肝特异性miR-122启动子的克隆与组织特异性研究 精灵论文

肝特异性miR-122启动子的克隆与组织特异性研究 精灵 肝特异性 miR-122 启动子的克隆与组织 特异性研究 122221,2 孙艳，金华君，严淋，吕赛群，李林芳，钱其军 (1. 浙江理工大学新元所，杭州 310018; 5 2. 第二军医大学东方肝胆外科医院基因病毒治疗实验室，上海 200438) 摘要: 目的:克隆人 miR-122 启动子(P122)及小鼠 ALB 增强子(eALB)，将其插入报告基 因载 体，分析 P122 及 eALB-P122 的组织特异性与表达活性。方法:采用 PCR 技术，分别从 人 HEK293 细胞及小鼠细胞基因组中扩增出 P122 和 eALB，并插入报告基因载体，分别构建 P122 和 eALB-P122 的绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶(Luc)报告基因载体。将报告基因 10 载体分别转染至 HEK293 和肝脏细胞 L02 中，48h 后通过绿色荧光蛋白和荧光素酶表达情况， 分别定性和定量检测 P122 和 eALB-P122 的表达特异性与活性。结果:成功分离 P122 与 eALB， 构建报告基因载体，并经测序验证正确;荧光显微镜检测表明 P122 在 L02 细胞中能启动 EGFP 表达，而在 293 细胞中几乎无 EGFP 表达;在 eALB 作用下，L02 细胞中 EGFP 的表达增强， 而在 293 细胞中，EGFP 仍无表达。双 Luc 试剂盒检测荧光素酶活力表明，P122 启动子活性 15 在 293 细胞中仅为对照组的 1/10-1/9，而在 L02 细胞中与对照组无明显差异，eALB 在 L02 22 启动子活性增强 9.25 倍，而在 293 细胞中无明显作用。结论:P122 具有肝 细胞中使 P1 脏组织特异性;eALB 能够显著增强 P122 在肝脏细胞的表达活性。 关键词:miR-122;肝脏特异性;启动子;ALB 增强子 中图分类号:Q786 20 Construction of EGFP and luciferase reporter gene vectors for human miR-122 promoter and analysis of its liver specificity 122221,2SUN Yan, JIN Huajun, YAN Lin, LV Saiqun, LI Linfang, QIAN Qijun 25 (1. Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology,Zhejiang Sci-Tech University, HangZhou 310018; 2. Laboratory of Viral and Gene Therapy,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, ShangHai 200438) Abstract: Objective:To clone the human miR-122 promoter (P122) and the mouse ALB enhancer 30 (eALB) and analyze the exprsession activities of P122 and eALB-P122 in liver cells and non-liver cells. Methods: The human P122 and mouse eALB was amplified by PCR, and were inserted into the EGFP and luciferase reporter vectors, respectively. The constructed vectors were transfected into HEK293 cells and L02 cells. After 48 hours, their expression activity were detect by fluorescence microscope and dual-luciferase reporter system. Result: Sequence analysis indicated that the amplified 35 sequence of P122 and eALB were correct and the EGFP and luciferase reporter gene vectors of P122 and eALB-P122 were constructed successfully. Fluoresence observation on EGFP showed:(1) there was no expression of P122-EGFP in 293cells while P122-EGFP expressed in L02 cells (2) the EGFP expression of eALB-P122-EGFP was much more than that of P122-EGFP in L02 cells while that was no distinct difference in 293 cells. Dual-luciferase assay revealed: (1) the activities of P122 is 1/10-1/9 40 fold of that in the control group in 293cells and smilar in L02 cells. (2) the activities of eALB-P122 is no distinct difference with P122 in 293 cells, whereas 9.25 folds higher than P122 in L02 cells. Conclusion: The cloned P122 is liver-specific promoter and eALB can greatly increase the activity of P122 in liver. Keywords:miR-122; liver specificity; promoter; ALB enhancer 45 基金项目:艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治(2008ZX10002-023) 作者简介:孙艳，(1984-)，女，硕士，肿瘤基因病毒治疗 通信联系人:钱其军，(1964-)，男，教授，肿瘤基因病毒治疗. E-mail: qianqj@163.com 0 引言 肝脏是人体重要的代谢器官，体积巨大且合成蛋白能力强，能分泌大量蛋白入血和完成 [1]某些特定基因产物活性所必需的翻译后修饰。因而，肝脏是合成疫苗蛋白、治疗性抗体与 [2-4]功能蛋白的理想生物效应靶器官。肝脏特异性启动子可以控制外源基因在肝脏细胞内特 50 异表达，尽可能降低对其它组织细胞的毒性。目前，肝脏特异性启动子主要包括白蛋白(ALB) [5]基因启动子和甲胎蛋白(AFP)基因启动子，在靶向肝脏的基因治疗研究中发挥重要作用。 [6]miR-122 是一种高度保守的肝脏特异性 microRNA，在成年肝脏中占 miRNA 表达总量 [7]的 70%左右。Zeng 等人于 2010 年对 miR-122 转录本的启动子区域进行研究，确定其核心 [8]启动子序列位于-5.4kb 到-4.8kb 之间，约 570bp 。但相对于常用的强启动子如CMV ，其表 55 达活性仍显不足。研究表明，肝脏特异性启动子和增强子的联合应用能有效提高肝脏特异性 [9]和转录活性。为此，本研究克隆人 miR-122 启动子(P122)及小鼠 ALB 增强子(eALB)， 以 P122 及 eALB-P122 控制绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因报告基因的表达，确定 P122 及 eALB-P122 的组织特异性与表达活性，为肝脏靶向性基因治疗提供一种新的候选启动子。 1 材料与方法 60 1.1 细胞、质粒和菌株 人胚肾细胞株 HEK293 细胞、人肝脏细胞株 L02 细胞购自 ATCC;荧光素酶报告质粒 pGL3-control 及 pRL-TK 购自 Promega 公司;大肠杆菌 DH5α、含 EGFP 的质粒由本室保存。 1.2 主要试剂 DNA 抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒为 QIAGEN 公司产品;琼脂糖凝胶回收试剂盒为 65 MN 公司产品;双荧光素酶检测试剂盒为 Promega 公司产品;限制性内切酶、T4 DNA 连接 酶为 NEB 公司产品;Taq DNA 聚合酶购自 TAKARA 公司;DNA marker 购自 Thermo Fisher Scientific 公司。 1.3 方法 1.3.1 人 miR-122 启动子及小鼠 Alb 增强子的克隆 70 根据人 miR-122(P122)启动子及小鼠 ALB 增强子(eALB)区域的 DNA 区域上 下游引物(见表 1)，在 P122 两端引入 Bgl?、Hind?双酶切位点，在 eALB 两端引入 Bgl ?、BamH?双酶切位点。以人 HEK293 细胞基因组 DNA 为模板扩增 miR-122 启动子，以 小鼠基因组 DNA 为模板 PCR 扩增小鼠 ALB 增强子，产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后切 胶回收，并经相应双酶切处理与回收纯化。 75 表 1 引物及 PCR 反应条件 Table 1. Primers and PCR reaction conditions 基因引物序列产物大小反应条件循环数1184bp 30 miR-122 启 5′-GTCAG AT CTATGCCTGTAATCCCAGCAC-T3T′ 94? 30s，56 动子5′-GTCAAGCTTTCTTTTTCAACACCGGAGTCA-3′ ? 30s，68? 60s ALB 增强子 5′-GTCAG ATC TCCGGCTAGCTTCCTTAGCAT-3′ 830bp 30 94? 30s，56 5′-GTAGGATCC CCCGTGTACTCATTCCCAGA-3′ ? 30s，68? 60s 5′-TGCGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGG-3′ EGFP 724bp 30 94? 30s，56 5′-TGTGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTC-3′ ? 30s，68? 60s 1.3.2 报告基因载体的构建 绿色荧光蛋白报告基因载体构建:以实验室保存的 EGFP(增强型绿色荧光蛋白)质粒 为模板 PCR 扩增获得 EGFP，经 Nhe?/Not?双酶切后连接连入经相同处理的 pRL-TK 载体， 80 构建 pRG-TK。随后通过 Bgl?和 Hind?位点连入 P122，构建包含 P122 的绿色荧光蛋白报 告基因载体 pRG-P122，再利用 BamH?-Bgl?这对同尾酶，将 eALB 连入 pRG-P122 载体中， 构建同时含 eALB 和 P122 的绿色荧光蛋白报告基因载体 pRG-eALB-P122。质粒经测序验证 正确后，中抽纯化备用。 荧光素酶报告基因载体构建:通过 Bgl?和 Hind?双酶切，将 P122 连接到荧光素酶报 告基因载体 pRL-TK 中，构建含 P122 的荧光素酶报告基因载体 pRL-P122 。再通过 85 BamH?-Bgl?这对同尾酶，将 eALB 连接到质粒 pRL-P122 中，构建同时含 eALB 和 P122 的荧光素酶报告基因载体 pRL-eALB-P122。而后，pRL-TK、pRL-P122，以及 pRL-eALB-P122 3 种质粒经测序验证正确后，分别中抽纯化后备用。 1.3.3 启动子及增强子活性测定 5 绿色荧光蛋白报告系统:按 5×10/孔密度于 6 孔板中培养 HEK293 与 L-02 细胞，37?， 5% CO2 中培养，待细胞达到约 80%融合状态时进行转染。使用 Polyfect(20ul/孔)作为转 90 染试剂，将 pRG-TK，pRG-P122 与 pRG-eALB-P122(2ug/孔)分别转入六孔板中，每组质 粒设三个复孔。48h 后，在荧光显微镜观察下观察绿色荧光蛋白表达情况。 polyfect(20ul/孔)将 pRL-TK，pRL-P122 与 双荧光素酶报告系统:使用转染试剂 pRL-eALB-P122 分别转染到 6 孔板培养的 HEK293 细胞和 L02 细胞中(2ug/孔)，各孔同 时转入 0.2ug 的 pGL3-control 作为内参，每组质粒设三个复孔。48h 后，按 Promega 公司的 双荧光酶报告系统试剂盒收集细胞，制成细胞裂解液，使用 GloMax2-/20 发光检测仪 95 测定两种荧光素酶的相对活性。以 pRL-TK 转染的细胞作为对照。 1.3.4 统计学分析 检测数值以 x+s 表示，采用 SPSS10.0 统计软件进行统计分析，多组间均数比较采用单 因素方差分析。当 P<0.01 时，界定为具有显著性差异。 2 结果 100 2.1 PCR 扩增获得 P122 和 eALB 以人 293 细胞基因组 DNA 为模板，成功扩增出大小为 1184bp 的 miR-122 启动子片段 (P122)，以小鼠基因组 DNA 为模板，扩增获得大小为 830bp 的小鼠 eAlb 增强子片段(eALB) (图 1)。 105 图 1 P122 及 eALB PCR 产物电泳结果 110 Fig. 1 Electrophoresis of PCR product of miR-122 promoter and eALB enhancer M:Mix DNA ladder marker; 1:PCR product of miR-122 promoter; 2: PCR product of eALB enhancer. 2.2 报告基因载体构建 用 Nhe?/Not?和 Hinc?/Not?两组内切酶分别酶切鉴定 pRG-TK(结果未显示);用 Nhe?/BamH?和 Nco?/Not?两组内切酶分别酶切鉴定 pRG-P122(结果未显示);用 Nhe 115 ?/BamH?和 Nco?/ Hind?两组内切酶分别酶切鉴定 pRG-eALB-P122，结果如图 2-A 所示 2 号克隆为正确克隆，其质粒结构图谱见图 2-B。 用 Nhe?/BamH?和 Nco?/Not?两组内切酶分别酶切鉴定 pRL-P122(结果未显示); 用 Nhe?/BamH?和 Nco?/ Hind?两组内切酶分别酶切鉴定 pRL-eALB-P12(结果未显示)。 120 图 2 报告基因载体重组质粒酶切鉴定电泳结果及其基因结构图谱 Fig. 2 Identification of recombinant colonies and vector structure of recombinant plasmid A: Identification of recombinant colonies of pRG-eALB-P122; B: Vector structure of pRG-eALB-P122. 2.3 P122 及 eALB-P122 组织特异性的定性分析 125 为定性检测 miR-122 启动子及小鼠增强子 eALB 在 HEK293 和 L02 细胞中的活性，以 含 TK 启动子的绿色荧光蛋白报告基因载体 pRG-TK 作为对照组，分别转染 HEK293 细胞(图 3A)和肝脏细胞株 L0(2 图 3D)，用含 miR-122 启动子的绿色荧光蛋白报告基因载体 pRG-P122 分别感染 HEK293 细胞(图 3B)和肝脏细胞株 L02(图 3E)，以及同时含 miR-122 启动子 130 及小鼠增强子 eALB 的绿色荧光蛋白报告基因载体 pRG-eALB-P122 分别感染 HEK293 细胞 (图 3C)和肝脏细胞株 L02(图 3F)，结果显示?miR-122 启动子启动绿色荧光蛋白基因 在肝脏细胞株 L02 中显著表达，在 HEK293 细胞中几乎没有表达;? 小鼠增强子 eALB 在 肝脏细胞株 L02 中能够增强 miR-122 启动子活性。 135 图 3 绿色荧光蛋白报告基因载体转染 293 细胞及 L02 细胞 A、 B、C， 293 细胞; D、 E、 F， L-02 细胞; A、 D， 转染 pRG-TK; B、 E， 转染 pRG-P122; C、F， 转染 pRG-eALB-P122. 放大倍数 200× Fig. 3 EGFP expression in the transfected culture cells 140 A、 B、C， 293 cells;D、 E、 F， L-02 cells; A、 D， pRG-TK transfected; B、E， pRG-P122 transfected; C、F， pRG-eALB-P122 transfected. 2.4 P122 及 eALB-P122 组织特异性的定量分析 为定量检测 miR-122 启动子及小鼠增强子 eALB 在 HEK293 和肝脏细胞株 L02 细胞中 145 的活性，以含 TK 启动子的荧光素酶报告基因载体 pRL-TK 作为对照组，用含 miR-122 启动 子的荧光素酶报告基因载体 pRL-P122、同时含 miR-122 启动子及小鼠增强子 eALB 的荧光 素酶报告基因载体 pRL-eALB-P122 分别感染 HEK293 细胞(图 4)和肝脏细胞株 L02(图 4)， 结果显示?在 HEK293 细胞中，miR-122 启动子活性显著下降(P<0.01)，仅为 TK 启动子 活性的 1/10-1/9;?在肝脏细胞株 L02 中，miR-122 启动子活性与 TK 启动子活性无明显差 异，小鼠增强子 eALB 使 miR-122 启动子活性增强了 9.25 倍。 150 L-02 细胞 细胞 293 10 1.2 9 1 8 活 7 0.8 6 相对比 5 0.6 4 0.4 3 荧光素酶荧光素酶相对比活 2 0.2 1 0 0 pRL-TK pRL-P122 pRL-e ALB-P122 pRL-TK pRL-P122 pRL-eALB-P122 图 4 P122 及 eALB-P122 在 HEK293 及 L-02 细胞中的活性 Fig. 4 The activities of miR-122 promoter and eALB enhancer in HEK293 and L-02 cells 155 3 讨论 本研究克隆了人 miR-122 启动子(P122)以及小鼠 ALB 增强子(eALB)，并通过绿色荧 光蛋白和荧光素酶两种报告基因系统，分别定性与定量检测了 P122 与 eALB-P122 的组织特 异性与表达活性。结果表明，克隆获得的 miR-122 启动子具有较好的肝脏组织特异性，只在 160 肝细胞株 L-02 中表达报告基因，而在非肝脏细胞 HEK293 中基本无活性。在增加了 ALB 增 强子后，miR-122 启动子在 L-02 细胞中的表达活性显著增强，而在 293 细胞中仍基本不具 有表达活性，表明 eALB-P122 既具有良好的肝组织特异性，又具有较强的表达活性，可能 在肝脏靶向性基因治疗中具有一定的应用前景。在后续研究中，我们拟在 eALB-P122 后增 加鸡 β-Actin 的 5’UTR 以及内含子 1，通过更多的顺式调控元件增强 miR-122 启动子的表达 活性，并保持其肝脏特异性。 165 microRNA 的成熟是一个多步骤加工过程，关于其初级转录体(primary microRNA)的 [10][11] 转录机制仍存在争议。较早的研究认为，microRNA 是由 RNA 聚合酶 II 转录，因为许 多 microRNA 具有时空表达特异性，而 RNA 聚合酶 III 一般不具有组织特异性。但目前分离 获得组织特异性 microRNA 启动子的报道有限，因而该观点证据略显不足。后来有研究表明， [12]microRNA 是由 RNA 聚合酶 III 负责转录，就像大多数非编码RNA 如 tRNA 一样。在本 它来控制蛋白编码基因的表达，证实了其 研究中，我们克隆获得 microRNA 的启动子，利用170 肝脏特异性，反向证明了 microRNA 是由 RNA 聚合酶 II 负责转录的。因而，我们推测由于 microRNA 所处的基因组位置各异(可位于基因间、编码基因内含子区，编码基因外显子区)， microRNA 的转录机制可能并不统一，有些 microRNA 可由 RNA 聚合酶 II 负责转录，而另 一些 microRNA 则由 RNA 聚合酶 III 负责转录。miR-122 在哺乳动物中保守性较高，均在肝 脏组织中特异性表达，其组织特异性可能取决于启动子区域中包含的肝脏特异性转录因子如 C/EBPα 结合位点。 175 [参考文献] (References) 180 [1] Nguyen TH, Ferry N.Liver gene therapy: advances and hurdles [J]. 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