雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中的
达
雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁
淤积孕鼠胎鼠肝脏中的表达 2011年
第32卷
4月
第2期
首都医科大学
JournalofCapitalMedicalUniversity Apr.2011
Vo1.32No.2
[doi:10.3969/j.issn.1006-7795.2011.02.021]?临床研究?
雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中 的表达
时青云赵晋林宇庚闰时.周新林颖奇.
(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院妇产科;2.首都医科大学附属北京友谊医院妇产科;3.四川大学华西临床医学院)
【摘要】目的探讨雌激素受体(estrogenreceptor,ERa)与胆汁酸代谢相关基因胆固醇7羟化酶(cholesterol7-hydroxylase, CYPTA1),胆固醇27羟化酶(cholesterol27-hydroxylase,CYP27A1),胆固醇12a羟化酶(cholesterol12a—hydroxylase,CYP8B1)mRNA 在妊娠期肝内胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中的表达及其意义.方法将60只清洁级sD孕鼠自孕第13天均分为2组:对照组孕鼠皮
下注射精制植物油2.0mL?,?d,;研究组孕鼠皮下注射17一ot一乙炔雌二醇1.25mg?kg,?d,.2组孕鼠分别于妊娠第13,
l7,21天断尾采母鼠血2mL
血清生物化学指标,于妊娠第21天处死.抽取母鼠,胎鼠血并提取母鼠,胎鼠肝脏组织.应用酶
联免疫吸附试验检测2组孕鼠以及胎鼠血清中胆酸浓度;应用实时定量PCR技术
检测各组胎鼠肝脏ERa,CYP7A1,CYP27A1,
CYP8B1的mRNA表达量.结果?胆酸指标比较:在妊娠第17天时对照组,研究组
母鼠胆汁酸浓度分别为(24.6?1.3)I~mol/L,
(58.7?3.2)p~mo]/L,研究组母鼠胆汁酸浓度明显高于对照组(t=2.462,P<0.05);
在妊娠第21天时对照组,研究组母鼠胆汁酸浓
度分别为(26.5?3.1)~xmol/L,(66.4?2.7)~mol/L,研究组母鼠胆汁酸浓度与妊娠第
17天时研究组以及对照组相比(F=5.43,
P<0.05),差异有统计学意义.?胎鼠肝脏
CYPTA1mRNA,CYP27A1mRNA,CYP8B1mRNA表达:研究组中CYP7A1mRNA
(1.25?0.01),CYP27A1mRNA(2.05?0.03),CYP8B1mRNA明显高于对照组(0.35?
0.02,0.75?0.03,0.85?0.02),P值均<
0.05,差异有统计学意义.?胎鼠肝脏雌激素受体的表达:研究组中ERdmRNA(0.75
?0.02)明显高于对照组ERamRNA
(0.45?0.01).结论妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepaticcholestasisofpregnancy,ICP)孕鼠胎鼠肝细胞ER,CYP7A1,CYP27A1,
CYP8B1的表达升高,胆汁酸的合成与代谢调节机制存在障碍,可能是导致ICP胎
儿围生期死亡发生的原因之一.
【关键词】胆汁淤积;肝脏;胎鼠;雌激素受体;胆固醇7羟化酶;胆固醇12仪羟化酶
【中图分类号】R714.147
ExpressionofEstrogenReceptormRNAandGenesRelatedtoRegulationofBile acidMetabolisminFetalRatLiverofPregnantRatswithIntrahepaticCholestasis SHIQing—yun,ZHAOJin,LINYun.geng,YANShi,ZHOUXin,LINYing.qi
(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,BeijingShiJiTanHospital,CapitalMedicalUniversity;2.DepartmentofObstetricsand
Gynecology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity;3.WestChinaMedicalSchool,SichuanUniversity)
【ABSTRACT】
ObjectiveTostudytheexpressionofestrogenreceptor(ER)andgenerelatedtoregulationofbileacidmetabolismin
fetalratliverofpregnantratswithintrahepaticcholestasis.MethodsSixtycleanSDpregnantr
atswereselectedanddividedintotwo
groupsatrandom.?
Sincethe13thdayofpregnancyaftertakingblood,theratsincontrolgroupwereinjectedsubcu
taneouslywith
refinedvegetableoil2.5mL?kg一?d
一,studygroupwasinjectedsubcutaneouslywiththe17一仅一
ethynylestradiol(EE)1.25mg?kg一
?
dtil1the17thday.?
Onthe21day,allratswerekilled.Thenthefetusliverswerecollectedforstudy.?
Thelevelsofserum
totalbileacid(TBA)wereexaminedbyELISA.TheexpressionofER,CYPTA1,CYP27A1,
CYP8B1(mRNA)infetalratliverwas
examinedbyreal-timePCR.Results?
ThelevelsofTBAweresignificantlyhigherinstudygroupmotherrats(58.7?3.2)ixmoL/L
thanthatofcontrolgroup(24.64-1.3)p~mol/Lonthe17day(P<0.05);ThelevelsofTBAwe
rehigherinstudygroupmotherrats
(66.4?
2.7)b~molfLthanthatofcontrolgroup(26.54-3.1)p~mol/Lonthe21day(P<0.05).Thelev
elsofTBAwerehigherinstudy
groupfetusrats(28.4?2.6)p~moVLthanthatofcontrolgroup(10.5?
3.1)Ixmol/Lonthe21day.?TheexpressionofCYP"/A1
mRNA(1.25?0.01),CYP27A1mRNA(2.05?0.03),CYP8B1mRNA(1.85?
0.01)instudygroupfetus1iverincreasedas
comparedtocontrolgroup(0.35?0.02,0.754-0.03,0.85?
0.02,respectively)(P<0.05).3)TheexpressionofERamRNAin studygroup(0.75?0.02)washigherthanthatofcontrolgroup(0.45?
0.01)(P<0.05).ConclusionTheexpressionofERa, 基金项目:国家自然科学基金(30872779)资助项
目,SupposedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(30872779)
Correspondingauthor.E-mail:shiqingyunl@163.con 第2期时青云等:雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中
的表达273
CYP7A1,CYF27A1,CYP8B1(mRNA)increasedinthefetalratliverofpregnantratswithint
rahepaticcholestasis.resultinginincreased synthesisofbileacids,whichmaybeoneofthemechanismsofperinataldeathofthefetalrats.
【KEYWORDS】cholestasis;liver;pregnantrat;estrogenreceptor;cholesterol7
仪.hydroxylase:cholesterol12cx—hydroxylase
妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepaticcholestasisof pregnancy,ICP)患者的重要特征为其体内胆汁酸浓度高.
围生儿病死率22.5%o,是同期总的围生儿病死率6%o一
8%o的3倍,其中死胎占56%.ICP患者胆汁酸浓度变化
与围生(产)儿不良妊娠结局密切相关_lJ.为进一步了
解围生儿不良结局的原因,本研究应用实时定量PCR测
定雌激素受体(estrogenreceptor,ERa)及胆固醇7o【羟
化酶(cholesterol7仅.hydroxylase,CYP7A1),胆固醇27
羟化酶(cholesterol27一hydroxylase,CYP27A1),胆固醇
l2羟化酶(cholesterol12or.hydroxylase,CYP8B1)在妊娠
肝内胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中的表达.
1材料和方法
1.1实验动物与分组
所有动物由首都医科大学实验动物部(动物
证号:22081)提供.选择清洁级SD雌性大鼠60只,体
质量300,450g,年龄150,180d,在室温18,25?,
相对湿度60%,70%的屏障系统内饲养,不控制饲料
和饮水.在发情期与雄性大鼠同笼饲养,每天观察阴
,妊娠后 道栓脱落情况,阴道栓脱落日定为妊娠第1天
的大鼠每隔3d称体质量1次,一直饲养到妊娠第13
天待用.应用随机数字表法将SD孕鼠随机分为2组, 每组30只.对照组自孕13d起每天孕鼠皮下注射精 制植物油2.0mL?kg,?d,;研究组自孕13d起每天 孕鼠皮下注射17一Or.一乙炔雌二醇1.25mg?kg,. 1.2动物模型的建立
SD孕鼠自妊娠第13天开始分别在后肢内侧皮 下注射17—0【一乙炔雌二醇溶液(均购自美国Sigma公 司)或精制植物油溶液,连续5d至孕18d.2组孕鼠 均于用药前(妊娠13d),妊娠第l7天,妊娠第21天 断尾采血2mL,测定血生物化学指标.2组孕鼠均于 妊娠第21天,采血后颈部脱臼法处死母鼠,取母鼠肝 脏进行病理组织学检查.肝脏组织学检查见毛细胆 管内有胆汁淤积,部分肝细胞有空泡样变性,但无肝 细胞坏死,血清总胆酸,转氨酶升高为模型成功. 1.3主要仪器与试剂
TRIzol试剂盒及反转录试剂盒(购自美国Sigma 公司).实时荧光定量PCR试剂盒(购自美国ABI公 司).从GeneBank获得研究基因的全cDNA序列,以 磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphacedehy— drogenase,GAPDH)作为内参照.引物及探针(购自美 国ABI公司),参照PrimerExpress3.0软件,序列由 上海英俊生物科技有限公司合成,见表1.探针5端 标记荧光发光基团6一羧基荧光素,3端标记荧光淬灭 基团6一羧基四甲基若丹明.本研究采用ABI7300实 时定量PCR检测仪(购自美国ABI公司)检测. 表1实时相对定量PCR所用的引物和探针 Tab.1Primerandprobeinreal-timePCR
Primernamemersequ…k翟一
ERa:estrogenreceptor;CYP7A1:cholesterol7d-hydroxylase:CYP27A1:cholesterol27
一hydmxylase
CYP8BI:cholesterol12d-hydmxylase:GAPDH:glyeeraldehyde-3-phosphacedehydroge
nase.
1.4标本采集和处理
处死母鼠后,立即取出胎鼠肝脏组织,取一部分 用于病理检查确定模型;其余部分取肝脏组织约 2cm×2cm大小,用锡纸包裹后,放入编号的冻存管 274首都医科大学第32卷
中,立即置于液氮中保存待测.
1.5实验方法
总RNA提取与cDNA的合成:将标本组织用二 乙基焦碳酸酯冲洗后,加入1mLTRIzol试剂,按说明 书中操作步骤提取RNA,紫外分光光度计(购白美国 Bio.Rad公司)进行浓度测定,确定获得的RNA纯度 及浓度,同一样本测定3次取其均值.操作按说明书 合成cDNA,合成的cDNA置于一20?保存备用. 1.6实时定量PCR
本实验采用实时相对定量PCR方法.反应体系 25L,包括PCR反应液混合物:PCRmastermix12.5
L,cDNA1L,上,下游引物各0.5L,探针0.5L, 用二乙基焦碳酸酯水补足.反应条件:50oC,2rain;
95?,10min;95,1min;60?,1min40个循环. 反应完毕后,将扩增的每份PCR产物同时进行琼脂 糖凝胶电泳分析是否为特异性产物.实时定量PCR 过程中每个样本重复3次,取平均值.
根据各自
品建立的标准曲线,由软件自动计 算出样本中目的基因的相对mRNA含量.为了减少 差异,以目的基因mRNA相对含量和内参照基因 GAPDHmRNA相对含量的比值作为评价表达的
标准.
较用Student.Newwman.Keuls法检验,2组数据问比较 采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.12组孕鼠血胆汁酸浓度的比较
在妊娠第l3天(用药前),对照组,研究组母鼠胆
汁酸水平分别为(22.4?2.1)txmol/L,(21.3?1.9) I~moYL,2组相比差异无统计学意义(t=1.682,P= 0.1).在妊娠第17天时对照组,研究组母鼠胆汁酸
浓度分别为(24.6?1.3)I,zmol/L,(58.7?3.2)txmol/ L,研究组母鼠胆汁酸水平明显高于对照组,差异有统 计学意义(2.462,P=0.02);在妊娠第21天时对
照组,研究组母鼠胆汁酸浓度分别为(26.5?3.1) I,zmoL/L,(66.4?2.7)~mol/L,研究组母鼠胆汁酸浓
度与妊娠第17天时研究组以及对照组相比,差异有 统计学意义(F=5.43,P=0.000). 2.22组胎鼠肝脏组织中ER,CYP7A1,CYP27A1 及CYP8B1mRNA表达的比较
研究组中ERamRNA(0.75?0.02)明显高于对
照组ERmRNA(0.45?0.01),差异有统计学意义
(P<0.05),研究组中CYP7A1mRNA(1.25?0.01), CYP27A1mRNA(2.05?0.03),CYP8B1mRNA 1.7统计学方法(1.85?0.01)与对照组(0.35?0.02,0.75?0.03, 应用SPSS12.0软件,数据以均数?标准差(面?0.85?0.02)相比,差异有统计学意
义(P值分别为
S)表示,多组问的比较用方差分析,多组的两两间比4.42,4.31,5.41,P值均<0.05),
详见表2.
表2各组孕鼠肝脏CYP7A1mRNA,FXRmRNA,PPAR~,CYP27A1mRNA及 CYP8BlmRNA表达的比较
3讨论
Tab.2ComparisonofexpressionlevelsofCYP7A1mRNA,FXRmRNA,PPARoL,
CYP27A1mRNA,CYP8BlmRNAintheliverofthe2groupsofrats(?5) ERc~:estrogenreceptor;CYP7A1:cholesterol7-hydroxylase;CYP27A1:cholesterol27
一hydroxylase
CYP8B1:cholesterol12cL—hydroxylase. 大量的研究证实妊娠肝内胆汁淤积症患者血 清中胆汁酸浓度较正常孕妇显着升高.我们前期的 研究结果也是如此.潴留的胆汁酸可通过细胞毒作 用影响胎儿,导致胎儿缺氧,窒息甚至死亡.
我们前期的研究发现,肝内胆汁淤积孕鼠的雌 激素浓度升高,在雌激素的作用下,肝内胆汁淤积孕 鼠的肝脏ER表达增强,同时证明了肝细胞ER的变 化与孕鼠肝内胆汁淤积的发生有关.
胆汁酸在肝脏由胆固醇转变生成.正常情况下, 胆汁酸的合成,转运,代谢受到严格控制,主要是一些 反馈和负反馈机制自动调整的过程.一般认为胆汁 酸合成有2条主要途径:一是经典途径,由胆固醇7 羟化酶(CYP7A1)为限速酶催化,这一过程受到胆汁 酸的负反馈调节;另一条途径是胆固醇27羟化酶 (CYP27A1)催化的替代途径,该途径仅占人体总胆汁 酸合成的18%,并不受到胆汁酸的反馈抑制作用.胆 第2期时青云等:雌激素受体及胆汁酸代谢相关基因在胆汁淤积孕鼠胎鼠肝脏中
的表达275
汁酸激活法尼醇x受体后,主要通过调节CYP7A1, CYP27A1,胆固醇12ol羟化酶(CYP8B1)的基因表达, 来实现胆汁酸对其自身的反馈调节J.CYP8B1催化 胆酸生成鹅去氧胆酸,增加胆汁酸池的亲水性. CYP7A1,CYP27A1的异常表达可促进鹅去氧胆酸的
合成,鹅去氧胆酸继续羟化形成高毒性的胆酸J. 以上是对母鼠的胆汁酸浓度以及肝脏胆汁酸代 谢基因进行了研究,为进一步了解母鼠高胆汁酸浓度 是否会影响到胎儿鼠胆汁酸浓度以及肝脏胆汁酸代 谢基因的变化,我们进行了本研究.
本研究结果发现ICP组(研究组)母鼠胆汁酸浓 度升高,胎鼠胆汁酸浓度同样升高.表明母鼠胆汁酸 浓度的异常,同样导致了胎鼠胆汁酸浓度的改变,其 原因可能是母鼠雌激素浓度的升高影响了胎鼠胆汁 酸浓度的改变.本研究测定胎鼠肝脏雌激素受体的 变化,研究显示ICP组(研究组)中ERamRNA表达 明显高于对照组,表明胎鼠肝脏雌激素受体表达同 样发生改变.为了进一步了解胎鼠胆汁酸浓度的变 化,我们研究了胎鼠胆汁酸代谢相关基因的表达,研 究表明:ICP组(研究组)中CYP7A1mRNA,CYP27A1
mRNA,CYP8B1mRNA明显高于对照组(P<0.05).
表明胎鼠胆汁酸代谢以及自身的调节发生改变.研 究表明雌激素受体参与了雌激素介导的脱氢表雄 酮(dehydroepindrosterone,DHEA)在细胞水平的调控, DHEA在胎儿生长发育中对于维持激素水平的均衡 非常关键.本研究的结果表明由于胎鼠受到母鼠高 雌激素浓度的影响,肝脏雌激素受体发生变化,可能 会导致DHEA调控的异常,进而影响胎儿的生长发 育,同时胎鼠胆汁酸代谢基因CYP7A1mRNA, CYP27A1mRNA,CYP8B1mRNA浓度变化导致胎鼠 胆汁酸浓度的升高,而高毒性的胆汁酸与胎儿的不良 结局有关.可能是导致ICP胎儿围生期死亡发生的 原因之一,因此,临床上应积极治疗母体的高胆汁酸 浓度,降低围生儿的病死率.
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(收稿日期:2010—10—13)
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