漆酶活性检测

漆酶活性检测 漆酶活力及生物量的测定 将取自发酵液中的样品通过滤纸进行固液分离，液体部分用于测定漆酶的活力，固体部分放入烘箱中在 70?下烘干至恒重，称量获得菌体的干重(以g/L 表示)[129]。以酚类化合物DMP为底物测定漆酶的活力，参考Wang等人[130]的测定方法并稍做调整。反应体系为3 mL，其中包括2.4 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 3.5)、0.5 mL的10 mmol/L DMP及0.1 mL的酶液，反应体系在加入酶液前45?下保温5 min，之后加入酶液在 470nm 处测吸光值(ε= 49,600 M-1cm-1)。1 个酶活力单位定义为每分钟产生 1 μmol 产物所需要的酶量。 cueo蛋白性质研究 CueO具有对酚类底物的广泛氧化能力,但大多数酚类的氧化过程都无准确直接并且简单的检测手段与之对应,因此我们选择了一种氧化态能产生显着可见光吸收变化的辅助电子供体ABTS来间接标定CueO的氧化催化过程(图1.2.3.1)"ABTS全称为2,2.一azino一bis(3一ethylbenzthiazoline一6一Sulfonie acid),自身氧化过程如下式,氧化态的ABTS在420nm可产生线性光吸收" 为保证每次测量之间数据的可比性和平行性,我们固定测活体系为2ml反应体系中,ABTS终浓度为2mM,所用各种pH缓冲液终浓度100mM,所加入的各种状态的CueO蛋白终浓度均保持0.InM,并且所有反应使用相同的U一2810型双光束 精密分光光度计及原装玻璃比色杯(HitaehiHigh一TechnologieS CorPoration),反应温度恒定25e"双光束检测过程中,均以97e热变性10min的同浓度CueO蛋白加 入相同反应体系作为空白对照" 漆酶活力测定 漆酶酶活测定以I)MP为底物，参考 I itthauer等人的测定方法 稍做调整。每3 mI 反应体系 含:0(1 mol,l 柠檬酸? 磷酸氢一钠缓冲液(PH 3)， 0(01 mol,I DMP，60?保温l0 rain后加入0(1 mI 酶液，在 分光光度计 469 nm 处测吸光值。以每分钟氧化1,~mol 的DMP(,一49(6 I mmol?cm))所需要的酶量定义为 1个酶活力单位，酶活性以u,I 表示。数据处理以最大酶活 为l()(】 。