酶工程综述

酶工程综述 酶工程 酶工程综述 胰蛋白酶 一 摘要 胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。在生物体 酶工程 内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。 二 胰蛋白酶的简介 胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。 在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。广泛的应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗中新型药物的开发。 牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量为23300，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。中国药品规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。 由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8,8.5左右。pH>9.0不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用;重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。 三 胰蛋白酶的作用 胰蛋白酶为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37? 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如: D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 酶工程 三 胰蛋白酶的制备 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原)沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活)，被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过2,3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到8000,10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。 试剂和器材 1(试剂 (1)pH2.5乙酸酸化水。 (2)2.5mol/L HSO。 24 (3)5 mol/L NaOH。 (4)2 mol/L NaOH。 (5)2mol/L HCl。 (6)0.001M HCl。 (7)硫酸铵。 (8)氯化钙。 (9)0.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液:取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。 (10)0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液(用0.8 mol/L稀释1倍即可); (11)0.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液:取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液，加30ml 0.5 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。 (12)0.05 mol/L pH8.0 Tris,HCl 缓冲液:取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL。 (13)底物溶液的配制:即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris,HCl 缓冲液中加0.34mgBAEE和2.22mg的氯化钙。 2、器材 (1)新鲜或冰冻猪胰脏 (2)食品加工机和高速分散器。 (3)研钵。 (4)大玻璃漏斗。 (5)布氏漏斗。 (6)抽滤瓶。 (7)纱布。 (8)恒温水浴。 (9)紫外分光光度计。 酶工程 (10)秒表。 (11)pH试纸。 操作方法 1(猪胰蛋白酶制备 (1)猪胰蛋白酶原的提取 猪胰脏1.0Kg(新鲜的或杀后立即冷藏的)，除去脂肪和结缔组织后，绞碎。 加入2倍体积预冷的乙酸酸化水(pH2.5)于10,15?搅拌提取24小时，四层纱 布过滤得乳白色滤液，用2.5M HSO调pH至2.5,3.0，放置3,4小时后用24 折迭滤纸过滤得黄色透明滤液(约1.5L)。 加入固体硫酸铵(予先研细)，使溶液达0.75饱和度(每升滤液加492克)放置过 夜后抽滤(挤压干)，得猪胰蛋白酶原粗制品。 (2)胰蛋白酶原激活 向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积(按饼重计)冷的蒸馏水，使滤饼溶 得胰蛋白酶原溶液。将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中(滤饼中解，2-硫酸铵的含量按饼重的四分之一计)，使Ca2+与SO结合后，边加边搅拌均匀，4 边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaC。 l2 用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶(约2-5mg)轻轻搅拌，于室温下活化8,10h，(2,3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释)，测定酶活性增加的情况。 活化完成(比活约3500,4000BAEE单位)后，用2.5M HSO调pH至2.5,243.0，抽滤除去CaSO4沉淀。 (3)胰蛋白酶的分离 将已激活的胰蛋白酶溶液按242g/L加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。 2(滤液按250g/L加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。 (4)胰蛋白酶的结晶 将上述胰蛋白酶滤饼(粗胰蛋白酶)溶解后进行结晶:按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。 用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存 放于冰箱。放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加 入总体积的1/4,1/5 的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。 放置2,5天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收。 (5)胰蛋白酶的重结晶 将第一次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶:用约1倍的0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约1.0,1.5倍体积的pH9.0 的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0(准确)(体积过大，很难结 酶工程 晶)，冰箱放置1,2天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。 2(胰蛋白酶活性的测定 以苯甲酰L—精氨酸乙酯(英文缩写为BAEE)为底物，用紫外吸收法进行测定。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L—精氨酸(英文缩写为BA)。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。 取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25?予热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液(用量一般为10微克结晶的胰蛋白酶)，立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读3,4min。控制DA253/min 在0.05 , 0.100左右为宜。 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率(即初速度)DA253/min。 胰蛋白酶活力单位的定义规定为:以BAEE为底物反应液pH8.0，25?，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定DA253，每分钟使DA253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。 临床应用 在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。广泛的应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗中新型药物的开发。 1、治疗急性胰腺炎(Acute Pancrititis，AP) AP的发病机制与蛋白酶级联反应、血液循环障碍、白细胞过度激活产生的细胞因子和炎症介质有关。AP发病时多种酶在胰腺内过度积累，引起胰腺本身的炎症及缺血性坏死，炎性介质进一步的释放可以导致全身性的炎性反应综合征，严重时导致患者全身器官衰竭而死。UTI可以抑制AP的蛋白酶活性，通过抑制钙离子内流来抑制血管平滑肌的收缩，增加胰腺的血流量，保护血管内皮细胞免受氧自由基等的损伤，防止微血栓形成，改善胰腺的血液循环;能有效地减少炎症介质的释放。 TI在临床上的最早应用就是应用于治疗急性胰腺炎，日本早在20世纪80年代中期做的一系列有效实验了TI治疗急性胰腺炎的有效性和安全性。目前很多临床上应用的胰蛋白酶抑制剂都对AP有显著的疗效。近年，有人采用生长抑素和尿胰蛋白酶抑制剂联合治疗重症胰腺炎起到比单独使用时好的疗效。 2、外科手术中的应用 虽然通过外科手术可以解决很多患者的病痛，但手术尤其是大型的手术后，机体处于一种非生理状态，物质代谢亢进，免疫力下降，同时伴有缺血、缺氧和各种酶、炎性介质、自由基的释放，经常会导致术后器官功能衰竭的发生。近年来，大量的临床研究表明乌司他丁(尿胰蛋白酶抑制剂)可抑制术后机体的过度应激反应，抑制蛋白分解亢进，调节机体炎症介质和体液因子的水平，通过改善微循环和稳定溶酶体膜对肾小球、肾小管功能起保护作用，减少术后并发症。目前，日本在手术后已经广泛使用乌司他丁以预防手术后器官功能衰竭(尤其是肾与肺)和再灌注损伤。 3、防治脑水肿 在临床上，脑水肿、脑缺血、蛛网膜下腔 出血后的脑血管痉挛等的治疗都是难题。目前治疗脑水肿的主要药物是甘露醇和激素，两者都有 酶工程 明显的副作用，前者引起心、肾损害，后者引起消化道痉挛。日本学者先后研究发现，UTI和抑肽酶及SBTI可以显著降低实验大鼠的脑含水量。1993年，神谷提出TI的详细作用机制假设:在脑缺血时，血液及脑组织中缓肽酶(bradykinin，BK)水平提高，激活磷脂酶A 2 (phosˉpholipase A2)，加速花生四烯酸(arachidonic acid，AA)释放，从而加重脑水肿，有些TI如抑肽酶、SBTI通过抑制BK的生成，从而起到改善脑水肿的作用在实验中给大鼠颈内动脉注射BK或狗脑室灌注BK可以诱发脑水肿，脑水肿程度与脑组织BK水平呈正相关，为此假设提供了证据。 4、抑制肿瘤细胞的侵袭和转移 大多数肿瘤患者死亡的主要原因是恶性肿瘤的侵袭和转移。肿瘤的侵袭和转移机制较复杂，是一个多环节、多步骤的过程，涉及细胞与细胞间，细胞与基质间的作用，以及多种基因改变等过程，其中肿瘤细胞穿透细胞外机制尤其重要。肿瘤细胞对基底膜浸润的三个步骤是:粘附、溶解和转移。其中，溶解主要的原因是肿瘤细胞下方的基底膜被蛋白酶降解。利用可降解细胞外基质的蛋白酶抑制剂来抑制肿瘤的侵袭和转移已经引起人们极大的兴趣，其中胰蛋白酶抑制剂倍受瞩目。研究证明，在人体很多肿瘤细胞上都有TI的受体TI与受体的结合能够调节蛋白酶的活性，抑制它对基底膜的浸润，阻断肿瘤细胞的转移。Kobayashi等制备了小鼠Lewis肺癌模型，用UTI(尿胰蛋白酶抑制剂)进行抗肿瘤治疗。发现UTI对原位癌的作用不明显，但可以有效抑制肿瘤细胞的转移。尿胰蛋白酶抑制剂和牛肺胰蛋白酶抑制剂小鼠Lewis肺癌的转移有明显的抑制作用。 虽然蛋白酶抑制剂作为新一代的抗肿瘤药物，目前还处于临床试验阶段，并且还存在许多尚未解决的问题，但是由于其针对特殊的作用靶点，尤其是其较小的药物毒性和联合用药潜能，使其具有巨大的抗肿瘤潜力。 5、在妇产科方面的应用 TI在妇产科方面的应用主要体现在预防早产和治疗不孕两个方面。 早产约占所有分娩数的5%,15%。早产是围产儿死亡的重要原因之一，75%以上的围产儿死亡与早产有关。约有1/4的存活早产儿会遗留智力障碍或神经系统后遗症。因此，防治早产是降低围产儿死亡率和患病率的关键。分娩前羊水中的胰蛋白酶浓度升高，激活某些蛋白水解酶如α-糜蛋白酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶等，降低胎膜稳固性，软化宫颈。动物实验证实胰蛋白酶抑制剂可阻止早产的胎膜、宫颈在形态、功能上的变化，同时降低羊水及血浆中IL-1、IL-6、TNF-α的浓度。 Kabayashi实验室检测妊娠羊水中的UTI水平，发现15,20周UTI浓度为1(5?0(22mol/L，30,35周为1(2?0(18mol/L，37,45周为0(58?0(24mol/L，分娩前后为0(10?0(03mol/L ;可见UTI的浓度与正常妊娠的宫缩情况成反向关系，有利于正常的妊娠和分娩。Matsuda等通过对43例早产孕妇的观察，发现UTI可以有效延长孕期，降低新生儿的死亡率。 研究认为，早产的主要原因是感染了革兰阴性杆菌，引起绒毛膜羊膜炎。UTI预防早产的作用机制可能是:通过抑制中性粒细胞弹力蛋白酶(PMNE)和IL-1、IL-8等多种细胞因子发挥其作用。Akutsu发现中性粒细胞弹力蛋白酶水平与UTI的比值是评定破膜时间的可靠指标。 Sato等用基因技术得到UTI缺乏的小鼠，发现这种小鼠的卵母细胞无法正常成熟和排出，而且其卵母细胞丘排列紊乱，若是将其卵巢移植到正常的野生小鼠的体内，发现其功能完全恢复正常。由此证明了UTI是形成稳定的卵母细胞 酶工程 丘复合体的一个重要的因素。而稳定的卵母细胞丘复合体的形成是卵母细胞成熟和排卵所必需的。 6、抗休克 动物实验表明:存在于人尿中的胰蛋白酶抑制剂乌司他丁有改善循环障碍与代谢异常，抑制内源性休克因子(如心肌抑制因子)，以及增强内源性休克因子的作用。在休克常规治疗的基础上加用乌司他丁，可改善休克时的循环情况，抑制休克的恶性循环，减少器官功能衰竭的发生，为休克的治疗提供有利的支持。 7、其他方面的应用 除了上述方面，TI在减轻肺损伤，治疗肺气肿，治疗肺曲菌病;缓解ARDS病人呼衰;抗关节炎、皮肤疾患等方面都有基础和临床研究报道。最新研究还发现在移植胰岛过程中，TI可以抑制各种丝氨酸的活性，提高移植成功率。这些方面的应用还有待于更大规模的临床研究。