耦合常数,峰形,积分面 ??? 积以及驰豫时间等重要信息,在分子结构测定、异构体判别、分子构象分析、动 态过程的讨论、平衡常数的测定、测定一些溶液平衡时的结构、溶剂化数、热力 学函数、确定平衡异构体比例、反应机理的研究等效果显著。核磁共振技术凶为 其快速,无腐蚀性,用量小等优点成为各领域首选分析方法。具体到黄酮类化合 物研究比较系统全面,各种黄酮苷元的结构研究比较彻底,糖类的构型及连接位 置等由于波谱技术的不断发展和完善,可以准确鉴定。 ??、????,?? ?,?????????, ??????? ?,?,?,,,浙江商大学硕学位论文 .本课题研究的意义和内容 ’??? 在我国民族医药蓬勃发展的今天,中草药资源作为中华民族的魂魄,应予以 不断的发掘和利用。中国开发利用中药资源历史悠久,渊源流长,千百年东,对 中华民族的生存繁衍、兴旺发达起了巨大的促进作用。中药资源是中国人民防治 ’????墨 疾病、康复保健,生育的物质基础,具有很高的实用价值和丰富的科学内 容, 是祖国医药学宝库的重要组成部分。中药资源的开发和应用,既是社会主义的经 济事业,也是人民卫生保健事业,具有明显的社会效益经济效益和生态效益。 采用多种高新技术联用方法研究天然活性物质,以药效学试验为导向,从中 药或天然动植物中提取、分离具有生物活性的有效组分或活性成分,并阐明其化 学结构是开发研制新药物的重要手段。 对于杠板归更为深入的化学成分和药理作用研究还较少,因此,加强杠板归 这方而的研究,综合开发利用杠板归资源具有现实意义。本实验综合国内外对植 物生物活性成分提取的方法,通过萃取狭得杠板归粗提物的石油醚相、乙酸乙酯 相和正丁醇相,采用硅胶层析柱、. 层析柱、凝胶层析柱、制备型等 对各相的化学成分进行分离提取、及结构鉴定,同时对所获得的不同组分的单体 物质进行生物活性筛选,为进一步的深入研究奠定一定的基础。故本实验对杠板 归化学成分进,。步的研究,进。‘步阐明杠板归药理作用的物质基础,并为中药杠 板归的应用开发、药物的标准化及其科学研究积累了重要的实验数据。 其主要内容为: 、杠板归原材料的预处理。杠板归经粉碎后,采用%乙醇热回流提取法 提取次,经过浓缩后成浸膏。 、杠板归巾化学成分的提取分离及纯化。采用柱色谱方法正棚硅胶柱色 谱、反相硅胶柱、大孔吸附树脂、凝胶柱以及制备型液相分离纯化杠板归中 的 化学成分。 、对分离出来的单体化合物进行结构鉴定。主要依据质谱、核磁共振氢谱、 碳谱以及二维谱等谱图,进行结构解析,确定分二结构。 、对提取出米的单体化合物进行初步活性测定。应用清除自由基方 法评价单体抗氧化能力及体外抗肿瘤活性研究。 ?.??????,? 浙江工商大学硕上学位论文 第章实验部分 .实验材料、试剂与仪器 ..实验材料 杠板归:重庆市药物种植研究所购得,由浙江大学生命科学院吴斌博士鉴定 .。 为 咖 ..试剂 流动相:水为二重蒸馏水,甲醇、乙腈为色谱纯美国天地; ?,????.,?? 化学试剂:石油醚分析纯,氯仿分析纯,乙酸乙酯分析纯,丙酮 分析纯,无水乙醇分析纯,%乙醇分析纯,甲醇分析纯,乙腈 分析纯,正.醇分析纯,,?,,,? 等试剂。 正相硅胶:柱层析用硅胶~日,目,硅胶,青岛海洋 化厂; 型大孑树脂:天津南开大学化工厂; 薄层层析色谱:, : 一; 葡聚糖凝胶: 反相砬胶:,。 ..仪器 分析型:高效液相色谱仪.,.,., ,. ?,,: ... 和 柱,. 高效液相色谱 .;仪美国公司, ,.× : 一、 .: 中低压制备: ????????? 浙江商人学硕:学位论文 . , .. . ; 制备型 核磁共振氢谱:‘.: ; 超导核磁共振仪. 核磁共振碳谱:乃.: 超导核磁共振仪.; 电喷雾质谱.: ; ./旋转蒸发仪:美国公司; 真空冷冻干燥机:.型冷冻干燥机北京四环科学仪器‘; ?????厂??‘?? 真空干燥器:.真空干燥器北京中西远大科技有限公司: 超声波清洗器:.型超声波清洗器昆山舒美超声仪器有限公司; 电子分析天平: 型,; 高速冷冻离心机:; 部分收集器:.自动部分收集器.:海沪西分析仪器‘有限公司; 烘干器:豫康牌型玻璃仪器气流烘干器上海豫康科教仪器设备有限公 司; ?『?厂 紫外分析仪:.型三用紫外分析仪上海顾村电光仪器厂: 紫外分光光度计:.紫外分光光度计; 玻璃色谱柱: ;西,?, ?幸; 、 玻璃仪器:吸管、毛细管、玻璃点样点样瓶 、烧杯、玻璃棒、 、 、 、 滴管、量筒 、分液漏斗 、移 液管、、圆底烧瓶、、锥形瓶、、。 .显色方法 ..紫外检测 样品经点板后放入固定波长的紫外灯卜.,波长为和,最为通 用简便的显色方法,在紫外下有吸收的化合物均适用。 ??一?.一????????浙江.商人学硕::学位论文 ..碘蒸气 将单质碘和适当硅胶混合均匀后密封备用。检测时将薄板放入显色缸, 在薄板的浅黄色本底上,很多有机化合物吸附碘,可逆地产牛棕色到黄色斑 点, 是一种通用显色剂,可以检测包括不饱和脂肪酸等存内的一些化合物。 .. %硫酸.乙醇显色系统 将 浓硫酸加入到 的无水乙醇中,混合均匀后密封备用。检测 时将薄板迅速放入显色系统中浸透,拿出挥干后在电炉上小心加热 .分钟即可,是一种通用显色剂,一般检测萜类化合物等。 ..茴香醛一硫酸显色系统 将 浓硫酸和和 乙酸混合,加入 茴香醛,用前现配。检测 时将显色剂均匀喷洒到薄板上,挥.后在电炉上小心加热.分钟, ???? 可以检出含有甾类和胆酸类的化合物。 ..盐酸一镁粉试验 取样品的乙醇溶液 ,加少量镁粉,然后加浓盐酸?滴,置沸水浴中 加热?分钟,如出现红色表示有游离黄酮类或黄酮苷。黄酮类的乙醇溶液, 存盐酸存在的情况下,能被镁粉还原,生成花色苷元而呈现红色或紫色反应 个 别为淡黄色、橙色、紫色或蓝色。 .. 反应 试剂:取 萘酚用%乙醇溶解至 ,临用前配制,棕色 瓶保存。实验原理:糖钍浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物 与叶 萘酚作用形成紫红色复合物,在糖液和浓硫酸的液而问形成紫环,因此又称 紫环 反应,自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。 ??,??,浙江商人学硕士学位论文 ..溴甲酚绿 溴甲酚绿乙醇溶液变色范围.~.黄蓝。 .杠板归化学成分的提取 ..杠板归原材料的预处理 将 .的干燥全草粉碎后,用%乙 杠板归 醇回流提取次 ,合并提取液,经过旋转蒸发仪减压浓缩,得到浸膏, 同收溶剂。将得到的浸膏分散于. 水中,使之成悬浮状,用相同体积的石油 醚萃取次,石油醚萃取液合并后在减压条件下旋转蒸发浓缩,即得到石油醚 相 浸膏;上述萃取后的水相用等体积的乙酸乙酯萃取次,分层后取上层溶液,过 滤得乙酸乙酯萃取液,在减压真窄条件下旋转蒸发浓缩,得到乙酸乙酯相浸 膏; 水相再用等体积的正.醇萃取,分层后取上层有机相,同样萃取次,合并过滤 得正丁醇萃取液,在减压条件下旋转蒸发浓缩,得到正丁醇相浸膏。所得杠板 归 ? 石油醚部分浸膏、乙酸乙酯部分浸膏、正丁醇部分浸膏重量分别为、和 。杠板归化学成分提取流程如下图图.所示: ?『, , ????? 浙江工商大学硕一:学位论文 ???? ? 图.杠板归化学成分提取流稚图 一 . .杠板归石油醚相化学成分分离纯化 ..硅胶装柱 正相色谱硅胶为一种坚硬无定型立体网状结构的硅酸聚合体颗粒,可用通 式.表示。它具有多孔性的硅氧环及一??一的交 链结构,其骨架表面的硅醇基团能通过氯键与极性或不饱和分子相互 作用。硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅醇基的数目及其含水量。随着水分的 增加, 吸附能力降低。硅胶的表而积、表厕结构、微孔体积及微孔半径均直接影响 着色 ????.????,浙江工商大学硕:学位论文 谱分离的效果。硅胶柱的装备一般可以分为两种,根据硅胶的状态分成干法 装柱和湿法装柱。 干法装柱:干燥硅胶直接倒入柱子中,装柱过程中一边装一边用洗耳球两 边均匀敲柱,或者装完后用真空泵抽一下或是用氮气压一下柱子为特殊的柱 子, 并非普通的玻璃柱,可以把柱子装的非常紧凑,尽量排空空气,这样上洗脱剂 的时候就不会那么容易断开。 『??,一? 湿法装柱:湿法装柱子之前硅胶和溶剂混合一起,搅拌至无气泡或是超声一 会,充分浸泡。.卜柱前,柱子里先加入少量的溶剂,然后把硅胶搅拌均匀后倒入, 尽量一次全部加入柱子里,同时底部的旋塞打开,装柱过程中~边装一边用洗耳 球两边均匀敲柱,赶出气泡。 柱子装备好之后,用沈脱溶液的起始浓度进行柱子平衡,上样后一般采用混 合溶剂进行沈脱,极性逐渐增大的梯度沈脱方式,分离效果良好。 ..上样方法 一般上样也’町以根据样品的状态分为十法上样和湿法上样。干法上样就是样 品已粉末的状态装入柱子中,一般拌入一定晕的硅胶真空干燥后弭碾碎上样,加 , 入后用玻棒轻轻搅拌,以赶走样品中的气泡,样品量大的情况下采用此方法;湿 法上样的样品用单一溶剂或是混合溶剂溶解后上样,样品应大部分溶解,样品溶 液用胶头滴管慢慢匀速的沿管壁吸入到柱子巾,溶解性较好的样品采用湿法 上 样。 . ..样品粗分 石油醚萃取相浸膏,采用硅胶柱色谱~目, , , 进行初级分离,硅胶柱采用湿法装柱,以石油醚.乙酸乙酯系统为流动 相进行梯度洗脱,分别以“油醚、石油醚与乙酸乙酯体积比为:、:、 .、:、:、:及纯乙酸乙酯各依次进行洗脱,每洗脱液收 ?『 集浓缩,经分析合并后多得到组分。.采用硅胶柱色谱,分别用两倍 柱体积的石油醚一乙酸乙酯系统:、:、:、:、:洗脱,得化合物 谷甾醇化合物。分离石油醚相的流程如下图.所示: ???一一?浙江工商人学硕士学位论文 署袈瑟激 厂??? .~ .. 相硅胶柱 .. 上结晶 图.石油醚相分离流程图 .杠板归乙酸乙酯相化学成分分离纯化 ..样品粗分 ...样品分析 取少量的乙酸乙酯相粗样溶于乙酸乙酯中加入部分石油醚增加溶解,用 石油醚,石油醚与乙酸乙酯比例为:、:、:、:、:、:和乙酸乙酯为 下观察,在碘蒸气下进行显色, 展不剂,进行硅胶点板,在紫外分析仪 对吸收斑点进行标记,分析确定硅胶柱色谱的洗脱溶液系统。 ...洗脱系统的确定 根据的分析,确定乙酸乙酯相的硅胶柱色谱的洗脱系统为石油醚、 石油醚与乙酸乙酯体积比为:、:、:、、:、:、:、:及纯乙酸 乙酯各依次进行梯度沈脱。 ...柱子的准备 乙酸乙酯相样品,粗分物料比为:,确定选用柱体积为的柱子; 硅胶填料目,在烘箱中干燥后片石油醚溶解,采用湿法上样, 装柱后顶端留有一定体积的溶液;样品拌入相同比例的硅胶粉,搅拌后放入 真空 ? 浙江工商人学硕士学位论文 干燥箱中干燥,研钵碾粹,直接加入到柱子中,上样后使上端平整,若存在气 泡 可用玻棒搅拌,在层析柱上端放入脱脂棉,防止加洗脱液时对样品产生冲击, 破 坏平整的硅胶层】,影响洗脱效果。 ...洗脱收集 用已确定的洗脱系统对层析柱进行梯度洗脱,每收集一次,用旋转 蒸发仪减压浓缩得到的洗脱液,得到的浓缩液在的锥形瓶中挥发蒸干,选 取特定的组分进行分析,用毛细管对浓缩后的沈脱液在薄层硅胶板上进行 点样,并用适当的展开剂展开,使用紫外灯、碘缸和%硫酸.乙醇显色剂进行 『?? 显色分析,将相似组分合并,洗脱完成后共收集个组分。通过硅胶薄层色谱 在不同的展开剂下对不同组分进行分析,选取点板效果较好的纽分进行下一 步的 ’ 分离。乙酸乙酯相的分离流程如下图.所示: 乙酸乙酯相 下相硅胶柱色谱分离 石油醚/乙酸乙酯洗脱 莲薪雾譬柱 ?,?’ . .. . ? 化合物 化合物化合物?化合物 图乙酸乙酯棚分离流程图浙江.商人学硕。学位论文 ..组分一的细分 ... 分析 根据点板分析合并后得到组分 .~,取其少量同体用乙酸乙酯和 石油醚溶解,在硅胶薄层板上点样,进行分析,选择柱色谱分离条件。分 别用石油醚:乙酸乙酯为:、:、:、:、:为展开剂展开,在紫外分析仪 上观察,发现有吸收斑点,并用铅笔做好记号,依据分析后选定硅胶 分离流动栩分别为:、:、:、:、:的石油醚与乙酸乙酯混合液。 ...洗脱收集 本次洗脱采用的玻璃层析柱,用目的硅胶进行湿 法装柱,用比例已经确定的洗脱剂对样品进行沈脱,逐次用的锥形瓶收 集,减压旋转蒸发溶剂、收集,对浓缩液用毛细管在硅胶板上进行点样 分析,将相似组分收集在一起,共为组分,分别记为..、..和..。 经点样分析过程中发现..含有较少量杂质,比较纯。 ... ..纯化 在..组分浓缩液挥发过程中,溶液中析出白色固体,用胶头滴管把固 体析出物转移到.离心管中,片石油醚进行再溶解,溶解杂质后吸去溶液, 将其敝口放在干燥器中干燥,得到化合物。 ..组分.的细分 ...洗脱剂的选择 取少量.组分固体进行溶解,分别用:、:、:、:、:为展 开剂进行分析,硅胶溥层板在紫外分析仪 下观察,发现有吸收 斑点,并用铅笔做好标记,再在碘蒸气巾显色,最后再用%硫酸一乙醇显色, 同时做好记录。根据分析显色结果,选定石汕醚与乙酸乙酯比例为:,:, :,:,:和纯乙酸乙酯等一系列溶剂系统作为色谱柱的洗脱剂,进行梯度洗 脱。 ...中低压色谱柱的制备 选用?宰的制备柱,采用正相硅胶?日,. ???,????一浙江工商人学硕:学位论文 干法上柱。其具体过程为:将?的制备柱上端用把手把螺帽拧开, 接上一个西的辅助柱,拧紧后往辅助柱里面加硅胶,待柱子装满 后,使得大柱子内留有的硅胶,在辅助柱上端接上装置,打开装 置往内冲压柱子底端螺帽拧开,保持整体的通风状态,等其压实后,关闭压 力阀,在保持一定时问后,拧开装置,卸下大柱子,将制备柱拧紧。 柱子平衡:将制备好的柱子装在中低压制备装置上,接上流动相,连 接紫外检测器,打开泵,用流动相进行柱子平衡,因为是干法装柱,一般用初 始 流动相石油醚重复冲洗柱子,使硅胶湿润充实,防止洗脱过程巾现断裂现象。 上样:中低压制各一般采用湿法上样。用尽量少的有机溶剂溶解样品 样品溶液不结块,选定紫外检测器波长为处,准备上样,将进样环开 关转到上样开关,将样品用用注射器打入样品环,待样品全部进入样品 环后将进样环开关转到开关,流速为./,用已选定的洗脱剂进行 洗脱。 ...洗脱收集 本次实验每个梯度用两倍柱体积进行冲洗,收集一次,经过减压浓 ‘?【? 缩后通过初步分析,用适当的展开剂展开进行显色分析,将相似组分合并 为一个流分,共得到个流分,分别为..、..、..。 ... ..分离纯化 一? ..组分经过显色分析,确定采用正相硅胶柱进行下一步的分离, 洗脱液选用石油醚与乙酸厶酯比例为:、:、:、:、:,分别用两倍柱体 积溶液洗脱,经过柱色谱后得到化合物。 ... ..分离纯化 本次实验采用西 .进行分离 的玻璃层析柱,用 纯化,填料采用湿法装柱。原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主, 兼具反相分配的作用在反相溶剂中。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合 物保留弱,先被洗脱下来.小分子的化合物保留强,最后出柱。如果使用反相 溶 对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保 剂洗脱, 留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后柱。如果使用正相溶剂洗脱, 这主要靠凝胶过滤作用来分离。用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇一水系 统最浙江工商人学硕::学位论文 为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用%甲醇冲柱;正相系统以氯仿 甲醇最为常见,先用%氯仿一甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用%甲醇 冲柱。如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱;反之如果样品极性小,这选用 正 相溶剂洗脱。 湿法装柱的方法:用甲醇将层析柱润湿,并且柱子底部预留高 .,用水泵进行抽气赶走溶液中的 度的甲醇;将甲醇充分过夜浸泡 气泡,之后缓慢地、均匀地、连续的全部倒入柱中后,用吸耳球轻轻敲打柱的 两 .自然沉降到一定高度后,再在柱子顶端加压, 侧,赶去气泡并让 .不再下降为止,柱子在用甲醇平衡后即可 并不断加入甲醇直至 使用。 上样:样品用甲醇充分溶解,所用甲醇越少越好,样品溶液超声后用 . 有机膜过滤,用干净的胶头滴管吸取样品沿层析柱内壁缓慢均匀加入柱 ? . 中;待样品液面.:升至’‘定高度后,打开柱下端活塞,至液面与 面相持平,关闭活塞继续缓慢加入样品,重复上述操作直至上样完成。 收集和归类:用纯甲醇作为洗脱剂对柱子进行洗脱的同时,调节流速 ? 为流出一滴,用部分收集器进行收集,试管收集。采用对收集 物进行分析,将相似组分收集在一起,试管在液相中达到一定的纯度,流 份减压旋转蒸发溶剂,得到白色粉末状固体,将其溶解在少量甲醇中重结晶, 挥 发部分溶剂,有黄色钊。状结晶析出,将结品物装入.离心管中,吸去溶液, 将其敝口放在干燥器中干燥,得到化合物?。 ... ..分离纯化 取..组分溶于溶剂中分析,经显色发现硅胶板上的点较少,即表 明纽分中所含的成分较纯,可用进行更进,‘步的分析,取少量组分溶解在 甲醇中,经过.有机膜过滤,使用分析型高效液相迸样,用%的甲醇做 为流动相,流速为/,柱子.,,×.,选用紫 外检测器,双波长检测,分别为和,进样量为 。进样后发现在 下分离效果良好,.口‘用制备型进一步分离纯化。将样品溶解在 的甲醇试剂里,进样进行制备色谱分离,得到化合物。 制备条件为:制备柱: ..,.柱; 浙江工商大学硕士学位论文 流动相:甲醇:水::流速:/;检测波长:; 进样量:。 ..组分.~的细分 ...组分分析 通过对组分.~的分析而选用合适的溶剂系统,并经正相硅胶柱 色谱分离,得到种组分,分别为..,..,..。?再经 分析其结果,发现有较好的点,减压旋转蒸发溶剂,得到深黄色粉末状固体, 将 该固体用反向高效液相进行更细致的分析,进样后发现出现两个分离效果较 好的 峰,适合.分离纯化。样品图谱如下图所示: ;?一?”一? 一 一 ; 。。 、 ; : ; :‘ \ 一..~:一~ .一:一.一 ??.?? “ ?...;. ;. 一:‘‘。 “:‘ ? ’ :一. 飞犬’‘‘/\二. ?、~ 图样品制备前的谱图,. ..柱,甲醇:水:,检测波长: . :.. ,. : ::一: 将样品溶解在的甲醇试剂里,以每次进样进行制各色谱分离,得 到化合物?。制备色谱图如下图.所示: ???『? ???,?? 浙江工商人学硕::学位论文 图.化合物?的制备型分离谱图 一, .,.柱,甲醇:水:, 流速:/检测波长 .? , ??,.× : ::, :/, : .杠板归正丁醇相化学成分分离纯化 ..大孔树脂的装备及上样 ...前言 大孔吸附树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物,应 用大孔吸附树脂进行分离的技术是世纪年代末发展起来的继离子交换树脂 后的分离新技术之一,具有快速、高效、方便、灵敏、重现性好等优点。大孔树 脂是一类有机高聚物吸附剂,是吸附树脂的~种,由聚合单体和交联剂、致孔剂、 分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。聚合物形成后,致孔剂被除去,在树脂中 留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。冈此大孔吸附树脂在干燥状态下 其内部具有较高的孔隙率,且孔径较大,在之间,故称为大孔吸 附树脂。大孔树脂的表而积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、 ???? 浙江工商人学硕士学位论文 热稳定好,在水溶液和非水溶液中都能使用,可通过物理吸附从水溶液或其他 溶液中选择性的吸附有机物。大孑吸附树脂法是利用大孔树脂对欲分离物质的 吸附合作用和筛选作用达到分离目的的方法。大孔树脂柱色谱是以大孔吸附树脂 为固定相,使天然物提取液通过装有大孔树脂的柱子,其中有效成分有选择性地 : 吸附在树脂上,而杂质成分不被吸附,再经适当的溶剂洗脱,收集含有效成分的 洗脱液,合并浓缩,回收溶剂,便可除掉天然物提取液中的杂质成分,达到有效 成分与提取液中糖类、色素等杂质分离的目的,这是一种纯化精制天然有机化合 物的新。大孔吸附树脂吸附技术最早用于废水处理、医药工业、化学工业、 分析化学、临床检定和治疗等领域,近年来在我国已广泛用于中草药有效成分的 提取、分离、纯化工作中,对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮等都有一 『: 定的吸附作用。大孔吸附树脂是以苯乙烯为结构骨架,以二乙烯苯为交联 剂聚合而成,为目前使用最广泛的树脂之一【。 ...预处理 ? 本次实验采用的填料为型大孔树脂,新买的大孔树脂用%乙醇浸泡, 去除上层漂浮物,即去除有机残留物,换取乙醇,直到浸泡乙醇纯净为止。将 已 , 处理完成的 的玻璃柱中,依 型人孔树脂填入半径为 次用浓度为%、蒸馏水、%、蒸馏水各冲洗不少于倍柱体积,每 次酸碱冲洗完成后蒸馏水洗到巾性为止,然后用%乙醇冲洗至流液遇水不呈 乳白色,最后用蒸馏水冲洗大孔树脂柱中的%乙醇,冲至没有醇昧,平衡 后上样。 ...上样 正丁醇部分浸膏,所以本次实验采用十法上样。杠板归正丁醇萃取浸 膏用等量已处理好的型大孑树脂混合搅拌,正丁醇萃取物吸附于大孔树脂 上,干燥后准备上样。将样品和大孔树脂混合物倒入大孔树脂柱上层,轻赶气 泡, 最后在其上端铺一层大孑树脂及放置一块脱脂棉,用以保护样品平面的平整 及减 ?厂: 少加洗脱剂时液体对柱体产生的冲击。 ..乙醇洗脱 苗‘先川去离子水洗脱,开始时去离子水洗脱的~倍梓体积洗脱液冲洗加入梓 ?????浙江商人学硕‘:学位论文 子中蕈复流,防止部分组分因无法牢固的吸附而被洗脱来,流速也慢慢变大, 去离子水洗至无糖;然后依次用%乙醇、%乙醇、%乙醇和%乙醇沈脱, 每次洗脱至流出液没有颜色,旋转蒸发有机溶剂后,真空冷冻干燥得:%乙醇、 %乙醇、%乙醇和%乙醇洗脱部分分别为. . 、. 、 、. 。 分离流程图见下图所示: :丁醇相 ??? 大孔树脂. 不同浓度乙醇洗脱 正一% .% 正% 正水 正% 卜 甲 曲醇础氯 “仿 ??? . 反相 硅胶杜纯化 ??,?一 阮 结 彩绷 工: 一 甲爵 哥叫一 化 合姗 . ?, 微量 编 晒士喜 锄凌 忆 图正丁醇相分离流程图 刀 ..正一组分分离纯化 反向硅胶就是..填料,其原理与高效液相的分配色谱一样,与?:相硅 胶相比,其在反复硅胶梓层析的过程巾样品损失较少,分离纯化的效果也较 好。 浙江丁.商大学硕::学位论文 .填料使用前用甲醇活化,浸泡过夜后使用。本次实验用 的玻璃层析柱,.进行湿法装柱,装柱溶液使用甲醇。样品在上样之前经反 向高效液相分析,流动相用%甲醇的情况下分离效果好于其它比例,所以选择 的洗脱液为%、%、%的甲醇溶液,装柱好后用%甲醇水溶液进行柱子 平衡;样品用尽量少的甲醇充分溶解溶解性不好可以加少量的水,过膜后 用滴管缓慢的加入柱子中,不同的梯度洗脱的同时,用自动部分收集器收集, 然 后对样品进行点板归类,点样后合并得到两个较好组分:和,组 分减压旋转蒸发溶剂,组分量分离的效果比较理想,但量太少而无法进行 更进一步的纯化;组分旋蒸后得到黄色粉末状固体,将其溶解在少量甲醇 中,重新挥发过程中出现黄色针状结晶,再将结晶物放入离心管中,敞口放在 干 燥器中干燥,最后得到组分?。 ..正.组分分离纯化 .装柱前用比例为:甲醇氯仿混合液泡过夜,水泵抽气后 进行湿法装柱,采用? 的玻璃层析柱。取的正.组分溶于甲 醇和氯仿的混合液中,充分溶解后过膜上样,用甲醇和氯仿:溶液作为洗脱剂 对柱子进行洗脱的同时,用部分收集器进行收集,流速为/滴,每小时收集一 试管。对收集物用。硅胶板对收集物进行分析,将大致相似组分合并在 一起,将收集的试管进行分析后发现,.、 .两个组分的点比较 清晰、物质较纯,减压旋转蒸发大部分有机溶剂,在组分挥发过程中都出现了 结 晶物,将结晶物分别装入.的离心管中,用甲醇进行重结晶,最后得到淡 黄色晶体?和褐黄色粉末?。 ..正一组分分离纯化 ...硅胶分离 %乙醇洗脱部分,旋转蒸发午乙醇后,经过真空冷冻干燥后得到正一组分 . 。取少量的样品溶于甲醇中,经分析,在液相的条件下得到的分离 效果不是很理想,在经点板显色后决定用止相硅胶柱色谱进行粗分。经过 分析选用的溶剂为氯仿.甲醇系统:、:、:、:、:、.、:、: