高速逆流色谱分离纯化海桐皮活性成分研究（可编辑）

高速逆流色谱分离纯化海桐皮活性成分研究（可编辑） 中图分类号 学校代码?密级 公珏 硕士学位论文 高速逆流色谱分离纯化海桐皮活性成分的研究工 , 一 作者姓名: 廖晓云 学科专业: 分析化学 研究方向: 色谱分析 学院系、所: 化学化工学院 指导教师: 陈晓青教授 副指导教师: 于金刚副教授 论文答辩日期刃;:./ 答辩委员会主席 中 南大 学 年月原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果,也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签 日期:丝生年且卫日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文, 允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 师签名 作者签高速逆流色谱分离纯化海桐皮活性成分的研究 摘要:近年来高速逆流色谱广泛应用于天然产物化学成分 的分离提纯。本文利用分离技术,针对海桐皮活性成分开展 研究。探讨了高速逆流色谱的最优分离条件,并对海桐皮活性成 分的 抗氧化和抑菌作用进行了相关研究。主要内容如下: 考察了分离海桐皮乙酸乙酯萃取部位的最优分离条 件。实验结果表明最优两相溶剂体系为正己烷.乙酸乙酯一甲醇. 水 :::,/,上相有机相作固定相,下相水相作流动相。转速为 转/分钟,流速为 /,此时固定相保留率达到%。通过 一步分离,从 原儿茶酸、 乙酸乙酯部位中分离纯化得到 绿原酸和 咖啡酸。高效液相色谱分析结果显示分离后物 质的纯度都超过%,原儿茶酸的纯度甚至达到了.%。 采用紫外光谱、液相质谱./、核磁共振氢 谱 碳谱 方法分析鉴定出海桐皮活性成分的化 学结构。本文首次报道从海桐皮中分离得到原儿茶酸、绿原酸和 咖啡 酸这三种物质。 ,.二苯基..三硝基苯肼抗氧化实验表明这三种物质均 具有较好的抗氧化性,原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸的抗氧化强弱为咖 啡酸原儿茶酸绿原酸,其半数抑制浓度分别为. /、. /和../。同时考察了三种物质对阪琦杆菌、副溶血弧菌、 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌的抑菌效果。结果表明原 儿茶酸、绿原酸和咖啡酸的抑菌作用均强于乙酸乙酯部位,且不同物 质对菌种的抑菌效果具有选择性。其中原儿茶酸对副溶血菌具有较强 抑菌作用,最低抑制浓度为“/,而绿原酸对阪琦杆菌 的抑菌效果甚佳,为./,咖啡酸对鼠伤寒沙门氏菌的 为./。 研究了正己烷一乙酸乙酯.甲醇.水:::,/溶剂体系中的 酸效应和盐效应。选择水杨酸为研究对象,探讨了不同种类的酸、盐 及它们的浓度对水杨酸分配系数的影响。实验结果表明酸或盐的加入 可以微调分离对象在溶剂体系中的分配系数。本论文图幅,表 个,参考文献篇。 关键词:高速逆流色谱;海桐皮;抗氧化;抑菌作用;溶剂体系;酸 效应;盐效应 分类号: ?~ ? 。一 一??? :. . , . . ?,?:::,/.. . /. ,%. ? , ,.% .% .,?/, .., . ., 一一.. . / , .“/ ,. / ,., , , , . . , ,/. 肛/ ./... ..:::,/ 硒... ,. :? ; ; ;;; ; : 目录 原创性声明摘要?. 目录?. 第章绪论?. .高速逆流色谱??. ..高速逆流色谱简介??.. ..高速逆流色谱的基本原理??.. ..高速逆流色谱理论基础.. ..高速逆流色谱的优点与不足?.. ..高速逆流色谱在天然产物分离纯化中的应用.. .高速逆流色谱的溶剂体系. ..溶剂体系的选择原则?一 ..溶剂体系的筛选.. ..实用的溶剂体系选择思路..溶剂体系的酸效应.天然产物的抗 氧化作用? ..抗氧化活性研究现状? ..抗氧化能力测定方法? .天然产物的抑菌作用..抑菌成分研究现状..抑菌作用的测定方 法? .海桐皮?.. ..海桐皮的品种及药理作用..海桐皮主要成分研究? .本论文研究目的及内容? 第章高速逆流色谱分离条件的研究.实验部分一 ..主要化学试剂和仪器?. ..海桐皮化学成分的提取 ..萃取部位的制备及抗氧化研究 ..高效液相色谱的检测? ..高速逆流色谱溶剂体系的筛选 ..海桐皮活性成分的分离 .结果与讨论??.. ..海桐皮的最优提取条件 ..萃取部位的选择 ..高效液相色谱的最优检测条件 ..高速逆流色谱的最优分离条件 .小结. 第章海桐皮活性成分的抗氧化及抑菌作用研究 。实验部分.. ..主要化学试剂和仪器? ..分离组分的结构鉴定? ..抗氧化实验..抑菌实验 .实验结果与讨论? ,.分离组分的结构鉴定?. ..抗氧化作用 ..抑菌活性 .小结. 第章高速逆流色谱溶剂体系的酸效应和盐效应 .实验部分.. ..主要化学试剂和仪器? ..分配系数的测定 .实验结果与讨论? ..高效液相色谱检测条件 。。酸对水杨酸分配系数的影响? ..盐对水杨酸分配系数的影响? .小结. 第章结论与展望? .结论. .展望??.. 参考文献??. 攻读学位期间主要的研究成果??.. 致射中南大学硕士学位论文 绪论 第章绪论 .高速逆流色谱 ..高速逆流色谱简介 逆流色谱 ,是一种新型的液.液分配色 谱技术【】。与传统柱色谱相比较,不需固体载体是逆流色谱的一大优点。因而 不会出现样品的失活、不可逆吸附和变性等问题【】。高速逆流色谱. 博士等人研发,是目 ,由 前为止应用范围最广的技术。它在的基础上改善了分离时间、分辨 率以及进样量,能在数小时内高效分离克量级的样品【训。 能实现从微克量级的分离分析到克量级的分离制备。适用于天然 产物粗提取物的分离提纯、未经严格处理的粗制样品的中间级分离,也能与红 外光谱仪、质谱仪等分析仪器联用进行高纯度分析,应用前景十分广阔。因此 作为一种高效制备技术的广泛应用在天然产物、医药、环境分析等多 个领域‘。 在我国,技术应用较早,是继美国、日本之后开展逆流色谱应用 的国家。目前已从制备型发展到分析型,甚至是微量分析型。年,张天 佑教授带头研制出我国第一台逆流色谱仪,应用于抗生素成分的分离分析【.”。 目前我国的深圳同田生化技术有限公司已研制出多个系列的设备。 ..高速逆流色谱的基本原理 是建立在一种特殊流体动力学平衡基础上,利用螺旋管的高速行 星式运动.型模式,产生的不对称离心力场保证了两相溶剂在螺旋管内的保 留和高效的混合。再利用溶质在两相中的分配系数不同,在短时间内实现物质 的高效分离【。?。 图.为.型同步行星式运动逆流色谱的机械原理图,色谱柱固定轴 自转的同时以相同的方向和角速度围绕离心轴旋转,即公转【】。公转与自转都 产生了离心力,在合力的作用下螺旋管内固定相才得以保刨】。并允许流动相 快速流过螺旋管,与固定相进行连续高效的混合和分配,使得分离效率明显提 高,且这种连续流通式逆流色谱仪器不需旋转密封接头,因此解 决了在高速旋 。 转和分离过程中可能出现的漏液和污染等问题【中南大学硕士学位论文 绪论 色谱柱行星式运动 自转轴一 公转轴一 图. .型逆流色谱行星式运动机械原理图 这种行星式运动在逆流色谱分离中具有如下两种主要特征: ?不用旋转密封接头的流通式离心分离系统。此系统允许流动相连续不断 地通过旋转的螺旋分离柱而得到洗脱。 ?更重要的是由于阿基米德螺旋效应在多层螺旋管中产生了一个特殊的两 相流体动力学行为。当互不相溶的两相溶剂在两端封闭的螺旋管中,高速旋转 使两相在螺旋管中呈单向性分布。其中轻相占据首端,而重相占据尾端,两相 在螺旋管的中间部位形成一个界面。所以从两相的单向性分布说明,当轻相做 流动相时,应该从螺旋管柱的尾端引入,通过重相固定相,从首端流出,这种 叫尾头的洗脱方式。当重相做流动相时,应采取头尾的洗脱方式,即从螺 旋管的首端通入,最后从尾端流出。首端和尾端与螺旋管的转动方向有关【】。尾 头 ?】二不?????啊玎百? :?彻:匿?:?:啊哪贮.。?. ?衄皿皿足???’.册册???.??邢『:::::?:.’们 图. .型逆流色谱螺旋管内两相的流体动力学分布示意图 两相在螺旋管内的分布情况;不同位置、、、的螺旋管柱展开图 固定相的保留源于色谱柱内流体动力学行为‘】。图.为由频闪仪得到的 型行星式运动螺旋管内两相的流体动力学分布刚?。如图.箭头所示,绪论 中南大学硕士学位论文 螺旋管柱在靠近中心轴的/区域混合区两相剧烈混合,形成了乳化区; 其余区域沉积区两相分层,重相占据外部,而轻相占内部,两相间出现了 清晰的界面。将不同位置的螺旋管拉直如图.所示,每个混合区带都向首 端行进,其速率和公转速率相同。显然如果流动相以恒定流速通过固定相时, 管柱内任何位置的两相以极高频率经历混合和沉积分配过程。 ..高速逆流色谱理论基础 固定相保留率 的固定相为液体,它在离心力场的作用下保留在色谱柱中。流动 相为不停地泵入色谱柱内、与固定相形成动态平衡的另一相溶剂。在 中,任意一相都可作流动相,前提是样品中各组分的值要在一个合适的范围 内。如果下相做流动相的话,固定相保留率较为稳定、噪音小、还可避免流动 过程中气泡的产生。如果上层有机相不包括氯仿系统作流动相时,有利于 蒸发得到溶质。 固定相保留率鳓是逆流色谱核心问题,决定着柱效、色谱峰分离度、溶质 保留体积时间。的定义为:动态平衡时色谱柱内固定相体积与柱体积 的比值。研的表达式为: 墨。詈 其中,蚝、圪分别为固定相体积和柱体积。 一般来说,研越大样品的分离效率越高。研与溶剂系统、流动相流速、转 速和管径有关。一般流动相流速越大研值越小,反之则越大。而转速和管经越 大研越大。 容量因子、分配系数和分离因子 与其他色谱一样,的容量因子定义为: 肛瓦 式中尼’为容量因子;为固定相中溶质的量;为流动相中的量。 样品利用进行分离是其在互不相溶的两相中进行分配的结果。由 于没有固体支撑体,溶质的保留仅与分配系数四有关。为溶质在固定相和流 动相中的浓度的比值。即: 肛乏, 式中,为分配系数;和分别为溶质在固定相和流动相中的浓度。中南大学硕士学位论文 绪论 / . 肛嚷叫等 式中‰和分别是在色谱柱内两相达到平衡时流动相和固定相的体积 分离因子被定义为需分离溶质对的分配系数、恐之比 口:鉴 其中,通常总是大于或等于。 保留体积和保留时间 溶质的保留体积时间可以表述为: 圪十髟 ? ’ \ ,一, 。等螋川/ 式中,蚱和“分别为溶质的保留体积和保留时间;‰为柱中流动相 体积; 圪为固定相的体积。‰正好与高效液相色谱中的“死体积’’% 相对应; 为流动相流率。 柱体积圪就是其中流动相和固定相的体积之和,即圪%圪。圪一般 可 从制造商提供的参数中得知。方程?,.可简化为: . 。圪圪 ?, \ ,’ 。吾华巾川 式中,毛为流动相充满色谱柱所用时间。 由方程可以看出,在选定的溶剂系统下值确定,此时影响溶质保留 体积的参数就为勋 分离度 分离度咫又称分辨率,是衡量两相邻色谱峰分离效果的一个参数,也是评 价分离过程成功与否的标准。皿被定义为两个相邻色谱峰峰尖距离与两峰的半 峰宽的和的比值。 足揣 式中,、%分别为两峰的保留体积;职、%分别为两色谱峰的峰底宽 度。通常两峰可达基线分离的标准是分离度.;.两峰可完全分离: 中南大学硕士学位论文 绪论 .两峰有重叠,不能完全分开。 根据。方程】,和旧从分离度的定义导出的分离度尺。 方程为: 舻扣胁赤 式中为分离因子;为所需分离溶质对中的第一个溶质的分配系数;母 为固定相保留率。?为理论塔板数,可表示为: ? 州轷,参 公式.与分辩率方程的不同之处是方程式的最后一项,同时表 明固定相保留率.鞋对分辨率咫作了重要贡献。一般而言固定相保留率越高,色 谱峰分辨率越好。当母减小时,由于磁也是减小,因此代表两色谱峰间距的 圪减小。这就使及的溶质峰移向位置不变的的溶质峰, 使足降低。在极端情况下,驴,柱中只含流动相,所有溶质峰将出现在圪 处,尼。相反,当母增大时,,也增大,使咫提高。母对咫的影响 是通过影响尼值而实现。一般而言,具有较高分配系数的化合物,最好选用低 函系统进行分离,反之则选用较高品系纠】。在现代装置中,值一 般在..之蝌侈。对于驴.,.’而言,值最佳范围为...,最 佳值为;对于驴.,.’,值最佳范围为...,最佳值为.。 无论怎样,好的分离是用较低值在较短时间内取得成功的分离。从 的基本理论可以得出,分配系数、固定相保留率研及分离因子仅是 最基本的参数。由,、.蹄及圪可预测溶质的保留参数;由,、趴及?可预 测两溶质峰的分辨率。 ..高速逆流色谱的优点与不足 作为一种新型分离技术,其主要优点表现在以下几个方面: 不需固体载体。螺旋管中的固定相为液体,为液.液色谱系统,因而不 会出现峰形拖尾、样品的不可逆吸附、失活等现象。特别适用于分离极性物质 和具有生物活性的物质; 操作灵活,固定相和流动相可以互换使用。不需对样品进行复杂处理, 还与灵敏度高的检测技术联用,可以快捷准确地在线检测。又因固定相为液体,中南大学硕士学位论文 绪论 体系更换更加方便、快捷; 应用面广。由于有广泛的溶剂体系可供选择,大大增加了其适用范围。 在年代后期,广泛用于植物化学成分的分离制备; 操作成本低,制备量大。与相比,进样量较大,进样体 积可达到柱体积的%,最多可达几克的样品,是的.倍。因此 可用于物质的制备性分离; 分离能力强,产品纯度高。有的样品只需一次分离就可得到多个纯单 体,且分离时间较短,一般可在几小时内完成【。若使用合适的溶剂体系,可 以将样品分离得到纯度高达%以上的产品。可用于天然产物中各组分的分离 提纯【】; 高回收率。由于两相均为液体,样品可全部回收。因此具有较高的样 品回收率和较好的重现性。 但是也有不足之处,还存在一些问题【】。简述如下: 灵敏度较差;作为一种制备分离技术,不太适合作为一种分析 手段进行微量混合物的分离,分离效率不能与分析型对.此样品的 分离相媲美。它只能和制备型相比较; 稳定性低;固定相的逆向移动会造成两相严重混合,导致稳定性低, 分离效率降低; 缺乏系统的两相溶剂的理论指导。目前这方面的研究还较为稀少,实 际工作主要使用测定待分离物中各组分的分配系数的方法来选择溶剂体系。 这就需要借助其他分析手段,工作量较大、耗时,使其在实际应用中设备难以 放大。因此进一步优化两相溶剂系统,还有待研究解决; 高速运转时可能会产生一些机械故障。 ..高速逆流色谱在天然产物分离纯化中的应用 当今天然产物在医药、化妆品、食品添加剂及香料等领域扮演着很重要的 角色。在天然产物的分离提纯中,最重要的是其活性成分的提取与分离。由于 有诸多优点,因此适于分离具有生物活性的成分。近年来广泛 应用于天然产物的分离与提纯。目前已经发表的方面的文章中,大多 以生物碱、黄酮类、萜类等物质的分离研究居岁。绪论 中南大学硕士学位论文 .高速逆流色谱的溶剂体系 ..溶剂体系的选择原则 传统的液相色谱使用单一相把样品从覆盖在固体载体上的液相中洗脱出 来。相反,技术是使用一组互不相溶的两相溶剂体系,一相是固定相, 另一相为流动相。可以从繁多的溶剂组成中选择一种作为溶剂体系,所以合适 的溶剂系统是完成分离的关键。指出溶剂系统的选择很费时,其工 作量几乎占到整个分离过程的%【】。一般可先用薄层色谱法 和法测定样品在溶剂体系中的分配系数,并选泽有合适的固定相 保留 率、分配系数和分离因子的两相溶剂,如此才能顺利和高效地进行。 研究天然产物提纯的学者使用实证研究法较为有效地筛选出了一些合适的系 统。 选择溶剂体系应该满足如下: 在体系中物质保持稳定且具有较高的溶解度; 溶剂系统的两相应能形成合适的体积比,以避免浪费; 溶质在溶剂系统中应有合适的分配系数。一般而言最合适的分配系数 是在..之间,这样就可以在合适时间内得到较好的色谱峰形【】。分配系数 太小时,出峰时间太快、分离度较差。分配系数太大时,虽可获得较好的分离 度,但出峰时间长、色谱峰变宽; 固定相在色谱柱内能实现较大保副】; 。 两相溶剂系统的分层时间应小于 ..溶剂体系的筛选 在分离活性成分的过程中,最关键也是最难解决的问题就是溶剂 体系的选择。不同溶剂系统具有不同的上下相体积比,且密度、 黏度、极性等 性质的不同而使值有所差异,最终影响分离效果。 在中,二元溶剂系统应用较少,常用的溶剂系统为三元和多元系 统。对于多元溶剂系统,可以调节溶剂组合与配比,使之均匀变化。多元体系 覆盖的极性范围广。曹学丽对这些溶剂系统方法做了归纳: 法。 法。是由正己烷、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、水构成的种溶剂 体系【。它们形成的两相体积比都接近。覆盖了一个连续的极性范围,从非 极性体系的正己烷.甲醇.水::到极性的体系正丁醇.水:。 法。为将正己烷.乙腈体系:与正丁醇.水体系:结合起来的中南大学硕士学位论文 绪论 极性渐变法。对能很好溶解在正丁醇和乙腈可用甲醇代替中的样品很管用。 法。结合乙酸乙酯.水体系:,体系,极性与正 庚烷.甲醇体系:,体系,非极性设计出种溶剂配比,包含整个极性范 围的溶剂体系【‘。 乙基乙二醇二甲基醚体系。 方法。 丙酮溶剂系列。为解决溶剂体系中的溶解度问题开发的。 扩展的“”法。将甲基叔丁基醚部分或全部取代体 系中的乙酸乙酯,乙腈部分或全部取代甲醇。 现详细介绍法筛选合适的溶剂体系。博士总结出较为系统的筛选方 法,如表所示【之。从上到下是有机相的疏水性逐渐减弱的一系列溶剂 体系。而且每一组溶剂体系中两相的体积比都约为:,这样能使溶剂较多的 保留在逆流色谱中,也使两相在分液漏斗中备样时更易分离。当不清楚样品的 疏水性时,可先从正己烷.乙酸乙酯.甲醇.水:::,/开始考察,因为这个 体系极性适中。之后可以根据样品的分配系数循箭头方向开始寻找。如果所测 分配系数稍微偏离了合适的范围,可以通过改变它们的体积比来调整。若分配 系数大于时,可以朝着更疏水如体积比为.::.:的正己烷.乙酸乙酯.甲醇 .水的溶剂体系调整。若是分配系数比.小,应该朝相反的方向如正己烷.乙酸 乙酯.甲醇.水.::.:,~调整。如果样品大部分溶解在上相有机相中,可 以沿着箭头往上找。相反就沿着箭头往下找。直到所有目标化合物的值在合 适的范围内。若是使用了表.中最上方的溶剂体系,样品还是大部分溶解在 有机相中时,可以使用疏水性极强的溶剂体系,如正己烷.乙醇.水::,/ 或正己烷.甲醇体系。倘若尝试了表.中最下方的溶剂体系,而样品还是更多 地溶解在水相中时,可能需加些物质到体系中,如正丁醇.醋酸.水::、正丁 / 水溶液。 醇..%的三氟乙酸水:、正丁醇.. 如果样品是天然产物提取物,要根据提取溶剂的极性大小来选择溶剂体系。 若样品是乙酸乙酯提取液相对疏水性的溶剂,先从正己烷一乙酸乙酯.甲醇. 水:::开始寻找最优溶剂体系。如果样品为甲醇提取液极性溶剂,可以 先从正丁醇.水开始探究。绪论 中南大学硕士学位论文 表.寻找合适溶剂体系的筛选方法 乙酸乙酯 甲醇 正丁醇 水 正己烷 疏 水 性 极 性 一般而言,固定相保留率越高,色谱峰之间的分辨率越好。而固定相在柱 中的保留率与两相在测试管中的分层时间有很大关系。两相溶剂系统在应用时 应先测量一下分层时间【。如果分层时间少于,溶剂体系应该能有一个令 人满意的固定相保留率,通常在合适的流速下会超过%。表.中列出的所 有溶剂体系都有较好的固定相保留率,能得到等体积的两相。尽管理想的固定 相保留率要超过%,但比它小一些如%可能也会达到较好的分离,尤其是 对于那些值较高的样品。 程杰、符晓晖、王维娜对中药分离中溶剂体系的筛选进行了系统 研究【?。 对中药的分离通常可分为三类溶剂体系:非极性或弱极性、中等极性、亲水性 三种体系。根据待分离物的性质进行选择。 非极性或弱极性体系:一般而言适合分离易溶于石油醚、乙醚、己烷、 四氯化碳等溶剂,又在甲醇、乙醇等溶剂中可溶解的物质。通常这些溶剂体系 为:正己烷.乙酸乙酯.甲醇.水、正己烷.甲醇、正己烷.甲醇.水、正己烷一乙醇一 水、正己烷一乙腈.乙酸乙脂、正己烷.乙腈.二氯甲烷、四氯化碳.甲醇.水等。 中等极性体系:适合分离易溶于丙醇、丁醇、乙酸乙酯、氯仿等溶剂, 在甲醇、乙醇溶剂中可溶,不溶或难溶于石油醚、己烷等溶剂的物质。通常选 绪论 中南大学硕士学位论文 用:正己烷.乙酸乙酯.甲醇.水、正己烷.乙酸乙酯.乙醇.水、氯仿.甲醇.丁醇.水、 氯仿.甲醇.水等体系。 亲水性体系:适合分离易溶于甲醇、乙醇、丁醇、水等溶剂,在石 油 醚、氯仿、己烷等溶剂中难溶的物质。通常为丁醇.水、乙酸乙脂.丁醇.甲醇. 水、乙酸乙脂.丁醇.乙醇.水等体系。 ..实用的溶剂体系选择思路 根据被分离物极性不同,设计出了一种较实用的溶剂体系筛选流 程,如图.所示。在实验中根据样品的极性大小,参考该进行筛选。对 非极性样品来说,优先试验非水系统;可以采用中等极性的含水系统来分离中 等极性的样品;正丁醇.水溶剂系统用来分离极性较强的样品;双水相溶剂体系 用来分离极性极强甚至水溶性的样品,但这要借助特殊的设备来实现固 定相的保留。 梯度洗脱 图.实用的溶剂体系选择思路 ..溶剂体系的酸效应 博士曾总结出表.所列出的中性溶剂体系中,若想改变羧酸类物质的 分配系数,可以将三氟乙酸或醋酸加入到溶剂体系中【?。由于质子化作用,这 些物质变得更疏水,更易分配在有机相中。由于此类目标物质有两种分子形式,中南大学硕士学位论文 绪论 即一和.‘,每一种都有不同的值,当部分离子化时会形成一个很宽 的色谱峰。因此,推荐尝试加酸到溶剂系统中的方法。同时,加酸如.%三 氟乙酸还能缩短分层时间,提高固定相保留率。 .天然产物的抗氧化作用 ..抗氧化活性研究现状 自由基生物学是近年来广泛研究生命科学领域的新兴学科。其主要探 讨自由基的形成和清除,以及自由基对生物体系所造成的损害。目前,一系列 的以氧为中心的自由基和其他活性氧所导致的疾病包括动脉粥样硬化、 神经退行性疾病、慢性炎症疾病、肿瘤及生理衰老的病理已经建立起来【引。 由于抗氧化剂对人体健康的诸多益处,因此被认为是重要的保健品,也作为油 脂过氧化反应的抑制剂而广泛应用于食品工业中【。然而,人工合成的抗氧化 剂已被证明可在体内蓄积,这将可能导致肝损伤和癌变。在食品 中所使用的从 草药和香料中提取的天然抗氧化剂,不仅抗氧化活性高,而且不存在这样的安 全隐患。天然提取的抗氧化剂还具有潜在的营养价值和治疗效果,具有广泛的 应用前景。 ..抗氧化能力测定方法 ,.二苯基..三硝基苯肼是一种稳定的有机自由基。生物试剂清除 自由基的能力大小可以表示其抗氧化能力的大小。乙醇溶液呈深 紫色,在处存在典型的特征吸收峰。在反应体系中,若存在自由基清除 剂,且与自由基中氮原子上不成对电子的数量成对时,该特征峰消失。 反应速率和自由基清除剂的能力取决于特征峰消失速率和峰值。相对于 其他方法,方法具有许多优势,如良好的稳定性,可信的灵敏度,操作 简单和可行性高【。检测的结果存在多种表达方法,大多数研究结果以 半数抑制浓度值来表示,该值定义为初始浓度减少到%时所需的 抗氧化剂的量。根据不同浓度下的清除率绘制曲线,由此计算出值 ,?。 .天然产物的抑菌作用 ..抑菌成分研究现状 目前,国内外对天然产物中抗菌活性成分的筛选、提取、抑菌性能进行了中南大学硕士学位论文 绪论 大量研列加】。研究发现,金银花、忍冬藤、黄连、连翘等多种天然产物具有 不同程度的抑菌作用】。 目前从天然产物中分离出来的抗菌物质的类型主要分为以下几类: 萜类和挥发油类,此类物质的抗菌的抗菌作用研究较多; 芳香族化合物。主要包括酚类、黄酮类及芪类等。酚类化合物具有很 好的抗菌效果。之前研究表明酚酸类化合物如原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸等对 乳酸菌、嗜肺军团菌、肠道菌等菌种具有抗菌作用】; 生物碱、胺及蛋白质等; 脂肪类化合物。 ..抑菌作用的测定方法 微生物方法、化学方法和物理方法是抑菌作用测定的三大类方法【】。对天 然植物提取物来说,由于其化学成分多数未知,一般用微生物学 法来衡量其抑 菌能力。目前微生物学法分为三类。 扩散法 在固体培养基融化凝固前接种试验菌。凝固后,将样品放在培养基上后, 在溶剂的带动下向四周扩散。离扩散原点的距离的越大,抑菌物质的浓度越小。 当抑菌物的浓度正好高于最低抑菌浓度时,该试验菌的生长被抑制,会形成清 晰透明的抑菌圈。理论上来说,可以用抑菌圈的大小来评定物质的抑菌效果。 在一定浓度范围内,抑菌物质浓度越高抑菌圈的直径越大。该方法的典型代表 有滤纸片法和管牒法。 、稀释法 在不同容器中分别装入不同剂量的抑菌物培养基,并向其中加入试验菌。 在一定温度下,经过一段时间的培养,观察其对试验菌生长的抑制情况,来确 定抑菌物的最低抑菌浓度。 比浊法 将不同剂量的样品稀释液加入液体培养基中,由于抑菌物的抑菌 作用使试 验菌的生长受到抑制,从而产生不同程度的浑浊。通过浊度的变化观察试验菌 的生长情况况。所以比浊法的终点是借助抑菌生长的速度不同而定。 .海桐皮 ..海桐皮的品种及药理作用 豆科植物刺桐是一种常见的中药,一般分布在世界的热带和亚热带地区,绪论 中南大学硕士学位论文 品种超过一百多种【。海桐皮为豆科植物刺桐的茎皮。据资料记载我国曾用作 海桐皮的原植物达种,分别为豆科的刺桐或乔木刺桐、五加科的刺楸、木棉 科的木棉和芸香科的剁椒或椿叶花椒】。《中国药典》将豆科植物刺桐或乔木 刺桐的干燥树皮称为海桐皮【。刺楸的干燥树皮称为川桐皮,椿叶花椒或朵椒 的干燥树皮称为浙桐皮’。有关文献报道各品种海桐皮具有许多生物活性, 如抗菌、抗炎、抗、抗疟原虫等作用【。在中国、印度及东南亚地区海 桐皮主要用于治疗风湿性关节痛、腰膝背痛、跌打损伤,外用治疗疥癣【。本 实验采用的海桐皮为豆科植物刺桐的干燥茎皮。 ..海桐皮主要成分研究 植物化学研究表明从海桐皮中分离得到多种类型的化学成分,从刺桐和乔 木刺桐的茎皮主要分离得到异黄酮、生物碱等物质‘‘?。从木棉中分离得到黄 酮类、萜类、脂肪酸等【‘】。从刺楸中主要分离得到皂苷类、木质素类等【‘】。 朵椒和椿叶花椒主要分离得到的成分为香豆素类、黄酮类等物质四。 .本论文研究目的及内容 近年来,抗生素的不合理使用导致了临床耐药菌种不断增加以及耐药性增 强。临床常见的有耐青霉素肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古 霉素药的肠球菌等,这些问题给临床治疗带来诸多困难。长期以来,清热解毒 的中药在感染性疾病中发挥着重要作用,寻找具有抑菌活性且副作用小的天然 产物尤为重要引。 据文献报道海桐皮具有抑菌作用,.、.等人研究了豆科植物 海桐皮具有抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、链球菌、放线菌、乳酸菌等致龋 菌的作用【殳。但是其活性成分的分离大多通过硅胶色谱方法分离得到,甚 至会用到制备型进一步纯化,因此分离手段相对复杂。本实验拟利用 一步分离海桐皮中的活性成分,并在前人研究的基础上,考察海桐皮 萃取液及其活性成分原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸的抗氧化作用,及对阪琦 杆菌、副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌作用。 目前有关溶剂体系方面系统的理论研究还比较少,有关溶剂体系 酸效应和盐效应问题更是少有研究。先前有文献报道过络合高速逆流色谱,即 在溶剂体系中加入会产生络合作用的离子如铜离子、银离子,利用其络合作用 来分离异黄酮类、大环内酯类抗生素等物质【】。也加三氟乙酸或醋酸加到溶 剂体系中来分离色素类、黄芩苷和汉黄芩苷等物质的研究【】。本文以正己烷. 乙酸乙酯.甲醇.水:::,/为溶剂体系,水杨酸为研究对象,研究了不同种绪论 中南大学硕士学位论文 类的酸和盐以及它们的浓度对水杨酸分配系数的影响,实现了利用酸和盐微调 分配系数的可行性。 中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 第章高速逆流色谱分离条件的研究 海桐皮是一种常见的中药,为豆科植物刺桐或乔木刺桐的茎皮。在中国、 印度及东南亚地区海桐皮主要用于治疗风湿性关节痛、腰膝背痛、跌打损伤, 外用治疗疥癣【。据文献报道海桐皮有效成分大多是利用硅胶色谱方法分离得 到,甚至也会用到制备型进一步分离纯化,分离方法相对复杂。 近年来广泛用于天然产物有效成分的分离。本实验利用抗 氧化方法筛选极具抗氧化活性的萃取部位,并采用分离其中的活性成 分。本实验采用的海桐皮为豆科植物刺桐的干燥茎皮。 .实验部分 ..主要化学试剂和仪器 本章使用的主要仪器和试剂如表?、所示: 表.主要仪器一览表中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 表主要化学试剂一览表 ..海桐皮化学成分的提取 本实验采用热回流法提取海桐皮中的化学成分,并对提取条件进行单因素 考察,确定海桐皮的最优提取条件。 将干燥海桐皮粉碎后备用。向圆底烧瓶中加入。 海桐皮粉末,加入 一定量的溶剂,在一定温度磁力搅拌下回流提取,而后抽滤。将滤液转移至 圆底烧瓶中,并在。真空条件下旋转蒸发得棕黄色浸膏。最后称量浸膏 的质量,按.式计算得率。 ? 得率一×% 式中:、分别表示海桐皮粗提物的质量和海桐皮粉末的总质量曲 ..萃取部位的制备及抗氧化研究 二次水超声溶解后,依 萃取部位的制备:取. 提取物用 次用 石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取,每种溶剂萃取两 次。旋转蒸发萃取液后得到石油醚部位.曲、乙酸乙酯部位.曲、 正丁 醇部位. 和水部位.曲的浸膏。分别取 各个部位的浸膏于 不同的容量瓶中,加入甲醇定容,配制成 /的溶液备用。 于 的棕色容量瓶中, 溶液的配制:准确称量 用无水甲醇溶解定容,配制成. 溶液。摇匀,避光保存,备用。 / 抗氧化实验。利用法筛选具有抗氧化作用的萃取部位。实验操作如下:分别量取. 具塞试 /的四个萃取部位溶液于不同的中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 。 管中,加入. . / 溶液混合,于。恒温下避光静置 . 同时将. 溶液与. 甲醇混合液做空白样陋。在 / 条件下,利用紫外分光光度计测定各个部位及空白样的吸光度。每种样 品平行实验三次,取平均值。利用下式计算自由基清除率: 仁, 自由基清除率%,,鲁×。% 式中为样品的吸光度;为空白样的吸光度。 ..高效液相色谱的检测 取. 样品溶液用. 有机滤膜过滤,置于进样瓶中待用。采用反 . , 向法进行分析检测,色谱柱为 ,进样 量为此。同时考察了流动相组成、流速、检测波长、分析时间的影响,确 定最优检测条件。 ..高速逆流色谱溶剂体系的筛选 鉴于正己烷.乙酸乙酯.甲醇.水溶剂系统的极性范围广,适于不同极性物质 的分离纯化。本实验采用正己烷.乙酸乙酯.甲醇.水溶剂体系,在不同体积比条 件下考察不同组分的分配系数、分离因子及分层时间。 分配系数及分离因子的测定 样品在互不相溶的两相中分配以后,各组分的分配系数值可用分析型 来测定。值的测定方法如下:配制一系列的溶剂体系,向具 中加入等体积的已达平衡的上相和下相,再加入等量的乙 塞管 酸乙酯部位样品后震荡摇匀。静置 后分离两相,分别取上相和下相用 分析检测】。在最优的分离条件下,各组分的浓度可用精 确测定,即根据样品中各化合物的上下相峰面积之比计算值。值 计算公式 如下: 迎 . 式中和分别表示各组分在上相和下相中的峰面积。 分离因子可以用公式?计算。 分层时间的测定。 步骤如下:各量取已达平衡的上相和下相 到具塞管中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 中。振荡后垂直静置,当形成明显的两相时测量所用的时间。两 相溶剂系统的 分层时间应小于 。最后依据样品中各成分的值、值及分层时间 来确定 最优两相溶剂体系。 ..海桐皮活性成分的分离 固定相和流动相的制各。室温下,用分液漏斗制备总体积为 选定的两相溶剂体系,剧烈震荡后静置。达平衡后,将上下相分离, 并用超声 波清洗器超声半小时后使用。将上相作固定相,下相作流动相。 样品溶液的制备。取 乙酸乙酯部位样品用固定相超声溶 解后备用。 的分离步骤:设备是由垂直盘旋的.型行星式离心机, 具有三个多层线圈连接色谱柱内径. ,总长 和一个 的 手动进样环。转速可以在到 之问进行调节。该仪器配备一个 .泵,.紫外检测器,.恒温调节器和 .工作站。 在?下,上相以 /的速率和“头.尾”的方式泵入色谱柱 中。当固定相充满整个色谱柱时,选择反转模式并调节合适的转速。之后以一 定的流速泵入流动相。此时开始用量筒收集排出的固定相。当流动相从管路流 出时,螺旋管内的液体已达动态平衡。用公式.计算出固定相保留率跏接 着通过进样环将样品注入到管路中。检测器在线检测流出物,并调节波长为 ,再根据色谱峰手动收集流分。当所有目标化合物都被洗脱出来之后,停止 设备,用氮气将柱中液体冲出后收集分析。 .结果与讨论 ..海桐皮的最优提取条件 提取溶剂。称取. 海桐皮粉末,按照实验..的方法,分别用 甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水作溶剂,热回流提取 。旋蒸滤液得到棕黄 色浸膏,称量计算出得率与提取溶剂的关系见图.。从图中可以看出,甲醇做 溶剂时得率最高,乙醇次之,水的最低。综合考虑到甲醇的毒性较大,故采用 乙醇为提取溶剂。中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 逞 ; 瞳 水 乙醇 乙酸乙酯 甲醇 容剂 图.溶剂对得率的影响 无水乙醇在?下提取. 提取时间。称取.海桐皮粉末, 、 、. 、 、. 、 。得率与提取时间的关系如图.示。结果显示, 得率随提取时间的增加而逐渐增大。提取时间短提取效率较低,造成活性成分 的浪费。而提取时间长不仅耗时,也可能导致一些不稳定成分的分解。当提取 时间在 。 以后,得率基本趋于稳定。综合考虑,选择热回流时间为 时间,蛔 图.提取时间对得率的影响 %、%、%、 溶剂浓度。称取. 海桐皮粉末,分别用 %、 。得率与乙醇浓度的关系如图.所示。可 %/的乙醇溶液提取 以看出得率随乙醇浓度的增大而增大。由于过低的乙醇浓度不能实现有效成分 的完全提取,而高于%的乙醇浓度会无法提取某些水溶性活性成分,以及会 中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 提取到一些低活性、低水溶性物质等。且乙醇浓度大于%以后,得率基本趋 于稳定,故选择%乙醇为最佳提取溶剂。 乙醇浓度肌 图.乙醇浓度对得率的影响 料液比。固定其他条件,考察料液比:对得率的影响。图.结果 表明随着料液比的增大,得率逐渐增大。过低的料液比会造成提 取不完全,在 :后得率基本达到稳定,更高的料液比只会浪费溶剂。故选择:的料液比。 。 薄 噱。 : : : : : 料液比: 图.料液比对得率的影响 提取次数。固定其他条件,考察提取次数对得率的影响。结果如图. 所示。一般来说提取次数越多,提取出来的活性成分的质量越多。但提取次数 太多,不仅浪费溶剂而且浪费时间。从图中可知提取三次基本可以将其中活性 成分提取完全,故实验提取次数定为次。 中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 提取汝数 图.提取次数对得率的影响 因此提取海桐皮有效成分的最佳条件:?下,以:的料液比,%乙 醇加热回流提取三次,每次 ,得率为.%。在最佳条件下,称取. 海桐皮粉末到 圆底烧瓶中,加入 %乙醇溶剂,在?磁力 搅拌下回流提取三次,每次 。。真空条件下旋转蒸发滤液得到.浸 膏。甲醇溶解后放在冰箱中冷藏?备用。 ..萃取部位的选择 生物试剂的抗氧化能力可以用清除自由基的能力来表示。在 下,紫外分光光度计测得的各个部位的吸光度如表?所示,根据公式.计 算出自由基清除率。由表中可以看出乙酸乙酯部位具有最强的抗氧化性, 正丁醇部位次之,石油醚部位最差。即乙酸乙酯部位含有较多活性成分。这个 结果正好与很多文献保持一致【’。因此选取该部位作为分离研究的 对象。 表不同部位的抗知乜性 ..高效液相色谱的最优检测条件 流动相的优化 中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 选择甲醇.水作为分离的流动相。最开始采用甲醇.水:,/作 流动相,出现峰形展宽和色谱峰拖尾的现象。实验证明,在流动相中加入酸醋 酸或磷酸能改善峰形,提高分离度。因此向水中加入一定体积分数的醋酸, 研究表明体积分数为.%和.%醋酸对于改善峰形的效果基本一致。故实验 采用的含.%的醋酸的水溶液。考察了一系列等度条件及梯度条件,发现当流 动相的组成为甲醇..%的醋酸:,~时,海桐皮乙酸乙酯部位中的物质 可以达到基线分离。 分析时问的设定。先将分析时间设为 ,但根据色谱图可 知 以后未发现有其他物质的色谱峰,因此选择 作为的分 析时间。 流速和波长的设定。一般来说的流动相流速较大色谱峰形较好, 且分析时间短,分离效率高,所以选择流速为./。本实验中设置了 、 、 /、 四个波长,结果显示在波长为 条件下, 各物质的峰形较好、峰面积较大,故选择波长为 进行分析。 综合考虑后,最优分离条件如下:等度洗脱;流动相为%甲醇水 含.%的醋酸;流速. /;柱温?;检测波长: /;进样量 此;分析时间 。在此条件下色谱图如图.所示。 图.海桐皮乙酸乙酯部位的图 由图可知,海桐皮乙酸乙酯萃取部位中约有种物质,但是只有三 种物质的峰面积占总峰面积%以上。因此将图中标出来的三种主要物质作为 分离的对象。它们的保留时间以及峰面积占总峰面积的百分比见表.。高速逆流色谱分离条件的研究 中南大学硕士学位论文 表三种主要物质的峰面积百分比 ..高速逆流色谱的最优分离条件 溶剂体系的选择。溶剂体系对分离效果至关重要。为使海桐皮乙酸乙 酯部位中各成分能进行较好的分离,需考察不同溶剂体系。使值在一个合适 的范围内,值太大或太小都对分离不利。而且分离因子反反《/,蜀:恐 应大于.【】,仅太小易造成峰重叠。 本实验中,考察了一系列体积比不同的正己烷.乙酸乙酯.甲醇.水两相溶剂 体系。并从正己烷.乙酸乙酯.甲醇.水:::,/开始试验。主要根据实验所 测上下相的峰面积而计算出来的值和仅值来筛选适合分离海桐皮乙酸乙酯部 位有效成分的溶剂体系。可以通过调节溶剂体积比来改变值和仅 值。实验结 果显示增大乙酸乙酯或者减少甲醇在两相溶剂中的比例都会增大值,反之亦 然。正己烷.乙酸乙酯.甲醇一水溶剂体系的筛选模型如下【?。 正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水 :.: 出峰快 出峰慢 .增加水比例 .减少水比例 ,减少甲醇吲 .增加甲醇比例 .增加乙酸乙酯比例 .减少乙酸乙酯比例 .减少正己烷比例 .增加正己烷比例 图.正己烷.乙酸乙酯一甲醇.水溶剂条件的筛选模型 正己烷乙酸乙酯甲醇一水:::,“的实验结果显示,每一种化合物的 值都特别小,因此不适合作为分离的溶剂体系。同时增大乙酸乙酯、水在溶 剂体系中的比例,选择了几组不同体积比的溶剂体系,所测值和值如表。 所示。实验结果表明在溶剂体系下,二号物质的分配系数太小,易随流动相 下相的溶剂峰出来,具有较低分辨率,且号物质和三号物质的色谱峰会中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 因小的分离因子而不能完全分开。而?溶剂体系下,虽具有较好的分离因子, 但因三号物质的值过大而导致峰形扩宽,且需要较长的分离时间。综合考虑 各方面因素,溶剂体系具有较合适的值和仅值。 、、、?溶剂体系的分层时间分别为 、 、 、 ,体 系具备作为溶剂体系的条件。故本实验选择正己烷.乙酸乙酯.甲醇一水:::, /作为分离的溶剂体系。 表各组分的分配系数和分离因子 除了考察溶剂体系之外,还考察了其他影响分离的因素如流动相 流速和转速的影响。流动相流速决定分离时间、柱中固定相保留率和色谱峰分 /、. /、. /、. /、. 辨率。本实验考察了. /这几个流速的对分离效果的影响,很明显流速越大对固定相的 保留越不利。尽管低流速会获得较高的固定相保留率和较好的分 离度,但在另 一方面来说,流速越低需要更长的分离时间和也会产生更宽的色谱峰。一般来 左右,分析物的值较小时,推荐使用较低的 说当溶剂系统的分层时间在 /。 流速。考虑到样品中三号物质的值较大,故选用流动相流速为. 且此时具有较好的固定相保留率和分离度。 /、 /、 /、 /、 同时考察了不同螺旋管转速 /下对逆流色谱分离的影响,研究发现低转速会降低固定相在柱中的保 留率,从而导致很低的色谱峰分辨率。而高转速会增大固定相保留率,但是由 于过高的转速会导致保留柱内的压力增加,同时高压会造成的分离柱的剧烈震 动,从而造成过度的样品谱带变宽。综合考虑流速和转速对固定相保留率、分 / /作为流动相流速和 离时间和分离度等方面的影响,选择. 作为的分离的转速。 选择最优分离条件:溶剂体系:正己烷.乙酸乙酯.甲醇一水:::,/; 固定相:上相有机相;流动相:下相水相;反向模式;固定相保留率:%; 中南大学硕士学位论文 高速逆流色谱分离条件的研究 转速: /流速:. /;柱温:。;进样量: ;检测波 长:衄。通过一步分离得到三个色谱峰,如图.所示。收集每一个峰对 应的组分,进行分析。结果显示分离出来的三个峰为纯物质, 分别对应的是图.中的化合物 ,化合物 和化合物 。 柱内液体中没有检测到其他物质的存在。 图.海桐皮乙酸乙酯萃取部位的色谱图 的分离部位用分析检测方法进行纯度分析,结果如图.所 示。每一个小图代表的是每一种物质对应的紫外光谱图。利用每个组分对应的 峰面积与总峰面积之比,计算出三个分离组分的纯度分别高达.%, 。%和.%。高速逆流色谱分离条件的研究 中南大学硕士学位论文 ?噶 ? ?骂 时 图. 分离部位的色谱图。条件同图.。 .小结 本实验考察了海桐皮的最优提取条件:溶剂为%醇、料液比为:, ,重复提取三次,得率可达到.%。提取物依次用石 ?下加热回流提取 高速逆流色谱分离条件的研究 中南大学硕士学位论文 油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,用法筛选出富含抗氧化剂的乙酸 乙酯萃 取部位,作为分离研究的对象。的最优分离条件为:溶剂体系: 正己烷.乙酸乙酯一甲醇.水体积比为:::;上相:固定相;下相:流 动相; 转速: /;流速. /;柱温:?;固定相保留率:%。经过 一步分离,从乙酸乙酯萃取部位中分离得到 化合物、 化合物、 化合物。分析结果显示分离后物质的纯度都超过%,化合物 的纯度甚至达到了.%。实验表明方法能有效分离海桐皮中的活性 成分,该方法简单易行、分离纯度高。中南大学硕士学位论文 海 桐皮活性成分的抗氧化及抑菌作用研究 第章海桐皮活性成分的抗氧化及抑菌作用研究 早期植物化学研究报道从海桐皮中分离得到多个种类的化学成分,主要为 异黄酮类、黄酮类、生物碱类等物质】。本实验采用紫外光谱、液相质 分析鉴定 谱./、核磁共振氢谱 和碳谱” 分离组分的化学结构。 据报道海桐皮具有多种生物活性,如抗菌、抗炎、抗、抗疟原虫等作 用】。且文献中报道最多的是海桐皮的抑菌作用。.、.等人研 究了豆科植物海桐皮提取液具有抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、链球菌、放 线菌、乳酸菌等致龋菌的作用】。本实验研究不同分离组分的抗氧化作用、 及对不同菌种阪琦杆菌、副溶血菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大 肠杆菌的抑菌作用。 .实验部分 ..主要化学试剂和仪器 本章使用的主要化学试剂和仪器如表.和.所示。 表.主要化学试剂一览表中南大学硕士学位论文 海桐皮活性成 分的抗氧化及抑菌作用研究 表主要实验仪器一览表 ..分离