【doc】海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗
海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗 2f/一z/叶,
植物1994,36(增刊)211--214
ActaBotanicaSiniea
4}
海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗
K+一ATPase活性和TTC还原的影
裴炎墅堑叠/王瑜宁
(西南农业大学,重庆630716>
关键词海藻糖一绿豆;ATP酶;冷冻}冷冻干燥
,—一一——,
结.
Mg抖,
响
夏玉先22,
EFFECTSOFTREHALOSEONMg抖.K一
.l
ANDTTCREDUCTIoNINFRoZENANDFREEZEDRIED SEEDL?GSoFMUNGBEAN
PeiYan.DengRu-Fu,WangYu—ningandXiaYu—xian
tsh?Agricult~a[Us4Chongqing630716) Abstract
MungBean(Pkaseolusaureus)seedlinkstreatedwithtrehalosewerefrozenandfreeze— dried.MgK一ATPaseactivitiesfromthepurifiedprotoplasmicmembranesandthetetra-
zolium(TTC)reductionfromthefreeze—driedseedlingswereinvestigated.Thefreeze-dried
seedlingstreatedwithtrehaloseshowedhigherenzymeactivitiesthanthoseofthecontro1.
Astheconcentrationoftrehaloseincreased,Mg?,K一ATPaseactivitiesandtheTTCre_
ductionwereincreasedtoo.At,30C.theMg,K一ATPaseactivitiesinfrozenseedlings
wereabouttwicehigherthanthoseofthecontro1.TheresultsindicatedthattrehalOSeisa
goodprotectantforthefrozenorfreeze—driedplantmaterials. KeywordsTrehaloze:Mungbean:ATPase:Freeze;Freeze—drying 海藻糖对稳定生物膜的结构与功能,提高生物对低温,脱水或盐碱等逆境因子的抗性
有特殊的作用.但前人的研究多以微生物,藻类和动物为对象,有关海藻糖对高等植
收稿日期t1993—05—03接受日期;19930728
*国家自然科学基盘资助课题.
镁
植物36卷
物保护作用的报道较少.本文研究在低温和脱水条件下,海藻糖对绿豆幼苗Mg",K ATP酶的保护作用和对其生活力的影响.
材料和方法
(一)绿豆幼苗的培养
绿豆(Plua~eolud")种子用0.1HgC1灭菌10rain无菌水冲洗后在灭菌珍珠岩 上发芽.取均匀一致的幼苗备用.
(二)低温处理
将绿豆幼苗予叶节以下部分(2cm左右)放人海藻糖溶液中,从5,1o,20到 40糖溶液.由低浓度到高浓度逐次转移,在每个浓度中停留15rain,然后将材料置0.,
一
10.,一20.和30下冷冻24h.
(三)低温干燥处理
将经上述方法处理后的绿豆抽苗子叶节下部分放人真空干燥器中,以P.os为干燥 剂,抽气速度约60I.?rain,.真空度抽至15mmHg左右,立即将真空干燥器阀门关
闭,
置一10C下处理24h.上述处理均以未经海藻糖处理的为对照.
(四)细胞质膜的纯化
主要参照Itellergren等"的方法进行.匀浆液为0.25mol/L山梨酵,5mmol/LMg- SO,1mmol/LEDTA—Na2,2Ommol/ITrisHCIpH7.2两相分离系统为DextranTS00 (Pharmacia产):PEG4000(日本产品)一6.3:6.3(w/w).以上相液u为提纯的质 膜组分,置一20c下保存.
(五)Mg,KATPase活性测定
参照Hodges等的方法稍加修改取5O.经稀释后的质膜组分液,加入1mL ATPase活性测定液(3mmol/IATP30millol/LKC1,5mmol/LMgC12,40mtool/LTris— HCI,pH6.5).35?下反应30rain,加1mL20的三氯乙酸溶液中止反应,然后加1mL 2.5钼酸铵溶液(含1的抗坏血酸),35?保温40rain,640nm比色,测定反应液中的 无机磷含量.
(六)TTC还原的擦4定
经低温脱水处理后的绿豆幼苗材料1O株,放入15mm×150ifflm平底试管中,加3 mL0.2的氯化三苯四氮唑(2,3,5triphenyltetrazoliumchloride,TTC,用50mmol/L 磷酸缓冲液pH7.5配制),黑暗下30?保温4h,蒸馏水冲洗后用滤纸吸干,加8mL乙酸
乙酯研磨.残渣再加8mL乙酸乙酯冲洗,合并两次乙酸乙酯抽提液,定溶至2OmL,530
nm处比色,每处理设3个重复.
(七)蛋白质的测定
按Lowry等一的方法进行.
结果和
(一)海藻糖对冷冻处理后的绿豆幼苗细胞质膜Mg",K一ATPase活性的影响 经40海藻糖处理后的绿豆幼苗子叶节以下部分置于0.一10.--20.和--30.下冷
增刊裴炎等:海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗Mg,KATPase活性和TTc还原的影响213
冻24h,再分别纯化细胞质膜,测定质膜组分液中的Mg,K—ATPase活性(表1).从表 中可以看出.经海藻糖处理后.质膜上的MgK一ATPase活性均显着高于对照.一20C
处理时,对照和海藻糖处理的酶活性均比对应0c和一1O?处理的活性高.但一30C处理
时,酶活性均明显降低.这一结果和Hellergren等-9]的结果相近.一3OC处理后,经海藻糖
处理后的酶活性比对照高1.1倍左右,说明海藻糖有提高细胞膜对低温的抗性,具保护低
温冷冻条件下的质膜及膜上蛋白的作用.
表1低温处理后绿豆质膜Mg",K一一ATPase活性变化
Table1ActivityofMg,K—ATPasefrompurifiedplasmamembranesofmungbean
seedlingsfrozenatdifferenttempertures(UnitofATPaseactivity:ntoolpi/mgprotein?rain)
处理温度Temperature(C)
Trtm一
2O30
对照
Cont?【Z7744653.815.2
40海藻糖
40tt-ehaIo搴e464532645325
(--)海藻糖对冷冻干燥处理后的绿豆幼苗细胞质膜Mg,K十_ATPase活性的影响 绿豆幼苗子叶节下部分经海藻糖处理后,真空干燥并置于一10C下冷冻24h,然 后分别纯化各处理的细胞质膜,测定Mg",K一ATPase活性.从表2中可看出,低温干
燥后,不同海藻糖浓度处理的酶活性均明显高于对照.并且,随着糖液浓度的增加酶活性
也相应提高.当海藻糖浓度超过20后,酶活性提高的幅度减小.经4o海藻糖处理,冷
冻干燥后的绿豆幼苗其Mg,K—ATPase活性显着低于对应只进行冷冻处理的.但
与对
照相比,降低的幅度比较小.
表2海藻糖对冷冻干燥及冷冻处理的绿豆幼苗质晨Mg2,K-ATPase活性的彰响 Table2Effects0ftrehaloseontheactivitiesofMg".K一ATPaseinprotoplasm[cmembraneof freeze-driedandfrozenmungbeanseedlingsunder—l0?
处理一10C下冷冻干燥一10C冷陈
Tatt-oefttFreezedryingunder一10CF—under一10C
海藻糖淮度
CorJ~ntrationoftreIlarose()152040 一
酶活
bnmeactmty39.545.648.2463
(nmolpi/mgprotein?min)
(--)海藻糖对低温干燥处理的绿豆幼苗ITC还原力的影响
用不同浓度的海藻糖处理绿豆幼苗子叶节以下部分,然后在一IO'C下真空脱水千燥,
24h后测定各处理的TTC还原力.以对照为100计算相对还原力.从表3可见,随着海
藻糖浓度的增加,幼苗的TTC还原力迅速提高,10的海藻糖处理,其TTc还原力是对
照的24倍左右.糖液浓度超过10后,TTC还原力增加速度减慢.TTC还原力广泛用于
植物细胞生活力的测定.表明海藻糖可明显提高低温干燥处理后的绿豆幼苗的生活力.
植物36卷
表3不同海藻糖浓度处理后冻干绿豆幼苗的TIC相对还原力
Table3TTCrelativereductionpower.ffreeze—driedmungbeanseedhng treate3Tlthdifferenttrehalo~econcentrations
海藻糖滩度TreMlv~seconeentrarian() 1551O
TTC相对还原力--
TTCrelative1802
483们241325132661
power()_
1)对照的OD铷=O023为l0OThex'alueofOD53=0083inthecontrolaslO0
讨论
Crowe等.认为,在冷冻干燥条件下,海藻糖对膜的ATPase活性和钙的转移功能 具有保护作用.Bhanda!等的实验结果表明.海藻糖是一种无毒而有效的抗冻保护剂.海
藻糖的抗冻机理主要是防止膜脱水破坏.MgK一ATPase是细胞质膜上的跨膜蛋白.
Hellergren等认为冻害的原初作用位点很可能是质膜上的Mg,KtATPase.我们的试 验结果表明,海藻糖对冷冻和冷冻干燥后绿豆幼苗的Mg,K一ATPase有明显保护作
用,使冻干后的材料保持较高的活力,说明海藻糖是一种很有前途的抗冻抗脱水保护剂.
在卒试验中,一20"C下冷冻,膜上Mg,K~-ATPase活性高于0?和,10?的处理这一
现象也在Hellergren等的试验中出现.Hellergren等认为可能的原因之一是较高温度下非
离子激活的ATPase活性较高,导致本底增高带来的干扰.
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苗1990.1O8—113