魔芋魔芋组织培养

魔芋魔芋组织培养 魔芋喜欢润又湿，整个生长期需要水分较多，魔芋湿需肥量较大的耐肥作物，特别是氮。磷。钾等主要的元素。这三样的比是2:1:3.。侵染性病毒，有黑腐病，一般在6月发生，药物防治是用种芋前用百分之50的代森铵600液侵种十分钟，或使用1000倍硫酸铜侵出液，侵泡十分钟 文字提取关闭 文字提取关闭 的 植物组织培养(Plant tissue culture)是指在无 菌条件下，将离体的植物器 官(根、茎、叶、花、果实 等)、组织(形成层、花药 组织、胚乳、皮层等)、细 胞(体细胞和生殖细胞)以 及原生质体，培养在人工配 制的培养基上，给予适当的 培养条件，使其长成完整的 植株，统称为植物组织培 养。由于培养的是脱离母体 的培养物，在试管内培养，所以也叫离体培养(Culture in vitro)或试管培养(In test-tube culture)。根据被切除的植物体来源不同的培养对象不同又可分为:培养幼苗或较大的植物体，叫植物培养;培养成熟以及未成熟的离体胚，叫胚胎培养;培养植物的根尖、茎尖、茎段、花器各部分、果实叫器官培养;培养分散的细胞或小的细胞团体称细胞培养;培养去除细胞壁、裸露的原生质体叫原生质体培养。一般讲培养什么器官叫什么培养。还可根据培养目的来分:有试管嫁接、试管授精、试管加倍、试管育种等等。依据培养方法来分又有平板培养、微室培养、悬浮培养、单细胞培养等;培养植物体或一部分器官、组织、细胞、细胞器，在人工控制条件下，使其按照人们意愿去分化或产生人们所需的部分或产物，来满足人们的需要，为人类造福。 2、理化基础 ?细胞的全能性 植物是由细胞构成的，细胞是生物结构和生命活动的基本单位。一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称之为细胞的全能性(cell totipotency)。换言之，细胞全能性是指植物细胞具有全套遗传信息，不管是性细胞还是休细胞，在特定的环境下仍能进行达，而产生一个独立完整的个体。 植物细胞，只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着恢复到分生状态的能力。其恢复过程取决于该细胞原来所处的自然部位及生理状态。一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态 脱分化”，一个已分化的细胞若要表现其全并形成未分化的愈伤组织的现象叫“ 能性首先要经历脱分化过程，然后再经历分化过程。 组织培养中，即利用特定的条件，促进细胞脱分化，即原已分化并具有一定功能的植物细胞脱离原有轨道，失去原有状态和功能而恢复至未分化的愈伤组织状态，这就是植物组织培养中的去分化或脱分化过程。 脱分化过程的难易与植物种类、组织和细胞状态有关。一般单子叶植物和裸子植物比双子叶植物难;成年细胞和组织比幼年细胞和组织难;单倍体细胞比二倍体细胞难。切取的植物组织、器官和细胞，在人工培养条件下，可促进脱分化，产生愈伤组织，然后经过继代培养，通过人为控制又可产生分化。把这种原已分化的细胞，经脱分化培养后再次分化的现象叫再分化，产生分生组织，继而分化出根、芽或胚状体(embryoid)。脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式，一种是器官发生方式，其中茎芽和根是在在愈伤组织的不同部位分别独立形成的，形成的时间可能也不一致，它们为单级性结构，里面各有维管束与愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间并没有共同的维管束把二者连在一起;另一种是胚胎发生方式，即在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体，或称体细胞胚，它们经历的发育阶段与合子胚相似，成熟胚状体的结构也与合子相同。胚状体是双极性的，有共同的维管束贯穿两极，可脱离愈伤组织在无激素培养基上独立萌发。一般认为，愈伤组织中的不定芽起源于一个以上的细胞，而体细胞胚只起源于一个细胞，因此由体细胞胚长成的植株各部分的遗传组成应当是一致的，不存在嵌合现象，因此认为体细胞也起源于一个以上的细胞，其过程为: 植物体脱分化——愈伤组织再分化——生长点(生芽发生)——幼茎、根或胚状体——小植株 ?魔芋植物组织培养的特点 ?培养材料经济:由于植物细胞具有全能性，故单个或小块组织细胞培养即可再生植株，这在研究上有重大价值。在生产实践中，以茎尖、根、茎、叶、子叶、下胚轴、花芽、花瓣等作材料进行器官培养时，只需几毫米甚至不到一厘米大小的材料。由于取材少，培养效果好，对于新品种的推广和良种复壮更新，都有重 大的实践意义。 ?培养条件可人为控制:植物组织培养中植物材料完全是在人为提供的培养基质及小气候环境条件下进行生长的，摆脱了大自然中四季、昼夜气候的频繁变化以及不时受灾害性气候影响，有利于植物生长，便于稳定地进行周年培养生产。 ?生长周期短，繁殖率高:植物组织培养可人为控制培养条件，根据不同植物、不同离体部位的要求，提供不同的培养条件。因此生长快，往往1-2个月就可完成一个生长周期。所以，虽然需要一定的设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数大量繁殖生产，总的来说还是成本低，利于生产应用，能及时提供规格整齐一致的优质无病毒种苗。 ?管理方便，利于自动化控制:植物组织培养是在一定场所，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，进行高度集约化、高密度的科学培养生产，比盆栽、田间栽培繁殖省去了中耕除草、浇水施肥、病虫防治等繁杂劳动，大大 节省人力、物力及土地，可 通过仪器仪表进行自动化 控制，利于工厂化生产。 ?魔芋组织培养所需营养 与环境条件 魔芋组织培养所需营 养分为四大类:无机营养、 有机营养、植物生长调节物 质、能源和渗透压。 ?无机营养中又分为大量 元素和微量元素两类，其中 大量元素除碳(C)、氢(H)、氧(O)、外，还有氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)和硫(S)等元素。它们影响着植物组织培养中酶的活性和方向，决定着新陈代谢的过程，微量元素包括铁(Fe)、铜(Cu)、钼(Mo)、锌(Zn)、钠(Na)、锰(Mn)、钴(Co)、硼(B)和碘(I)等。 ?有机营养包括维生素类、氨基酸、有机添加物、琼脂、活性炭五类。其中维生素在植物材料的生长中起着重要作用，因为它们以辅酶的形式参与生物催化剂——酶系的活动，参与细胞的蛋白质、脂肪、糖代谢等重要生命活动。氨基酸:有甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酷蛋白(CH)和水解乳蛋白(LH)等，为重要的有机氨源。甘氨酸能促进离体根的生长，对植物组织的生长也有良好促进作用，通常用量为2-3mg/l。丝氨酸、谷氨酰胺有利于花药胚状体发生或不定芽的分化。水解酷蛋白和水解乳蛋白也是多种氨基酸的混合物，对培养材料胚状体或不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量是300-2000mg/l。有机添加物是一些成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但成分大多不清楚，含量也不稳定，所以一般应尽量避免使用，特别是新的生长调节物质不断产生，更缩小了它们的使用范围。但因其对一些难以培养材料具有的特殊作用，故在一些试验中还常应用。琼脂是一种从海藻中提取出来的凝胶性物质，作为凝固剂，一般使用浓度为0.6-1%。琼脂在植物组织培养中除固化作为培养材料的支持物外，还具有吸附能力，以色白、洁净的为好。活性炭的目的是除去琼脂中的毒物或培养物产生的芳香族的代谢废物，另外它可防止组织变褐并刺激胚胎的发生与生根。 ?植物生长调节物质:是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着重要而明显的调节作用。植物生 长调节物质包括生长素(如:2,4-D、NAA、IBA、IAA等)、细胞分裂素(如:KT、6-BA、ZT、2ip、ABA、CEDP等)及赤霉素等。通常认为生长素和细胞分裂素的比值大时有利于根的形成;比值小时，则有利于芽的形成。 ?能源和渗透压:通常植物本身能进行光合作用，产生糖类，不需要从外部供给糖，但在植物组织培养进行异养的状况下，大多不能进行光合作用来合成糖类，因此必须在培养基中添加糖，作为碳素来源和能量物质，同时糖对保持培养基的渗透压也有一定的作用。 环境条件主要是温度和光 照: ?温度是植物组织培养中 成功的重要条件。在植物组 织培养中大多采用最适温 度，并保持恒温培养，以加 速生长，通常采用25?-2? 的温度。温度不仅对增殖， 而且对器官的形成也有影 响。在植物组织培养以前先 对培养材料进行低温或高 温处理，往往有促进诱导生 长的作用。 ?组织培养中光照也是重要条件，它对生长和分化有很大影响。有的材料适合光培养，有的则适合暗培养。不同波长的光对细胞的分裂和器官的分化也有影响。 ?常用组织培养仪器设备及必要器皿:天平、高压蒸气灭菌锅、烘箱、冰箱、酸度计、显微镜、净水器、空调、培养架、超净工作台、透明培养器皿、盛装器皿、计量器皿、镊子、剪刀、分离器械、过滤器械、接种针等。 ?培养基的配制程序:水、药品、糖、琼脂混合加热溶解——PH值调整——分装至干燥的培养器皿中——封口——高压蒸汽灭菌——冷却——凝固——接种备用。 3、魔芋组织培养的实验及科研状况 据不完全统计，自80年代以来，日本报道魔芋的科技文献有332篇，其中速报86篇;实用新型公报17篇;公开特许公报145篇;特许公报84篇;国防专利29项。这些科技成果涉及了魔芋的栽培管理、育种、病虫害防治、物化性能、普粉加工、精粉分离、葡甘聚糖纯化、分析测试技术以及各种有关魔芋产品的加工、设计及机械设备等。可见，日本国魔芋资源开发如日中天。而我国在栽培、利用魔芋资源方面均先于日本，我国是魔芋原产国之一，栽培利用历史悠久，进入80年代以来，随着魔芋各种新用途的不断开拓，魔芋大面积人工栽培与加工利用逐步兴盛。只是时至今日，中国魔芋资源的开发仍以外销产品为主，国内对魔芋产品的消费水平较低，但随着人们生活水平的不断提高，国内对魔芋产品的消费量将与日俱增。国外迄今为止，魔芋的栽培利用主要集中于热带地区的亚洲国家，欧美国家仅有少量研究。80年代以来，国内外对魔芋开创性地研究，使魔芋的食用、药用、工业价值大为提高，经济效益也越来越显著。但纵观全局，随着植物组织培养技术的不断成熟，这一技术已越来越广泛地应用到许多植物的快速繁殖中，有关魔芋组织培养研究也时有报道。然而，利用这一技术进行魔芋种芋快速繁殖的相关研究还比较少。关于魔芋组织培养的报道还仅限于实验阶段，许多单位已顺利地从不同的外植体诱导出了魔芋试管苗，试管苗通过移栽也获得了小批量的原原种，原原种下大田的技术也正处在研究阶段。目前已有许多科研机构、大专院校及大型企业开始致力于如何将这一科研成果运用于工厂化生产的研究，我们天池山魔芋研究中心正集中大批人力物力进行这一项目的科研攻关，另外也将今后魔芋研究和开发利用的重点集中在高产优质(KMG含量高)品种的选育和快速繁殖以及种源繁殖体系的建立。有望近期取更大的进展。 4、魔芋组织培养方法 ?、材料类别:?芋鞭及芋鞭顶球形部分(9月初取样);?开始萌动的球茎(4月份天气转暧时取样);?萌动芽的苞叶(4月份天气转暧时取样);?幼苗的叶柄(刚出苗至10厘米左右时取样)。 ?、培养基及激素调控:试验以MS基本培养基配方为基础，以不同的激素浓度组合设计愈伤组织脱分化培养基、再分化培养基及生根壮苗培养基。激素有6苄氨基嘌呤、6糠基氨基嘌呤、玉米素、吲哚乙酸、萘乙酸。建议采用6苄氨基嘌呤与萘乙酸配比与形态建成的外源激素调控，效果好，成功机率高，具体是: ?愈伤组织脱分化培养基 MS+NAA1mg/l+6-BA0.5mg/l; MS+6-BA1mg/l+2,4-D0.5mg/l+NAA0.2mg/l; MS+2,4-D0.1mg/l; MS+6-BA2mg/l+2,4-D0.2mg/l。 ?再分化培养基 MS+NAA0.1mg/l+KT0.5mg/l; MS+NAA0.5mg/l+6-BA2mg/l; 1/2MS+6-BA2mg/l+IBA0.2mg/l+NAA0.1mg/l; 1/2MS+6-BA3mg/l+IBA0.1mg/l+NAA0.1mg/l。 ?生根壮苗培养基 1/2MS+NAA0.2mg/l+6-BA1mg/l+IBA0.1mg/l; 1/2MS; 1/2MS+NAA1mg/l; MS0(即:不加任何激素的MS培养基)。 以上所有培养基均在配制时加入蔗糖30—40克/升(在大批量生产时可用白糖代替);加入琼脂粉8克/升(视琼脂的质量好坏可适当加减);PH值的范围调整在5.8-6.5之间。 ?、外植体灭菌 芋鞭和球茎先用自来 水冲洗掉表面泥土，然后用 洗衣粉水浸泡20分钟后再 用软刷刷洗，再用 1/1000“新洁而灭”溶液 洗擦20分钟后进入超净工 作台，进入超净工作台后先 用5%的次氯酸钠溶液浸泡 并搅拌5-8分钟，再用75% 的酒精浸漂30秒钟，用无 菌水冲洗3遍，漂去残余酒 精，最后用1/1000的升汞 灭菌12-15分钟，用无菌水冲洗5遍，无菌条件下，伸长茎切成0.3-0.5厘米厚的圆片，球茎切成0.3-0.5厘米厚、0.5-1厘米宽的切块。 叶柄与芽苞叶灭菌只要用75%乙醇浸漂30秒，用无菌水冲去乙醇，再用1/1000的升汞灭菌8-10分钟，无菌水冲洗5遍。叶柄切成0.5厘米×1厘米大小的长方形切块。接种在诱导愈伤组织的培养基上。 ?、生长与分化情况(形态 建成) 外植体脱分化形成愈 伤组织，用块茎、芋鞭、切 块等均能诱导出瘤状愈伤 组织。诱导时间20天左右， 诱导频率随外植体的状况不同而存在差异。好的接种材料可达83%以上，低的仅达24%以下，或无愈伤组织。外植体由于水洗和切伤易产生粘液，在诱导愈伤组织的培养基上形成水环。进行一周的暗培养后，进行光照培养(12小时/天)，切块变黑。前两周几乎无变化，20天左右，多数切块表面陆续裂开，从中长出呈球状(瘤状)的愈伤组织。获得的愈伤组织有三种:一种为白或白带微红的愈伤组织，致细坚密;一种为黄绿色的愈伤组织，粒状;一种为黑褐色的愈伤组织，但仍具有活力。三种愈伤组织中，以黑褐色者最多。此后移至相同的培养基上进行继代培养，在继代培养中每块愈伤组织可切成4-5块(数量可根据愈伤组织大小而定)。愈伤组织表面会逐渐变黑。三种组织经再分化培养，都能获得绿色小植株。 从外植体直接诱导多芽，再生植株。用块茎或鳞叶为外植体，在MS加6-BA2mg/l，NAA0.5mg/l的培养基上，2周后外植体开始膨大，经60天外植体膨大成圆球形，或切口处形成愈伤组织，棕褐色，球面上或愈伤组织处产生许多芽点，进而形成密集丛芽。丛芽除个别芽点直接形成少量植株外，大部分丛芽在原培养基上很少伸长，当把外植体按丛芽部位再行分割，不要切伤芽点及芽，切成若干小块，并转至含0.5-1mg/l6-BA，0.2mg/lNAA的培养基上，经5-6周，原外植体上的丛芽伸长，抽出复叶并形成根，长出完整小植株。 魔芋小块茎的诱导与形成。魔芋在组织培养中有两种方式形成小块茎。先成苗，后形成完整小块茎;或从外植体诱导微型小块茎，培养小块茎成苗，再生植株块茎。其方法是用主芽基部周围的块茎切块，在低浓度激素调控的MS培养基 -7周，在靠培养基一面及周围，再生出许多黄褐色，质地较硬的小球状上培养6 组织块，随后形成大小为0.2-0.3厘米的微型小块茎，这种小块茎可以不断增殖。将其分离并转到无激素的培养基上，则在小块茎上长出芽，然后长成完整小植株。在白魔芋鳞叶切段的培养中，除产生多芽外，也观察到从切口处形成微型小块茎，由于它不断增殖，一块外植体形成的组织块上，有许多这种小块茎。随后逐渐长出芽，进而形成植株。 继代培养及小块茎增殖。瘤状愈伤组织一般5-6周继代一次，培养后的愈伤组织能保持旺盛的生命力。小块茎只要在不去除激素的原则基础上，也可不断增殖，一般8-10周进行一次继代增殖培养。获得许多小块茎，供扩大繁殖用。 用花序上的雌雄花轴切块获得种子及植株。在同一瓶中接雌、雄花各一块。经2个月培养能形成种子。种子由子房膨大而成，椭圆形，比黄豆粒稍大，颜色由淡黄白色变绿，最后变成桔红色。经过一段休眠期之后，种子在培养基中生长发芽，需要更新1次培养基。最后形成完整的绿色小植株。全程需200天以上。 幼芽的生根:将出芽的愈伤组织转入含低浓度生长素的培养基中，经2周的培养长出许多小根，生根率达80%。再将生根的组织培养苗转入不含激素的MS培养基，经培养30天左右，芽苗逐渐长大，并长几片鳞叶后抽出绿色复叶，叶柄也逐渐变粗，有的在叶柄底部形成1个膨大的小球茎。试管苗与栽培的块茎长根抽叶相同，不同之处是栽培条件下块茎常常只抽出一叶，组培条件下一个拇指大的愈伤组织能抽2-3芽，有的一芽能长出2片叶。 ?、幼苗的锻炼、移栽与管理(此处仅讲土壤基质移栽，其它方法见下节)。 快速繁殖的魔芋组培苗，植 株高度为3-10厘米，在移 栽前，先打开培养瓶，在自 然光下培养2-5天，锻炼其 适应环境的能力，再将幼苗 连同整块愈伤组织从培养 盒中移出，用水洗净培养 基，并用1/1000的代森锰 锌溶液浸苗3-5分钟后，种 植于黑色小盆中，在室内锻 炼15天，移栽成活后便可 带土移栽于半荫半阳，土壤 肥沃，保湿性良好的生态环境中。成活率可达95%以上。组培苗的移栽标准:有芽、有根、苗壮、出瓶越小越易成活，纤细软弱苗难成活，若仅切下带根苗移栽，部分苗能成活，但叶柄短，展开的叶面积小。 移栽后用1/4MS无机盐溶液灌溉作定根水。展叶前土壤保持 苗床的管理:? 湿润。如果苗床上土壤肥沃疏松，用自然水作定根水。?避免阳光直射，较适宜光照强度为日光的1/3，根部发育需要暗光。?防治白绢病和软腐病:试管苗在 -10天，待芽展叶时就可移栽至大田中栽培。如果试管苗芽苗床生长时间一般7 壮根多就可以直接栽种在具有砂壤的大田里。 5、种繁方法 ?试管苗诱导形成原原种:试管苗的长度不影响栽培效果，仅有芽点的材料栽培效果最差，移栽成活的关键在于试管苗是否长根，只要长根其成活率可达到100%，另外不带愈伤组织的试管苗移栽效果较带有一定大小愈伤组织的试管苗差。 在以上试验结果的基础上针对相同的魔芋试管苗做了不同方法的无土栽培试验。采取了有基质和无基质两种形式，有基质的是1/2珍珠岩+1/2至石，在移栽前用消毒水将基质拌匀，移栽后用1/8MS营养液作定根水，然后在一个星期内用叶面喷雾法使幼嫩的试管苗保持一定的渗透压，促进其成活;无基质则是用不同浓度的MS营养液和清水进行液体培养，经过观察试管苗的成活率和生长状况，最终结果为:试管苗的移栽前经过2,3天的培养室炼苗，然后以一定浓度的MS营养液作为其营养来源的无基质栽培方式较好。 水培移栽方式: 以MS营养液为基础，配制 成一定浓度梯度的营养液进行 试验，其中有全MS、1/2MS、 1/3MS、1/4MS、1/5MS、1/6MS、 1/7MS、1/8MS、1/9MS、1/10MS 十个梯度?以1/8MS,1/10MS 的效果最好。 具体方法是:用经过0.1%的“84”消毒液浸泡后再经0.01%“84”消毒液清洗的海绵作支持物，置于底部有孔的黑色塑料杯中，然后一起放入装有营养液的透明塑料培养盒中。用试管苗直接进行水培收获块茎重量平均为2-5克。 有基质试验:利用这种方法也同样可获得大小为3克左右的原原种。 ?用通过魔芋试管苗获得的原原种在温室中采用有基质和无基质两种方式进行繁殖。其栽培方法简单易行，同上面和试管移栽方法。经过四个月左右的时间培育，可获得平均重量为15-20克的魔芋原种块茎，这样大小的魔芋原种进入大田培养已不存在技术问题。 通过组织培养室常年进行魔芋试管苗的诱导，温室常年可以进行魔芋原原种及魔芋原种的培育，这样就可缩短种繁的周期，可以使魔芋种芋的供应不受时间及季节的控制。而且通过这一手段可以大大减少魔芋病毒及其它病害的传播，同时进一步提高魔芋种芋的质量。 6、注意要点 ?初代培养物的建立 魔芋组织培养的成功，首先在于初代培养，亦即能否建立起无菌外植体。在一个周围严重污染的环境中，要千方百计保证培养材料和培养基的无菌状态及培养室的良好清洁条件，这也是最基本的前提。要成功地建立初代培养，首先，一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位;其次，一定要选择好合适的培养基，激素及其他添加物;还要注意掌握适宜的培养条件。要建立初代培养，操作技术也是十分重要的，因此在接种时，动作要熟练，操作要快，所用时间缩短也可能就避免了污染。 ?污染的防止 ?魔芋接种材料的选择及防止污染:选用的魔芋材料要是健康不带病斑的，在接种之前先用冷藏的方法使部分细菌冻死，组织培养中对材料只能进行表面灭菌，而对材料内部所带的细菌和霉菌等杂菌往往难以对付，为此可在培养基中添加抗生素来解决。 ?人为污染的防止:在培养过程中，培养材料附近经常会出现粘液关液体或混浊的水迹状痕迹、或有泡沫的发酵状情况。这大多是细菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及人们呼吸时排出的细菌所引起的，有时也因人们用手接触了材料或器皿边缘所致。为此，接种前应很好地将手用肥皂洗净后，再用70%洒精擦洗双手，并需及时剪除指甲。在工作中特别要注意避免交叉感染，用具被手污染后，又接着使材料污染，因此双手必须清洁，工具则用一次即需消毒一次。工作人员呼吸所产生的污染，主要是接种是说话或咳嗽所引起的，因此，操作时严禁谈话，并应戴上口罩，穿工作服，戴工作帽。有时在培养基上还会出现黄、白、黑等不同颜色的霉菌，这是真菌性污染，主要是由于接种室空气污染造成的，故也应做好这方面的消毒灭菌工作。污染中特别注意一种呈乳白色细菌的污染，这种细菌为芽孢杆菌。它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死，若出现应严格灭菌，清洗用具，更换消毒酒精等。 ?防止外植体褐变:魔芋材料很容易褐变，甚至接种后会使培养基变褐，严重影响外植体的生长、分化、成为组织培养中的一大障碍。 ?褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生醌类物质，这类物质呈棕褐色，它们会逐渐扩散至培养基中，抑制其他酶的活性，毒害培养的外植体材料:褐变的因素是复杂的，随植物种类、基因型、外植体部位培养基成分、培养时间过长及生理状况等的不同而危害的程度也有区别， ?褐变的防止:?、选择适当的外植体和培养条件:外植体应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化和再分化的培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。选择适宜的无机盐成分、蔗糖浓度和激素水平也是十分重要的。适宜的温度和及时转接培养也可显著减少材料的褐变。初期暗培养也有降低褐变的作用。?、抗氧化剂的作用:在培养基中加入抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、半胱氨酸、柠檬酸、活性炭等抗氧化剂，或 用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的确良形成。?、连续转移:对于易褐变的材料，进行连续转移，可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用。 1、范围 本标准规定了魔芋试管苗、原原种、原种、良种繁育的术语及定义、繁殖体系、繁殖技术、采收、分级、运输和贮藏。 本标准适用于组织培养的魔芋种芋繁殖。 2、规范性及引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。原有条款中与本标准不一致的内容，以本标准为主。在本标准发布后改进的内容，可作为对本版本的修订;如果内容改动较大，可作为新版本发布。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 NY/T715-2003 魔芋种芋繁殖技术规程 DB42/T 332-2005 魔芋丰产栽培技术操作规程 DB61/T382-2006 魔芋种子繁育种芋分级标准 3、术语及定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 外植体 explant 由具有本品种特征的活植物体上分离下来以进行培养的组织或器官(如魔芋的球茎、根状茎、叶片、叶柄、芽孢、生长点等的切块、细胞、原生质体等)的各种接种材料。 3.2 愈伤组织 callus 将外植体放在适当的培养基上进行培养，器官或组织进行细胞分裂，形成的新组织(薄壁细胞团)。 3.3 试管苗 test-tube plant 外植体在适合的光照、温度和营养元素、激素等条件下，经愈伤组织分化或其它途径，产生出各种器官和组织，进而发育成具有本品种特征的完整魔芋植株。 3.4 原原种 super seed crom 由试管苗在光照、温度、营养元素元素等因素可控的条件下(试管内或非试管)栽培，倒苗后形成的具有本品种特征的魔芋球茎或根状茎，包括试管芋和非试管芋。 3.4.1 试管芋 test-tube crom 试管苗栽培在试管内，倒苗后形成的球茎。 3.4.1 非试管芋 de-test tube crom 试管苗出瓶后栽培在温度、光照、营养元素等条件可控的温、网室等试管外(如营养液栽培)，倒苗后形成的球茎。 basic seed crom 3.5 原种 原原种扩繁的球茎或根状茎。 3.6 良种 elite seed crom 原种扩繁的球茎或根状茎。 4 繁育体系及要求 4.1 繁育体系 魔芋外植体?试管苗?原原种?原种?良种。 4.2 繁育要求 4.2.1 试管苗 有试管苗工厂化生产车间，包括药品室、制剂室、洗涤室、接种室和组培室，有专业技术人员操作。 4.2.2 原原种 有工厂化生产车间，包括组培室或温室、网室，具备温、光、营养元素等试管苗形成原原种过程中可控的环境条件，试管芋生产在组培室进行，营养液栽培在温、网室进行，有专业技术人员操作。 4.2.3 原种 要求有一定规模的网室或大棚，栽培介质要求疏松透气，可采用草炭+蛭石+珍珠岩作基质或火土、腐植土、壤土等，有专业技术人员操作。 4.2.4 良种 将原种挖收后，进行分级、包装，运往种芋生产基地种植，成熟后即为商品芋的种芋，有魔芋种植经验的人员指导。 5 繁殖方法 5.1 试管苗 5.1.1 外植体取样部位及取样时期 魔芋球茎和根状茎在3月-6月顶芽萌动未出苗之前，叶柄和叶片在幼叶未展开之前，其它外植体取样时间均应选取样部位生长旺盛时期。 5.1.2 外植体消毒、灭菌 魔芋球茎和根状茎在密闭的容器中用甲醛-高锰酸钾熏蒸20min,30min后取出，待福尔马林气味散尽后75%酒精、0.1%升汞进行表面灭菌;叶柄、叶片、芽胞等外植体只需用75%酒精、0.1%升汞进行表面消毒灭菌后，用灭菌水洗净;从试管中培养的丛生芽中剥取的茎尖、芽鞘等顶端分生组织不需消毒灭菌。 5.1.3 培养基 采用MS培养基，添加不同的激素，配方与制作方法见附录A(规范性附录)。 5.1.4 接种 将消毒灭菌的魔芋球茎或根状茎在无菌环境下横向切成约10 mm×10 mm×5 mm的小块，叶片切成约10 mm×10 mm的小块，叶柄切成约10 mm长的小段，接种在培养基中，每瓶接种1块(段)。 5.1.5 培养 在清洁、干燥、通风并经环境消毒的培养室内，温度25?,26?，相对湿度65%,70%条件下，培养30d,35d，可见外植体膨大3,5倍，形成愈伤组织。培养过程中，每7d,10d观察一次，及时清除污染。 5.1.6 扩繁(继代培养) 在无菌环境下将愈伤组织取出，切成约8 mm×8 mm 的小块，转入继代培养基中，每瓶接种2,3块，放入培养室继续培养。 5.1.7 诱导分化 母苗(愈伤组织)扩繁到一定数量后，将愈伤组织取出，每块切3,4块，转入分化培养基，诱导丛生芽。 5.1.8 试管苗 将丛生芽分割成单株，带少量愈伤组织，移入分化培养基中，诱导生根和出苗，形成完整植株。 原原种 5.2.1 繁殖方法 5.2..1.1 试管内栽培 试管苗接种到生根培养基中，在温度25?,26?，相对湿度65%,70%，光照20000Lux左右的培养室中生长50d,80d，在瓶内倒苗，基部膨大，形成原原种。 5.2.1.2 营养液栽培 试管苗基部长出0.5 cm-2.0 cm的根后，带少量愈伤组织切下，用小流量自来水轻轻冲洗掉基部的培养基， 在25?左右、相对湿度65%,70%、自然光照条件下，温内炼苗7-10d。在温、网室内进行营养液栽培，倒苗后形成原原种。 5.2.2 采收和贮藏 5.2.2.1 采收 将成熟的原原种摘下，洗去培养基，在日光下晾晒1-2d或置于通风透气处晾干水分。 5.2.2.2 贮藏 将采收的原原种贮藏于河沙或其它基质中，以防失水过多，越冬时要采取措施，避免冻伤。 5.3 原种 5.3.1 催芽 原原种播种前，用1%的硫脲浸泡1h，取出晾干，置于泥炭、河沙等基质中，保持湿度80%,90%，温度20,25?条件下催芽25,30d。 5.3.2 播种 在平整的栽培介质(基质、火土、腐植土、壤土等)上掏出8,10cm深的小沟，沟间距15cm，亩施15,20kg复合肥作底肥，覆介质1,2cm，将出芽的原原种顶芽向上摆放，间距10cm，覆平基质，浇水使基质或土壤保持湿润。 5.3.3 管理 原原种出苗后至魔芋成熟期前，喷施1% KHPO4溶液或其它叶面肥 2-3 次，施复合肥 2 1-2 次。 网室或大棚内温度要保持在13 ? -30 ? 以内，土壤湿度低于 60%， 空气湿度低于 80% 就应浇水。发现虫害可用敌杀死进行杀虫;若发现病株，立即将全株带土取出地外进行烧毁或深埋，同时用 1000 万单位农用链霉素兑水 4000倍液灌穴(软腐病)，或在穴内及周围撒生石灰(白绢病)，及时控制，防止漫延，在进入 6 月份后，用农用链霉素每隔7 d打一次，连续打3 次，以防软腐病、叶枯病等病害的发生;生长期要及时拔除杂草，拔草时应注意防止损伤幼苗。 5.3..4 采收 倒苗10d后即可采挖，球茎及其根状茎不能受伤，晾晒5 h后除净泥土，剔除病、虫害球茎，转移到遮雨、通风处继续风干待贮。 良种 5.4.1 繁育 由原种在良种繁育基地生产，繁殖技术参照NY/T715-2003(魔芋种芋繁殖技术规程)和DB42/T 332—2005(魔芋丰产栽培技术操作规程) 5.4.2 分级及质量要求 级别 一级 二级 三级 50-100 10-50 质 量 (g) ?10 98 96 92 发芽率(%)? 100 100 100 纯 度(%)? 感 观 表皮褐色或淡黄色，无病、无伤、无霉烂。 5.4.3 包装、标志 5.4.3.1 包装 魔芋良种宜装在已消毒、硬质抗压、透气的专用箱筐，包装规格为15kg/箱,30kg/箱。 5.4.3.2 标志 包装箱上应标注:产品名称、类别、等级、净含量、生产企业(或销售企业)名称和地址、生产日期、保质期。 5.4.4 运输 5.4.4.1 产品在运输、装卸时应小心轻放，严禁撞击、挤压和雨淋。 5.4.4.2 一级良种直接运输到商品芋生产基地栽培，二级、三级原原种运输到商品种芋生产基地栽培。 5.4.5 贮藏 种芋贮藏在温度5-10?，空气相对湿度60-80%，通风透气。 附 录 A (规范性附录) 培 养 基 的配制 MS A.1 MS培养基母液的制备 A.1.1 贮备液?:大量元素，包括N、P、K、Ca、Mg等五种元素，其化合物成分和用量如下: 成分 数量(mg/L) 成分 数量(mg/L) NH4NO 16,500 MgSO.7HO 3 700 342 KNO 19 000 KHPO 1 700 324 CaCl.2HO 4 400 22 配制方法:先分别称取以上数量的药品于100mL-500mL的烧杯中，分别加适量蒸馏水或纯净水溶解，其中NHNO和KNO溶解时需吸热，冬季配制时可适当加温，MgSO.7HO43342难以溶解时可适当加温或加几滴1N的HCl溶液(如果仍不溶解，可能是因药品变质所导致，需弃去不用，另换新购买的药品)，待所有药品都完全溶解后，转入装有约400mL蒸馏水的1L容量瓶中，边转边摇动容量瓶，使溶液稀释，以免发生沉淀。所有装溶液的烧杯均需用蒸馏水洗涤3-4次，洗液一并转入容量瓶。最后，用蒸馏水定容至刻度。 有时一次需配制大量母液(如10L、20L甚至更多)，可将各种溶液分别定容至1L或2L，转入装有约1/4蒸馏水的容器中，将定容的溶液分别倒入该容器，每倒入一种溶液将容器摇动或搅拌，使其混合均匀，所有溶液均倒入该容器后，再用容量瓶添加不足的蒸馏水到需配置的容积后，充分混合均匀。采用该法需注意的是一定要记清每次添加溶液的数量。 母液配好后，要在试剂瓶上贴上标签，写明“MS大量元素、配制日期、配制人”等。使用时，每配制1L培养基用量筒量取100mL该贮备液。 A.1.2 贮备液?:微量元素，包括Cu、Zn、Mn、Mo、B、I、Co等七种元素，其化合物成分和用量如下: 成分 数量(mg/L) 成分 数量(mg/L) KI 166 NaMoO.2HO 50 242 HBO 1 240 CuSO.5HO 5 3342 MnSO.7HO 4 460 CoCl.6HO 5 4222 ZnSO.7HO 1 720 42 配制方法:先分别称取以上数量的药品于50mL-150mL的烧杯中(对于称量少于1000mg的微量元素，需用1/10000的电子分析天平，否则不容易称量准确)，分别加适量蒸馏水或纯净水溶解，按大量元素一样的操作步骤定容到1L后，转入1L棕色试剂瓶中，贴上标签，保存在低温冰箱中，使用时每1L培养基吸取5mL该贮备液。 A.1.3 贮备液?:铁盐，现一般用EDTA络合铁，能够适应pH5-8的培养物吸收，其化合物成分及其用量如下: 成分 数量(mg/L) 成分 数量(mg/L) FeSO.7HO 5 560 Na2.EDTA.2H2O 7 460 42 配制方法:在1/100的天平上先分别称取以上数量的药品于500mL的烧杯中，加适量蒸馏水，加热并不断搅拌使之溶解，然后将两种溶液混合把pH调到5.5，加蒸馏水到最终容积1L，贮备同微量元素。使用时每1L培养基吸取5mL该贮备液。 A.1.4 贮备液?:有机物，其化合物成分及其用量如下: 成分 数量(mg/L) 成分 数量(mg/L) 20 000 100 肌醇 盐酸硫胺素 100 400 烟酸 甘氨酸 100 盐酸吡哆醇 配制方法:以上试剂分别在1/100的天平上称取后，置于50mL-250mL的烧杯中，加适量蒸馏水溶解后，按大量元素配置方法定容，贮备同微量元素。使用时每1L培养基吸取5mL该贮备液。 A.1.5 贮备液?:激素 魔芋培养基中常用的激素如下: 成分 数量成分 数量 (mg/100mL) (mg/100mL) 6-BA 100 2,4-D 100 IBA 100 KT 100 NAA 100 GA 100 3 配制方法:2,4-D、NAA、IBA等生长素一般溶于95%酒精或0.1N的NaOH溶液，定容后分别贮存在100mL棕色试剂瓶中，贴上标签，保存在低温冰箱中。 6-BA、KT等细胞分裂素一般溶于0.5-1.0N的稀盐酸或0.1N的稀NaOH溶液，贮存方法同生长素。 与生长素和细胞分裂素相比，GA不常使用，但少量使用在打破魔芋球茎的休眠有一定3 的作用。GA易溶于冷水，最多配成1000mg/L的溶液，但GA溶于水后不稳定，容易分解，33 故最好以95%的酒精配成母液后在冰箱中保存。 A.1.6 贮备液?:0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+0.5%维生素,(Vc)溶液贮备液 分别称取10g PVP和50g Vc溶解于400mL蒸馏水中，混合后定容至1L，制培养基时每升培养基中添加100mL。魔芋初始培养切块时，取贮备液10mL稀释至100mL于培养瓶中(如果使用三角瓶需用封口膜封好)，与培养基一同灭菌。 A.1.7 无菌水 将蒸馏水或纯净水装在三角瓶、葡萄糖瓶等容器中，用棉塞塞紧或用封口膜扎好，在高压灭菌锅中灭菌30min，即为无菌水。 A.1.8 蔗糖 可用市售白糖。 A.1.9 琼脂 现一般用琼脂粉，可以不经溶化直接添加到培养瓶中。 A.2 魔芋培养基的制备 A.2.1 培养基中各种物质的用量 每1000 mL培养基中添加贮备液?100mL、贮备液?5mL 、贮备液? 5mL 、贮备液? 5mL、A.1.5中各种激素适量、贮备液? 100mL 、蔗糖30 g、琼脂粉5g~7g。 A.2.2 配制方法 在1000 mL容量瓶中先装上约500 mL蒸馏水，再将各种贮备液分别加到容量瓶中，每加一种溶液后要充分摇匀，以免局部浓度过高产生沉淀，所有物质都添加后，用蒸馏水定容，充分混合后，用0.1N NaOH和0.1N HCl调节培养基pH值至5.8~6.5。 将糖和琼脂加到可加热容器中，加入约70%的混合溶液，在电炉或水浴锅上加热至沸，糖和琼脂完全溶化后，再加入剩余的溶液，用玻棒或小铲充分混合均匀，转入分液器中进行 左右，温度太高会引起玻璃瓶分装，如果分装器是玻璃器皿，注意要待培养基冷却至60? 爆裂。 A.2.3 分装 根据培养器皿的大小，每瓶可装培养基25 mL~40 mL。在分装过程中，如果培养基开始凝固，则必须重新加热使其溶化，只有培养基在液态的时候才能分装。 分装在培养瓶中的培养基需用带透气片的瓶盖或封口膜封严，瓶盖或封口膜能阻止微生物污染，但可使空气自由交换。 A.2.4 灭菌 分装的培养基必须及时灭菌，夏天一般不能放置过夜，否则会很快变质。把已装入培养基并封盖好培养瓶放在高压灭菌锅中，在121?(1.06kg/cm2或0.15MPa) 下灭菌15min~20min。 培养基灭菌的同时，接种操作用的蒸馏水、培养皿、剪刀、镊子、刀片、烧杯等在超净工作台上使用的一起用具也必须用牛皮纸包好后放入高压灭菌锅中灭菌，但灭菌时间一般需增加到25-30min，如果与培养基一同灭菌，时间过长会影响培养基的效果，因此，需要分开灭菌。 魔芋软腐病是魔芋种植过程 中流行最普遍 、危害最严重的病害之一 ， 已成为魔芋种植业发展的制约因素。因此，该试验选择魔芋软腐病 为生长过程中调查的主要病害 ， 以确定其抗病性 。 在2年的生产试验中，分别在生长前期 ( 7月 5曰) 、 生长中后期( 9月 7日) 、 收获期( 块茎病斑) 调查软腐病的病情指数 ( 见表 2 ) 。 M5 2生长 前期软 腐病平 均病情指数 2.O 9 ，比C K1平均病情指数低 4 8.9 0 ,， 比 c K2 平均病 情指数低6 8.4 1 ,， 明显低于 CK1和CK2 。 在生长中后期 M52 2年平均病情指数为 5.5 6.且 2年都没有超 过 1 0 ， CK1 2年平均病情指数为 1 6 ( 8 1 ， CK2 2年平均病情指数为 1 9 (8 8 。 根据费甫华等魔芋抗性鉴定评价标准 ， M52病情指数 ?1 0 ， 属抗性品种， C K1 和 C K2 的病情指数均分布在 1 O (1 ~ 3 0 (0 ， 属中抗性品种。 在收获后块茎的病情指数中， M52平均病情指数为7 (8 4 ， CK1为 1 2 (8 6 ， CK 2 为 1 8 (0 8 ， M52平均病情指数分别比CK1和 cK2 低3 9 ( 0 魔芋，又叫鬼芋，属半野生植物，主要分布在长江中下游地区和西南地区，以收获地下块茎为主，含有丰富的氨基酸和微量元素，经过深加工，可开发出多种产品，如营养保健品，医药用品，大众食品，工业原料等，能满足不同市场和消费者的需求。近年来，魔芋食品已越来越引起人们的注意，在欧美和东南亚市场上魔芋及其加工产品被十分看好。我国魔芋品质资源丰富，种植历史悠久，人们在实践中出不少好的栽培管理方法，现介绍如下 一、魔芋的栽培模式 1(单作栽培 魔芋在高山上和两山间等半荫蔽地区可进行单作栽培。在一块地里只种植魔芋。在海拔800米以下的低山和丘陵地区，单作栽培要防止日灼病，叶片像火烫过或火烤过状的白色枯斑，严重时叶片枯萎死亡。因此，平原地区日照强度较高，阳光直射，光照时间长，气温高而不宜种植。在种植时，必须用麦秆或稻草覆盖，防止叶片升温过高过快而引起日灼病。 2(空地栽培 山区有的芋农习惯在房前屋后、林缘溪边、田边隙地种植魔芋，这是一种传统种植方法，有利于充分利用山区的土地资源，提高山区农民的生活。一般可施农家肥点穴，再播种250克,350克重的块茎，然后用土覆盖，加强水肥管理，获得高产。 3(瓜——芋间作栽培 利用瓜架遮蔽，将地深挖，疏松，施肥播种。选用叶小的蔬菜如黄瓜、丝瓜、苦瓜、葫芦等，实行瓜——芋混作或间作，更有利于发展山区多种经济。 4、林果——芋间作栽培 在茶林或果园空地栽植魔芋，既不影响茶树和果树生长，又可获得魔芋丰收，在山区特别值得应用推广。 5(粮——芋间作栽培 利用玉米、大豆或小麦等高秆作物，与魔芋间作套种，既可防止阳光直射而引起的日灼病，又可防止干早，起到保墒遮荫的双重效果。 二、魔芋的高产栽培技术 1(选地和整地 选择肥沃疏松，土层深厚，土壤湿润，排水良好的沙质壤土或腐殖质土。不宜选择土壤瘠薄，土质粘硬，酸性较强的黄泥土。地选 好后，每亩施腐熟农家肥3000千克，磷肥50千克，钾肥或饼肥50千克，然后作宽1米,1.5米，高20厘米,30厘米的厢面，或作成宽1.3米的高畦，开畦沟40厘米宽，四周开好排水沟。 2(种芋选择和消毒 选择适合本地气候、土质条件的优质抗病虫害品种，并进行苗圃育苗。再从苗圃中选0.1千克,0.5千克，顶芽粗壮，无病虫无损伤，形状规整，外表光滑，芽窝浅且平，上端口平的小块茎，整芋或根状茎播种;种子(即果实中的小块茎)须在阴凉处或湿沙中层积储存，根状茎过大时可切断作种，整芋需选1年,2年生，无病，重0.1千克,0.5千克的圆形或长圆形块茎作种。扁圆且顶芽高深的，因茎龄过长而不宜作种。种芋消毒有多种方法。播种前晒1天,2天后，用500倍25,多菌灵浸种2小时,6小时，晒干后播种，可防治软腐病。其误伤面用生石灰或草木灰涂抹。一般以整个种芋下种，若种芋腐烂或有病斑则必须切除，以免感染植株。 3(苗圃地选择 魔芋利用块茎进行无性繁殖，一般每亩苗圃可供应10亩,20亩大田用苗。选择土质疏松，水肥充足，适当荫蔽的田块作苗圃。选定苗圃后，深耕2次，然后开沟，保证排水，并施足农家肥。采用宽窄行下种或平厢育苗。如用宽窄行间植，穴距17厘米，行距33厘米，每穴播种2块,3块。平厢采用厢宽1.33米，厢距50厘米，每厢6行。行距33厘米，穴距17厘米，每亩种1万穴左右。施肥入穴，肥面覆土，土上再播种，种上盖细土。再洒施灶土灰或草木灰，保证供钾。 4(适时播种 魔芋适宜的播种温度为15?，下种时必须主芽和端口向上，取芽鞭的一个节;倾斜下种，芽眼稍倾斜向上，才能使魔芋芽生长时先平穿土层后再破土而出。 5(下种密度 每亩以4000株,5000株为宜，播种沟深10厘米,15厘米。穴播，采取梅花形错开，大小粒种互相穿插或大小种芋分开穴播。顶芽向上，上面覆盖细土3厘米,4厘米，再盖一薄层稻草。 6(苗圃管理 播种后，覆盖一层厚7厘米,10厘米的稻草保湿。7月,8月份视苗情追施稀尿素水溶液或腐熟的人畜粪，切不可用氨水、磷铵、生尿追肥，以免烧苗。用生石灰粉撒蔸头防止白绢病发生。10月份地上部枯萎前，再追一次磷钾肥，用稻草覆盖一层，以利种芋越冬。第2年春播时再挖取繁殖材料移栽。 7(移栽冬季11月或早春3月播种育苗，可于当年秋季移栽。在整好的厢面上按行距40厘米—50厘米，株距25厘米—33厘米开穴条栽，每穴1株，每亩植2000株—2500株。一般4月上旬移栽较好。大种稀植，小种密植，穴距25厘米—33厘米，行距40厘米—59厘米。若沟播时株距23厘米—26厘米，窄行47厘米，宽行53厘米。移栽时，茎要侧放，防止积水烂芽，具体方法与无性繁殖和苗圃管理相同。 8(覆盖和水分管理 魔芋怕旱怕涝，覆盖是魔芋栽培管理的主要措施之一，既可减少土壤板结和病虫害发生，又可保墒增温，促进块茎的生长和膨大。一般采用2种方法:?用杉叶、野草、麦秆、谷草覆盖，以不充分密闭表土层为度。?利用间混套种，同样可防旱遮蔽。结合覆盖或间作，可适当灌水，保持田间湿润，防止烂根。 9(合理施肥 魔芋速生快长，需肥量大，必须科学施肥，才能降低成本，提高产量和经济效益。据分析，块茎N、P、K三要素含量依次为0.16,、0.02,和0.18,。在施肥技术上应做到重施底肥，增施磷钾肥。底肥与追肥的比例大致为3:2，具体视土壤养分含量而定。 10(中耕除草 魔芋根系分布于10厘米的表土层范围内。肉质根和分生的小块茎长在种芋上，一般不宜中耕松土，只在生育期内培土2次—3次。特别是块茎形成期和膨大期培土2次—3次，每次培土10厘米左右，再进行稻草覆盖，效果更好。除草时不用锄头，只用手拔杂草，以防伤害根系，利用化学除草剂草甘磷效果更好。 4 ,、 5 6 ( 6 4 ,， 其抗病性明显好于 2个对照。