醋酸杆菌醇脱氢酶粗酶液的特性研究

醋酸杆菌醇脱氢酶粗酶液的特性研究 _==7D 2010年9月 第31卷第9期食品研究与开发生物 醋酸杆菌醇脱氢酶粗酶液的特性研究 肖仔君.黄国清,钟瑞敏 (广东韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005) 摘要:乙醇脱氢酶(ADH)是醋酸杆菌发酵生产醋酸的关键酶.以硫酸铵为沉淀剂, 采用盐析法对醋酸杆茵中乙醇脱 氢酶进行初步的分离纯化,并研究其酶学特性.结果表明:ADH比活力从粗酶液的 0.201U/mg提高到0.460U/mg, 纯化倍数为2.289;其最适作用pH值为7.5,8.0,pH值为7.8时酶活力达到最大,pH 值为7.0时酶较为稳定;最适作 用温度为35?,温度为30?,40?时酶活力较为稳定,温度超过45?后酶活力急 剧下降.通过对乙醇底物浓度对 ADH活力影响的研究,ADH对乙醇的米氏常数Km为2.59x10mol/L. 关键词:醋酸杆菌Acetobactersp.CCTCCM209061;乙醇脱氢酶;酶学特性 PropertiesofAlcoholDehydrogenase(ADH)PreparationfromAcetobactersp.CCTCCM209o61 XIA0Zi-jun,HUANGGuo—qing.ZH0NGRui—min (YingdongCollegeofFoodScienceandTechnology,ShaoguanUniversity,Shaoguan512005,Guangdong,China) Abstract:ThealcoholdehydrogenasefADH1iSakeyenzymewhichcatalyzestheformationofaceticacidfrom alcoholduringthefermentationwithaceticacidbacteria.ADHfromAcetobactersp.CCTCCM209061was primarilyseparatedandpurifiedbythesaltingoutmethodwithammoniumsulfateasprecipita nt,andits propertieswerestudied.TheresultsshowedthattheADHactivitywasimprovedfrom0.201U /mgofcrude enzymeliquidto0.460U/mgandpurifiedmultiplierwas2.289.themaximumactivityofAD Hwasobtainedat pHvahle7.8and35oC.anditwasquitestableatpHvalHe7.0andat30qC, 40oC.Butitsenzymaticactivity sharplydeclinedwhenthetemperaturewasover45oC.TheKmconstantofADHbasedonthes ubstrataof alcoholwas2.59x10, mol/LbyinvestgatingtheeffectofalcoholconcentrationonenzymeactivityofADH. Keywords:Acetobactersp.CCTCCM209061;alcoholdehydrogenase(ADH);enzymaticp roperty 基金项目:广东省科技攻关项目(项目编~r:2009B020312017);韶关市科技项目(项 目编号:~[2009180) 作者简介:肖仔君(1973一),男(汉),讲师,博士研究生,主要从事食品生物技术研究 方面的研究. 通信作者 3结论lit-e"?illl,?-【?Il?{???1 固定化过程,海藻酸钠浓度影响酶的固定化率, 单纯增加海藻酸钠浓度有利于固定化率的提高,但海 藻酸钠浓度太高影响到凝珠的机械强度和成球的难 易程度,选取3.5%的海藻酸钠为载体,可得到较好的 固定化效果. 固定化过程单纯增加CaC1的浓度不利于固定化 率的提高,选择浓度为1.5%的CaC1作为聚凝剂较为 适宜.固定化时间以选择不少于2h为宜,时间太长, 容易导致交联程度过高,形成的凝胶结构太紧密,从而 影响到酶促反应时的反应速率. 游离酶的最适反应温度为50?,而固定化酶的最 适反应温度上升至55?.游离果胶酶最适pH为3.5, 固定化果胶酶最适pH迁移至4.0. ??1?r-?11ll4~??? 参考文献: 川1赵雯玮,陈祥贵.固定化酶及其在食品工业中的应用fJ】.农产食品 科技,2008,2(2):53—55 [2】薛长湖,张永勤,李兆杰,等.果胶及果胶酶研究进展fJ】.食品与生 物技术,2005,24(6):94—99 【3】于殿字,罗淑年.海藻酸钠一明胶固定化磷脂酶的研究叨.食品工 业.2008(3):10—13 [4】赵林果,李丽娟.海藻酸钠固定化葡萄糖苷酶的研究lJJ.生物加工 过程,2007(5):25—28 [5】汤鸣强,卞矛,李琼华.米曲霉固体发酵生产果胶酶的研究[J】.福 建师范大学福清分校,2006(2):31—35 【6】张富新,张嫒媛.海藻酸钠固定化中性蛋白酶的研究[J】.西北农林 科技大学,2005,33(11):90—94 收稿日期:2010—03—02 生物工程食品研究与开发2010年9月第31卷第9期 果醋是一种营养丰富,风味优良的酸性调味品, 兼有水果和食醋的营养保健功能,是以水果或果品加 工下脚料为主要原料,经酒精发酵,醋酸发酵酿制而成 的酸性调味品『l-?.其中醋酸发酵是一种氧化发酵,果 醋生产过程中进行醋酸发酵的主要生化反应是醋酸 菌中脱氢酶的作用.食醋的酿造是存在于醋酸菌细胞 膜结合酶通过将乙醇氧化成乙醛的乙醇脱氢酶(ADH) 和将乙醛再氧化成醋酸的乙醛脱氢酶(ALDH)来完成 醋酸发酵的. 醋酸杆菌(Acetobacter)是ADH的高产菌株,作者 从中华开菲尔粒筛选一株醋酸杆菌Acetobactersp. CCTCCM209061,采用恒温振荡培养箱进行液体的扩 大培养,并用超声破碎仪破碎醋酸杆菌细胞获得乙醇 脱氢酶,探讨了乙醇脱氢酶的初步分离纯化与基 本的酶学性质,拟为进一步深入果醋研究提供理论 依据. 1与方法 1.1试验材料 1.1.1菌种和培养基 菌种:醋酸杆菌Acetobactersp.CCTCCM209061, 韶关学院食品工程系保藏. 培养基:西红柿汁200mL/L(体积比),酵母浸膏 10,葡萄糖10g/L,蛋白胨10,于121oC灭菌20rain. 斜面培养基:西红柿汁200mL/L(体积比),酵母 浸膏10g/L,葡萄糖10dE,蛋白胨10g/E,琼脂15g/L, 于121.C灭菌20min. 1.1.2主要仪器与设备 超声波细胞粉碎机(JY92一?):宁波新芝生物科技 股份有限公司;紫外可见分光光度计(uV一2550型):上 海葵园电子科技有限公司. 1.1.3主要试剂 酵母浸膏,蛋白胨购于广东环凯生物有限公司, 其他试剂均为纯. 1.2试验方法 1.2.1醋酸杆菌培养 将醋酸杆菌菌株接种于斜面培养基,在30?恒温 培养箱中培养48h,再将醋酸菌种接于液体培养基,于 30?恒温摇床中培养24h. 1.2.2乙醇脱氢酶粗酶液的制备[51 取培养对数期(24h)细胞培养液在3000r/min离 心25min,沉淀用pH8.0,20mmol/L的磷酸盐缓冲液 洗涤3次,收集湿菌体细胞.称取6g湿菌体细胞,以 固液比1:5悬浮于pH8.0,20mmol/L的磷酸盐缓冲 l7l==I 液,在冰水浴中进行超声破碎(200W,4sx90次,间隙 5S),离心(6000r/min,15min,4?)除去细胞碎片,细 胞碎片再超声处理1次,同条件下离心,合并2次破碎 离心后的上清液即ADH胞内粗酶液.合并后的上清 液加人饱和度100%的硫酸铵溶液,得到40%,70% 饱和度的硫酸铵溶液,在4?下静置2h,将硫酸铵沉 淀后的溶液离心(8000r/min,20min,4?).倒出上清 液,沉淀用适量的0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4)溶解 并装入已处理过的透析袋中,透析袋浸入0.1mol/L的 磷酸缓冲液(pH7.4)中,每隔1h-2h换1次透析袋外 的缓冲液最好静定容50mL,测蛋白质含量:和ADH的 活力. 1.2-3蛋白质含量的测定I61 蛋白质中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基 酸,在紫外光280nm波长处有最大吸收峰,一定浓度 范围内其浓度与吸光度成正比,故可用紫外分光光度 计来测定蛋白质的含量.核酸的最大吸收峰在260nm 处,通过计算可消除其对蛋白质含量测定的:影响. 计算公式如下:C=I.45xA勰0.74xA瑚 1.2.4乙醇脱氢酶活性的测定卅 参照WOOD氏法,取0.5mLMcllvaine缓冲液pH 4.0,10%TrironX一100溶液0.1mL,1.0mol/L乙醇溶 液0.1mL,粗酶液0.2mL,0.1mol/L铁氰化钾溶液 0.1mL于25mL比色管中,25?保温5min,然后加入 硫酸铁一Dupanol溶液0.5mL,加入3.5mL蒸馏水混合 后,在25?条件下放置20min(同时做空白对照)后, 用722型紫外分光光度计测定660rim之光密度. 酶活力单位定义:在上述条件下,每分钟氧化 1Ftmol的乙醇为一个酶活力单位;4.0光密度等于氧 化1txmol的乙醇. 酶促反应速率(m01/min):一AA600nm~Ix[91 L 式中:为酶促反应体积,mL;e为硫酸铁的毫摩 尔消光系数(4.11L/mmol/cm);为比色杯光程(1cm); ?A咖为每分钟吸光值的变化值. 2结果与讨论 2.1乙醇脱氢酶的初步分离 将离心后的上清液用饱和度分别为10%,20%, 3O%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,80% 的硫酸铵溶液分段盐析,离心收集沉淀物,结果见图1, 表1. 从图1可以看出,ADH不出现沉淀的最大硫酸铵 饱和度约为40%,ADH完全沉淀的最小硫酸铵饱和 -==72 魁 ' 靛 罂 g 跚 廿 延 319食品研究与开发第卷第期瓦叩研九司不双生物工程 硫酸铵的饱和度/% 图1盐析沉淀平衡后上清液中蛋白质相对浓度与硫酸铵饱和度的 关系 Fig.1Relationofproteinrelativeconcentrationandammomum sulfatesaturationforsupernatantaftersaltingoutprecipitation 表l乙醇脱氢酶的盐析沉淀纯化 Table1SaltingoutpurificationofADH 度约为65%.因此,沉淀分级操作应选择的硫酸铵饱 和度范围在40%,65%,二次沉淀采用55%的硫酸铵 盐析.二次沉淀后,ADH比活力从粗酶液的0.201U/rag 提高到0.460U/mg,纯化倍数为2.289. 2-2乙醇脱氢酶的酶学性质 2.2.1酶的最适作用pH值 酶的催化活性大小与体系pH有密切关系,过高 或过低的pH对酶的催化不利.反应体系中的pH值影 响酶蛋白活性中心基团和底物分子的解离状态,从而 影响反应的速度.本文在pH值分别为4.0,5.0,6.0, 7.0,8.0,9.0,10.0的缓冲液中进行酶活力的测定,其结 果如图2所示. 已 蝗 淀 pH 图2pH值对ADH酶活力的影响 Fig.2TheeffectofpHvalueonenzymaticactivityofADH 从图2可以看出,醋酸杆菌Acetobactersp. CCTCCM209061中ADH对环境中的pH较为敏感,其 最适宜作用pH值在7.5-8.0,pH值约为7.8时,酶活 力最大. 2.2.2酶的pH值稳定性 将ADH置于pH值分别为4.0,5.0,60,7.0,8.0, 9.0,10.0的缓冲液中,30.C保温2h,测定剩余酶活 力,结果见图3. pH 图3ADH的pH值稳定性 Fig.3ThepHvaluestabilityofADH 从图3可以看出,ADH在pH值为7.0时较稳定. 2.2.3酶的最适作用温度 酶作为生物催化剂是具有活性的蛋白质,温度对 它的催化活力影响很大.将酶液与底物分别在2O,25, 30,35,37,40,45,50,55?下反应一段时间,测定ADH 酶活力,结果见图4. 温度,? 图4温度对ADH酶活力的影响 Fig.4TheeffectoftemperatureonenzymaticactivityofADH 从图4可以看出,温度为35?时ADH酶活力最高. 2.2.4酶的热稳定性 将酶液分别经30,35,40,45,50,55,60?热处理 30min,测定剩余酶活力,结果见图5. 从图5可以看出,在试验所研究的温度范围内, ADH在温度为30?,40?时较稳定,温度超过45? 后酶活力急剧下降. 2.2.5底物浓度对ADH活力的影响 研究了不同乙醇浓度下的醋酸杆菌中ADH活力 变化情况,结果如图6所示. 生物工程食品研究与开发2010年9月第31卷第9期 300 250 200 蝗150 龌 l0O 5O 0 :薹 呈 褂 3O354045505560 温度,? 图5ADH的热稳定性 Fig.5TheheatstabilityofADH 乙醇浓度/mmol/L 图6乙醇浓度对ADH活力影响 Fig.6EffectofalcoholontheactivityofADH 由图6可以看出,当反应体系中ADH的初始浓 度不变时,反应体系的反应速度随乙醇浓度增大而增 大,但当乙醇浓度增大到25mmol/L后,反应体系的反 应速度变化降低. 再按Lineweaver—Burk法以1/v对1/[S1作图求 ADH对乙醇的米氏常数Km,结果见图7. 1/s 图7ADH对乙醛的双倒数图 Fig.7Lineweaver-BurkplottingofADHonalcohol 173 根据图7,可求出图中的线性回归方程Y=2.102x+ 0.054,该直线X轴截距的负倒数即为醋酸杆菌ADH 对乙醇的米氏常数Km,经计算为2.59~10乏mol/L. 3结论 通过上述对醋酸杆菌Acetobactersp.CCTCC M209061的ADH粗酶液的特性进行研究.得出如下 结论. 沉淀分级操作应选择的硫酸铵饱和度范围在 40%,65%,二次沉淀采用55%的硫酸铵盐析.二次 沉淀后,ADH比活力从粗酶液的0.201U/mg提高到 0.460U/mg. ADH的最适作用pH值在7.5,8.OpH值约为7.8 时,酶活力最大;pH值为7.0时酶活力较为稳定;ADH 的最适作用温度为35?,温度为30?,4O?时酶活 力较稳定,温度超过45?后酶活力急剧下降.通过对 乙醇底物浓度对ADH活力影响的研究,ADH对乙醇 的米氏常数Km为2.59x10mol/L. 参考文献: 【1】邢志利.果醋的保健功效及加工研究进展[中国调味品, 2005(4):42—44 [2】陈丽.李子保健果醋饮料的工艺研究【J】.中国酿造.2009(4):164— 166 [3】周秉辰.食醋生产中醋酸菌乙醇脱氢酶的活性与产酸速率关系 的研究.中国酿造,2009(11):58—59 【4]王红波,雷明科,邓凡,等.巴氏醋杆菌产乙醛脱氢酶的培养基优 化IJl_食品科技,2009(5):6-9 [5】潘丽军,余赞,郑志,等.米根霉乳酸脱氢酶的特性研究【J].食品 科学,2003,24(11):23—26 [6】陈钧辉,陶力,李俊.生物化学实验[MJ.北京:科学出版社,2003:46— 63 [7】MatsushitaK,YakushiT,TakakiY,eta1.Generationmechanismand purificationofaninactiveformconvertibleinvivototheactiveform ofquinoproteinalcoholdehydrogenaseinGluconobactersuboxydans [J】.Journalofbacteriology,1995,177(22):6552 [8]余素清,周秉辰.食醋生产中醋酸菌的乙醇脱氢酶活性研究[J】. 中国酿造,1996(3):14—16 [9]郑志,姜绍通,罗水忠,等.米根霉乙醇脱氢酶粗酶液的特性研究 [J】_食品科学,2006,27(9):115—118 收稿日期:2010—06—04