三种信号传导通路在心肌营养素-1致心肌细胞肥大中的作用
三种信号传导通路在心肌营养素-1致心肌
细胞肥大中的作用
第26卷第1期北科人:报VoI.26No?I
2005年7月J()L'ItN,,I()FHEBEIMEI)ICA1UNIVERSITYJLlly2o()5'2l5'
?
论着?
三种信号传导通路在心肌营养素一l致
心肌细胞肥大中的作用
孙光洁'.田泽君?.崔炜,李拥军.郝玉明,都军
(河J匕医科大学第?I医院心内科.河北家庀050000
【摘要】目的观察一种rgl}l30游的信号传导通路.即JAK信号传导和转录激q-子:;(s1fIl
transdUCeFandactivatoroftranscription3.JAKSTArr3)通路细胞外号i恬l激12'extr.llularsignal
reguIatedkinases1,2,ERK}|)通路和磷脂酰肌酚:{激酶(t}hosphatidylinosito]:{kinas.II3K)通路,n:心肌营养系
l(cardiotrophin1,【一r?1)致心H儿细胞肥大lIj的fi-用.方法STAT3和II3K的活通过wcst?]Blot
测定:
ERKl2的活性分别通过Westri1l~Iot分析和凝胶内激酶检测法删定:心肌细胞肥人通过H庇氟酸(H
Ieucin{.H1Jcu)掺入和细胞『7J蛋门匝-jI)NA比(proteinloI)Aratio,It():I)NA)测定.结果【'T1大鼠心
肌细胞il1分别诱导j'TAT3.卜=RK17和PIK的磷酸化,许他I{lIell掺人ffl和Pro:I)NA均增fJIlTAT抑制
剂panhenolide他(I,1昕敛3I{lll掺入值和Pro:1)N\分别受刮抑制:ERlg1【游激酶抑制制U0l?6他
STAT3酪氧酸磷酸化水平剂}俄帧增』ju.川时.使【'Tl所致I{Letl掺入值阳Iro:I)A
分刖增加I7.6
和l6.3,0q/;P13K抑制制WOrlnlanilii1对r_1所致,HILI掺入值和Pro:I)NA尤影响结论rI敛心肌细胞吧
大的作用主要通过TAr3通路.I)13K通路未参'j这一f1-用.ERKI2通路通过抑制S.r,3酪瓴磷酸化仃l渊
节这一作J}{.I述TAT3jEItKl2之『日】的相}J作用可能f助于I,L产生遁的心IlfL吧.
【主题词】心肌痫,肥大性:I他递:心肌;细胞
【中图分类号】Q91.9【文献标识码】A【文章编号】l()()32o5t2(}05)01021(1 CoNTRlBUTIONSOFTHETHREESlGNALlNGPATHWAYSTOCARDIOMYOCYT
E
\
HYPERTRoPHYlNDUCEDBYCARDloTRoPHlN—l
SUN(}uang—jie,TIANZe—jUn,L,UIWei,I.1Yong—jun,HA()Yu—ruing,I)UJUn tDepartmentof('ardiolog-t/leondftospiml【IflleheiMP(1{ttIiUniversi/3,.【}/ia:lllt?l05000().ina,
ABSTRACT:0bjectiveToassesthecontributionsofthethreesignalingpathways,signal
transducerandactivatoroftranscriplion3(JAK—STAT3)pathway.extracellularsignal—regulated
kinasesl/2(ERK1,2)pathwayandphosI)hatidy?nositol3-kinase(PI3一K)pathway,tothc cardiomyocytehypertro1)hyinducedbycardiotro1)hin一1(【,T一1).MethodsActivitiesofSTArr3
andPI3一Kweredeterminedt)yWestern1)lotanalysis.AelivitYofEIK1一ow:-ls(tetcrnlinedt)y
Westernhlotanalysisandin—gelkinaseassayrespectively. Cardiom?rocytehypertro1)hywas
evaluatedby_IH—leucine(HI1)incor1)orationandeellL】lfIrprotein一")一I)NAratio(Pro:
DNA).ResultsC"i,一1acli,atedthephosphorylationofSTAI,3ERKl2andPI3一K
simuhaneouslyinratcardiomyocytes.Parthenolide,anSTATinhiI)itor.reversedthein(,reas
e()f
[收稿日期]20050321;修I川日期]2005(1(?0l
L基金项日]河北省博1研究基金(No.B20(1I101)和河北,肯科
学与技术研究汁划项口(No.01276183I)和002761}(jI)) [作者简介]孙光沽(1968).女.天津人.人津大学
科学与1程学院I稃帅 药学学士,从事分子生物:及生物医学I程研究
*天津大学材料科jI:程学院高分了系,火津3()0072
?通讯作者.电子邮件tianzeJ@yaboo.con1.?
?
246?河北医科大学第26卷第4期
both.H—LeuincorporationandPro:DNAinducedbyCT一1.U0126,aninhibitorofthekinases upstreamofERK1/2,increasedthetyrosinephosphory1ationofSTAT3inducedbyCT一1ina
dose—dependentmannerand,consistently,augmentedCT一1一inducedthe.H—Leuincorporationby
17.6%andthePro:DNAby16.3.Wortmannin,aPI3一Kinhibitor,hadnoeffectonCT一1一
induced.H—LeuincorporationandPro:DNA.ConclusionThecardiomyocytehypertrophicaction
ofCT一1isessentiallymediatedbySTAT3,independentofPI3一Kandtheactionisnegatively
regulatedbyERK1/2viainhibitingthetyrosinephosphory1ationofSTAT3.Theinteraction
betweenSTAT3andERK1/2inCT?1?inducedsignalingmayassistCT1indevelopingadequ
ate
cardiachypertrophy.
MeSH:cardiomyopathy,hypertrophic;signaltransduction;myocardium;cells
心肌营养素一1(cardiotrophin一1,CT-1)是一个
新发现的致心肌肥厚因子,属于白细胞介素一6细胞 因子家族,该家族以其受体复合物中含gpl30信号 传导亚单位为特征.CT一1与其受体结合后,gp130 发生酪氨酸磷酸化,进而分别激活与左心室肥厚发 生有关的三条细胞内信号传导通路,即JAK一信号传 导子和转录激活子3(signaltransducerand
activatoroftranscription3,JAK—STAT3)通路,细 胞外信号调节激酶1/2(extracellularsignal-
regulatedkinasesl/2,ERK1/2)通路和磷脂酰肌醇 3一激酶(phosphatidy1inosito13-kinas,PI3一K)通路. 根据既往报道,CT一1系通过STAT3通路而非 ERK1/2通路诱导心肌细胞肥大.然而,这些研 究均系观察单一信号传导通路的作用,因而可能具有 片面性.另外,近来发现,在依赖gp130的信号传导 中,STAT3的活性可能受到ERK1/2的负调节],但 迄今为止,尚不清楚在CT一1的信号传导中是否存在 这种负调节,以及这种负调节是否具有影响CT.1致 心肌肥厚的生理作用.本研究分别应用STAT3, ERK1/2和PI3一K的抑制剂,观察上述三条信号传导 通路在CT-1致心肌细胞肥大中的作用.
1材料和方法
1.1材料:CT一1购于PeproTech.抗STAT3,抗 磷酸化ERK1/2,抗ERK1/2,抗I.cBa抗体和化学 抑制剂U0126购自CellSignaling.抗gpl30和抗一 tubulin抗体购自SantaCruz.抗酪氨酸磷酸化 (4G10)和抗PI3一Kp85抗体购自Upstate. Parthenolide和wortmannin购自Sigma—Aldrich Co.辣根过氧化物酶山羊抗免抗体IgG购自 Jackson.[7一P]ATP购自中国北京亚辉生物和医
学工程公司..H一亮氨酸购自中国原子能研究院. 1.2方法
1.2.1细胞培养:利用蛋白酶消化心肌组织及差速 贴壁去除非心肌细胞的方法,获得并培养1,2d龄 的原代Sprague—Dawley(SD)乳鼠心室肌细胞. 1.2.2细胞提取物制备:心肌细胞在低血清 (0.5胎牛血清)培养基中培养2d,在无血清培养 基中培养2h;然后,按指定的条件和时间培养.细 胞提取物根据报道的方法:制备.
1.2.3免疫沉淀和WesternBlot分析:细胞提 取物分别与抗gp130或抗STAT3或抗PI3一Kp85 三种抗体4?下孵育过夜.免疫沉淀物经收集,洗 脱后,95?加热5min,5,8聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离,转移至硝酸纤维素膜,4?下与抗酪氨酸 磷酸化抗体(4G10,1:1000)孵育过夜.用辣根过 氧化物酶山羊抗兔抗体IgG孵育1h,通过增强化 学发光法探测膜上蛋白质.再探测(reprobing)方 法系将膜在50?下于脱膜缓冲液中孵育30min, 使用与免疫沉淀时所用相同的抗体(1:1000,1: 2000)重复上述检测.探测ERK1/2苏氨酸/酪氨 酸磷酸化和IBa含量时,细胞提取物用10聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离,分别应用抗磷酸化ERK1/2 抗体(1:1000)和抗ERK1/2抗体(1:1000)探测 ERK1/2苏氨酸/酪氨酸磷酸化,应用抗IBa抗体 (1:500)和抗一tubulin抗体(1:500)探测IIcBa的 含量.
1.2.4凝胶内激酶检测:将等量(10/xg)蛋白质上 样于含1mg/mL髓磷脂基本蛋白质及10SDS- 聚丙稀酰胺凝胶上.电泳后,洗去SDS,4?下通过
用含6mol/L盐酸胍缓冲液孵育1h和含0.040A Tween20缓冲液孵育16h,分别进行蛋白质的变性 和复性.用激酶测定缓冲液室温下孵育30min,再 用含10FCi/mL[7一P]ATP的激酶测定缓冲液孵 育90min.终止反应,暴光于X胶片].
1.2.5心肌细胞肥大测定:利用[.H]亮氨酸(H— leucine,.H—Leu)掺人和细胞内蛋白质与DNA比值 (protein—to—DNAratio,Pro:DNA)方法评价.细
河北医科大学第26卷第4期?247?
胞饥饿24h,给予parthenolide(50txmol/L,2h)和 (或)U0126(10tool/L,1h)和(或)wortmannin (10nmmol/L,0.5h)预处理,然后加入CT一1(0.1 nmol/L).未经上述处理的细胞作为对照..H—Leu 掺人测定方法如下,同时加入CT1和.H—Ieu(1 /~Ci/mL),24h后清洗,1O三氯乙酸冰上孵育3O min,0.2mol/INaOH室温裂解4h,应用液闪仪测 量放射性强度.Pro:DNA测定系在细胞培养24 h后,检测蛋白质和DNA的含量.
1.2.6统计学处理:数据以(?S)
示.使用
SPSS11.5*R件,两组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素AN()VA分析和两两比较 的LSD分析.P<O.05认为有显着性差异. 2结果
2.1CT一1诱导gpl30酪氨酸磷酸化:CT一1刺激心 肌细胞后,gpl30呈时间依赖性地发生酪氨酸磷酸 化(图1).
2.2Parthenolide,U0126和wortmannin对CT一1 诱导STAT3,ERK1/2和PI3一Kp85磷酸化的作
用:CT一1在细胞中分别诱导出STAT3酪氨酸磷酸 化(图2A),ERK1/2苏氨酸/酪氨酸磷酸化(图2B) 和PI3一Kp85酪氨酸磷酸化(图2C).STAT3抑制 剂parthenolide分别使STAT3酪氨酸磷酸化减弱, 对PI3一Kp85酪氨酸磷酸化无影响,使ERK1/2的 苏氨酸/酪氨酸磷酸化增强.ERK1/2上游激酶抑 制剂U0126分别使ERK1/2苏氨酸/酪氨酸磷酸化 完全抑制,对PI3Kp85酪氨酸磷酸化无影响,使 STAT3酪氨酸磷酸化增强.PI3一K抑制剂 wortmannin则仅对PI3一Kp85酪氨酸磷酸化有抑 制作用,对STAT3和ERK1/2磷酸化均无影响. 可见三种抑制剂对各自信号传导通路具有特异性; 并且在STAT3和ERK1/2二者之间存在相互拮抗 现象"j.
2.3在CT一1刺激的心肌细胞中抑制ERK1,/2与 增强STAT3酪氨酸磷酸化之间的关系:以逐渐增
给予CT一1刺激 加U0126剂量的方法预处理细胞,
后,平行测定ERK1/2(凝胶内激酶检测法)和 STAT3(Westernblot分析)二者的活性.如图3, U0126使ERK1/2磷酸化水平呈剂量依赖性减少, 相反,STAT3磷酸化水平相应增加.STAT3最大 活性出现在应用10txmol/I的UOl26时. 2.4Parthenolide,U0126和wortmannin对CT一1 诱导心肌细胞肥大作用的影响
2.4.1对本实验条件下能否激活核因子一KB (nuclearfactor—KB,NF—KB)的观察:NF—KB是一种 具有调节心肌细胞肥大作用的转录因子.由于 parthenolide对NF—KB亦具有抑制作用,故有必要 观察本实验条件下CT一1能否激活NF—B.根据
NF—KB的激活以KB抑制子(inhibitorofKB,1KB)的 降解作为前提条件,观察了0.1nmol/LCT一1对I.cB 降解的诱导作用.如图4,应用0.1nmol/LCT一1 后,在60min内,IB的水平与对照组相比无显着 性差异(P>O.05),表明应用该浓度的CT-1不激 活NF,tcB.
2.4.2三种化学抑制剂对CT一1诱导心肌细胞肥 大作用的影响:CT一1(0.1nmol/I)使.H—Leu掺入 值和Pro:DNA分别增加47.2(P<0.01)和
38.7(P<0.01).Parthenolide使上述两增加
值分别下降28.4%(P<0.01)和21.1(P< 0.01),二者下降后与CT一1未处理时相比较无显着 性差异(均为P>O.05).U0126使上述CT一1诱导 的.H—Leu掺入值和Pro:DNA进一步增加,分别 为17.6(P<0.05)和16.3(P<0.05). Wortmannin在相同条件下未对两指标产生影响 (均为P>0.05)(图5).
phospho-gpI30
I30kD)
'-?-'??一?-?-gPI3or130kD) 图1应用Westernblot分析在心肌细胞中观察CT1对gpl30酪 氨酸磷酸化的诱导作用.Con:对照组
Figure1Tyrosinephosphory1ationofgpl30inducedbyCT一1in cardiomyocytesbyWesternblotanalysis.Con:control
—_嘲一—一?_?_
phospho—STAI"3
(92kD)
?A
雌o
?248?河北医科大学第26卷第4期
叠墨;;;.
??????一??
phospho—ERK1/2
f44,42kDl
ERK1/2(42kD
)B
phospho—PI3-KP85
《85kI)~
PI3一KP85i85kD
)c
图2应用Westernblot分析在心肌细胞【{1观察化学抑制剂对CT一1 诱导STAT3ERK12和PI3Kp85磷酸化的作用.A.
STAT3酪氨酸磷酸化B.ERK12的苏氯酸/酪氨酸磷酸
化.C.PI3一Kp85酪氨酸磷酸化.("Il(0.1nmolI.5 min);Con:对照组;P:parthenolide(【1ixmol/I.2h);U: U0126(10~mol,I?lh);W:wortmannin(10nmol1?0.5 h).*P>O.05#P<O.01与对照组相比
Figure2EffectofthechemicalinhibitorsonCFl—induced
ph.sphorylationofSTAT3.ERKl2andP13一Kp85in
cardiomyocytesbyWestern})lotanalysis.A.rryrosine
phosph0rylati0nofSTAT3.B.Threonine~tyrosine ph.sphOrylationofERKl2.C.Tyrosine phosphOrylali.nofPI3Kp85.CT—l(0.1nmolI,5
min);Con:control;P:parthenolide(5O"m()l/I.2 h);U:U0l26(10"mol/I,1h);W:wortmannin(10 nmoI/L,0.5h).*P>0.05#P<0.01 control
l-一一ERK1/~4A./42kD
Con0246810lA
一瞬一__?,1_??-???-???-DIlospho—STAT3
f92kD1
?-囊—-'_?'_?'—-'_??-?轩AT3(92kD
6810?B
图3在CT1刺激的心肌细胞中观察抑制ERK12增强STAT3
酪氨酸磷酸化之间的关系.rL((1.1nmo,IJI,5rain)刺激
后.A.胶内原位激酶测定法测定I'~RKl,?的活性;B.应用
Westernblot分析检测SFA'I'3酪氨酸磷酸化.C0n:对照组;
U:U0126
Figtlre3TherelationshipbetweeninhibitionofERKl2and
enhancementofSTAT3tyrosinef1l1.sf]h()rylati()nmCT
1stimtllaledcardiomyo{ytes.Tl1tJllsweretimulated
wiIhT1(0.Inmol/I.5rain).A.A(,tivityof ERKl2de1cotedbyingelkinaseassay;B.Tyrosine phosIJh.y1()nofTATdct(,L,1edt}yWesternblot an3lysis.Con:control;U:U(1126
--—一_?_一一lKB" '-___一
?-一?-一_?一一-一d—tubulin
8
C
#
_-?
_5
暑羞
{王
0
宴基
f????????
?
图4应用Westernblot分析在心肌细胞中观察不同浓度CT—l对
IB降解的诱导作用.上栏:应用抗IBa抗体进行免疫印渍
探测IKB;下栏:应用抗a—tubulin抗体进行免疫印渍探测a—
tubulin,作为上样含量对照.Con:对照组.*P>0.05
#P<O.0l与对照组相比
?0
9c一主__]二0暑u,0()(J一
6c【Iu.1.]二.2c\一
5IJILlJ毫l-]二0cIu,一.0
4c-暑1.ifJ暑LI,一.0
3量三【Jj=:.一.1.暑c/丑一0
,一c一暑一_]二.暑c/丑一^一
m嘶?0
9c一暑一二0暑c/丑801
8c-暑一
_]二.暑c/丑_J^K】一
6c—g一-1二0gc,一
5cIIlJ09二.gc\一0
4c一暑一_]二.暑c/丑一.0
3c【Iu0二.gc\一0
?o
孙光洁等种信号f专导通路在心肌'养素1致,L,肌细胞肥大中的作I}
0
B
06
05
04
《
Z
03
己
02
01
0
EffectofvaryingcontentrationsofL…I1oninductionof
1KBdegradationbyWeMeF11blotanalysisin cardiomyocytes.Upperpan(1:IKBdeletedby immblotlingwithanti—IKBc~alttibody:I.owerpanel:a—
tuhulindetectedhyimmblottingwilhantid1ubulin antibodyandservedasaloadingCO111ro[.L,on:【(mtro1.*
P>0.()=P<0.01CO111rnl
————————』—————]
.』.3
6
0S
6
,
萼
一5)B
图5三种化学抑制荆对T1诱导心肌细胞肥犬作用的影响.
A..H1.eu掺入:B.Pro:I)NA细胞术经预处理(泳道1)或
先用parthenoti&(50mo]I.!h.泳道3.5)和(或)U0l26
(10>mol.1h,泳道4.)或worlmannin(10nrlllliOII.().5 h.泳道6)预处理历.再用C'I'1处胛(o.inmol,l.泳道2,
6).#P<0.()l*,0.05,."j1厢绀州比较.
P:parthenoNde;U:UO126;W:wortnlat111ill Figure5EffectoftheIhreechemicalinhihllops(111eardioniyocyte
hypertrophyinducedby(一I'}.A.,II.t:tlinct)rporathm.
B.Pro:I)NA.Th[1cellsw'ere!f(fl11nstllllttta1ed(((】lilmll 1)orstimnlatcdwiIhCT1(0.fnlnolI.colLlmns2,6)
inthepresenceofparthenolidef5o"molI.一oh.columlis 3and5)andorU()126(10.f111(/[1.1h.col/lnls1and5)
orwortmannln(10nmmolI.().h.columns6).:P
<0.01*P:0.05I0.0betwen1he indicatedgroups.P:parthenolide:U:U0126;W:
wortmannin
3讨论
本研究的主要发现是在-r.1敛心肌细胞肥大
的作用中,STAF3通路起主要作用;ERKl2通路
通过抑制STAT3的酪氨酸磷酸化起负调节作用:
PI3一K通路未参与这一作用.
本研究观察到的STAT3和ERKl,2之间的相
互作用,可由近年来在针对gpl30的研究中得到佐
证.Gpl30第759位酪氨酸的磷酸ft为苏氰酸,酪
氨酸磷酸化ERK12所需(此反应【b蛋白质酪氮酸 磷酸酶2介导).通过第759酪氨酸突变造成
ERK12失活的"嵌入小鼠(knock—il]mice)".表现
为SFA1,3激活时问延长和STAT3柑关乍物功能
增强.反之亦然,gI)13()羧綦端AST八T突变(使
所有STAT结合位点缺失)町导敛gll3()激活
ERK12的功能增强.这些观察结果符合
}{irano等:提出的"信号协奏(Signal
()rchestration)"假说.即在一个给定的细胞【太l子受 体的胞浆域中,可以产生相互对立的信号.最终输
出信号由对立信号之问的平衡决定.据报道,
ERK12通过负调节STAT3起到防止肝细咆发生
过度分ft的作用.因此,本实验所观察到的在
【,T一1诱导心肌细胞肥大的作用【}1ERK12对
SFAT3的负调节现象.可能是一种防止心肌发过
度肥厚的机制.
【参考文献】
【1RailsonIE.1.iaoZ.17,rarBK,;t1.L,rdiotr【>1)hin1.1n【1
urocortincatls1."prottetionby"){,S}lltltpathwayand hyp(,rtrol/h3viadisiinelpaIhwa5,in(ardia(rnyotytij. L,3utlkin(.!O01.17():!I{15.
:一
Hrano''I.IshiharaK.tlibiM.Itoh<ifI\I,inIi1(dialbig 1h(eel1grow"i.dIfft,rnIia1IOil{ndNttr,I,t1signa1rt,}l,r"1 1hroughII6faniily()fcylokim,r(r'1)loIIJ.()tic()gone. 2o00.11)(21):.o5I81f;.
i
一
3KLInisadaK.tlirotatI.FujioY.L,1aI.\ctr,ationofJAK S'I,.I'andM.klKinas(sh3rh-ukcIlli~linhibitoryfl(1ortllrough gP1;,1incardiaeFliyt)(,ytesI=].L'lreulnlhn1.1?【)4(1【_):
2626o632.
1lj()htaniT,lshiharaK.AIsumi...1.L11I)isse(,1ion<ifsignaling e3St,adesthrongl1gPlSt)in,1,(J:rt(iprocnlrob,for5T,T.{ andSHP2一nlodb1ItdsignalsinlilI[tIUIll,Slions_I. Inlli1uni1Y.2Of】,1.11(1):91【J5.
5一
ErnstM.Ingh-PM.WaringI.(-1flf.I)tfecllvtgI)130 met{latp(isigna1tra11S(1tIcer?ln(jl'li,Ij【irofIra1l(ripli(1n
fSTAI,)signalingrt,stillIT1【,lit,rilli?-1oinl(hc1a(-,
gastrt~hitestnatutetrat?n.al}tjfaihlrtelfl1erin(,1illI)1ll11ation J.JExpMed.2001.19I(2):1203.
6hoY?MalsuiT.Kanilya,,.eIat.k(1r(J,irati1',1ranforof
signalingmot(euleshlton]tirin(-ft1lfheliato(ylt(kfines ("slinctrolesfor1t3eSI,AT3andRasIlathwaysduringhepalit dev(,lnpment[I.Hep;ttology.2000.32(6):f37(),176. ?栅
fI1?g?Iu—lI1BJ&JI】一: