犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养
犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培
养
z,/一,2卜/
第2卷第4期沈阳医学院
2000年12月JOURNALOFSHENYANGMEDICALCOLLEGE
VO1.2No.4
Dee.2OOO
犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养
/
蒋傻遮战杰王冬霞桀晓旭王川李铭忠
——(抗阳医学院附属中心医院手外科研究所.沈阳110024)
摘要目的探索犬肢体血管内皮如胞简易培养
,为在肢端复合蛆织体
外保存方法覆保存后组织知胞(血管内皮如胞)活性判定方面的研览莫定基础.方
法手术切取太建硬下动脉囊f支.采用血管外翻求,消化分离血管内皮细胞后体
外培养.用免疫组化法对增殖细胞分别进行?因子和CO”相关抗原的拉霸{.结果
分离的细胞存活率为99.3.培养24h多敷如胞已玷壁,至第3d,细胞开
培增
殖,可见细胞分鞋相;至第7d+亚细胞克隆组单十细胞分裂增殖,呈环片样生长I
扩增组细胞增殖旺盛.呈带路石样结构.?因子和CD相关抗原喜达阳性.结论
血管内皮细胞的分离采用血管外翻木后消化可燕理想的分离效果,谊方法简单易
抒,重复性好}体外培养的戈血管内皮如胞可以检测驯?因子和CD相关抗原.
关键词文}垒!内皮如胞}体外培养}”ill因子;cD
血管内皮细胞(endothelialcell,EC)
为血管衬里细胞肢端复合组织再植(移
植)恢复血流后血管EC的功能或活性往
往
着整个再植(移植)组织功能的恢复
状况因此,在肢端复合组织体外保存方法
及保存后组织括性判定方面的研究上,血
管EC的体外培养就显得极为重要.目前
国内外在鼠猪,牛,兔和人等血管EC培
养上已有许多成功的报道,且已应用于基
础或临床研究中,但犬的血管EC培养国
内迄今尚未见报道经反复实验,本文
了一种即简单易行,重复性好,又适合于犬
血管EC生长的培养方法.
1材料和方法
1.1主要实验试剂M199培养基,胰蛋
白酶,NCS购置美国Gibco公司;s—P试剂
盒.?因子,CD3.抗体均购置福州迈新生物
技术开发公司.
乏3}一j3
1.2实验动物及取材手术切取成年健
康犬(中国人民解放军二零二医院动物室
提供)左(右)旋股下动脉侧支长3OO,350
mm,直径O.9,1.21xitm.放入盛有含20
NCS的M199培养基中,以CMF—PBS液
反复冲洗至无血迹后用5/0聚丙乙烯线将
血管外翻使内皮朝外,两端以缝合线封口
后移至经预温的0.2Trypsin—EDTA
液中,37?滚动消化1O,15rain,待液体
微混加入无Ca”,Mg冷Hank’s液终止
消化并复洗2,3次后以1000r/rain离
心,收集细胞,制成0.5ml细胞悬液.
1.3细胞的计数及活体染色将收集的
细胞悬液提取部分分别做细胞收获量的计
数和细胞的活体染色.细胞的计数及活体
染色均在血细胞计数板上进行.细胞活体
染色采用的生物染料为曲利苯兰.染威蓝
色的细胞为死细胞,不着色的细胞为活细
胞,以此来判定所收获细胞的存活率.
-
241?
沈.阳医学院第2卷
1.4亚细胞克隆,扩增及密度依赖性实验
将细胞悬液稀释为7.22×l0’个/ml的
细胞悬液.分别提取该悬液i0l(约7.2X
1O个),i00(约7.2×i0个),500l
(约3.6×i0’个),依次接种在96孔培养
板和24孔的聚苯乙烯培养皿中(此皿放入
盖玻片,细胞集中盖玻片上培养),加入适
量(终浓度分别约1.4×10个/cm,1.4×
1O’个/cm,7.0×l0个/cm)含有2O
NCS的M199营养液,置37~C,5CO2培
养箱中静置培养并依次确定为亚细胞克
隆,细胞扩增和密度依赖3组.
1.5内皮细胞的鉴定
1.5.1形态学观察隔日在倒置相差显
微镜下观察细胞贴壁,细胞形态,细胞间的
融合,细胞克隆,细胞扩增,密度依赖性和
抑制现象并及时拍照
1.5.2免疫组化染色收集培养28,35
d的细胞分别进行HE染色,s—P法?因子
和CD相关抗原检测操作如下.?将经培
养有细胞的盖玻片从培养液中提取,经
Hank’s液冲洗后置入4多聚甲醛液中
固定2Omin(在冰箱内).?PBS洗5rain
×3次.?0.1~Tritonx—loo内浸2o
rain.~pBs洗5rain×3次@3H2O2阻
断内源性过氧化物酶5rain.◎PBS洗5
rain×3次.?10羊血清阻断非特异性染
色15rain?s—P法检测细胞中的?因子,
CD相关抗原
2结果
上述方法分离的血管EC,细胞活率为
99.3.细胞总收获量约为7.25×1ot个.
Trypsin-EDTA消化后的细胞形态为圆,
椭圆形.细胞呈单个游离,培养24h后多
数细胞已贴壁至第3d,克隆组,扩增组细
胞已开始生长或增殖,可见细胞分裂相.克
隆组的单个细胞第7d已分裂增殖,呈环
?242?
片样生长(图1).边缘细胞的外缘部呈半
圆状,胞核清晰可见,并可见分裂细胞.扩
增组细胞至第3d,可见多处三五成群细胞
聚集在一起,偶见分裂时相.至第7,14d,
随处可见增殖旺盛的细胞岛,细胞间融合
成片,呈铺路石样结构(图2),细胞核可
见.密度依赖(接触抑制)组细胞培养至第
3d后,重叠或未贴壁细胞逐渐退化,细胞
胞体增大,胞核模糊,融解,细胞死亡;其余
细胞培养至第21d,仍未窥见增殖细胞,细
胞处于相对静止状态.扩增组活悻细胞经
HE染色后,胞浆染成粉红色,胞核染成蓝
色,可见分裂细胞及衰老退化之细胞.CD.
和?因子相关抗原
达阳性,证实培养的
细胞为血管EC.
围1亚克隆组单个细瞳,-殖情况
亚克睦组单十细胞培养至第7d.
分裂增殖8,16个,呈环片样生长
(倒置相差显馓镜×640)
田2扩组细电增殪情况
扩增组细胞培养至第14d.增殖融
台成单层片献.似铺瞎石献结构
(倒置相差显散镜×640)
第4期蒋俊等.犬旋殷下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养
3讨论
细胞在体外生存与繁殖的关键在于细
胞所处的外界环境是否符合它的生存条
件.分化相对较低的细胞,如血管EC在体
外存活的最主要标志应是能否分裂繁殖.
要达到这个目的,除基本生存条件外,还取
决以下因素.首先,细胞分离的质量极为重
要.分离的细胞纯度和活性高,细胞收获量
大,则细胞增殖的量就多,否则反之.其次.
接种细胞的数量也不能忽视.接种的数量
少则不易尽快形成(增殖)一定的规模为之
所用{相反接种的数量过多,则细胞间易产
生密度依赖性抑制.不利于细胞的增殖.所
以,接种细胞的数量要依实验的目的适当
的加以选择本文认为,亚细胞克隆以1.4
×10’个/cm,细胞扩增以1.4×10个/
c:m.左右为宜,本实验再次证明.细胞间存
在高度密度依赖抑制,实验中应引起高度
重视.
胶原酶,胰蛋白酶消化法分离组织细
胞,可以说是一种人们常用的经典方
法_1].国内外分离血管EC,特别是分离较
细血管EC大部分采用这一方法.虽然胰
蛋白酶相对于胶原酶价格便宜,但它与胶
原酶一样常因产地,批号的不同.导致酶的
最佳活性点及作用时间不易掌握,浓度过
低则达不到消化目的,过高则可破坏细胞
结构,甚至造成细胞死亡.所以,适宜地选
用胰蛋白酶的浓度是分离细胞成功与否的
关键.较细血管(直径<1mm)EC的分离
往往较为困难,采用血管外翻技术,在
0.2Trypsin—EDTA作用下便可成功地
分离犬的血管EC.该方法细胞收获量及活
率均较高,且简单易行,重复性好,适合于
常规培养.可为今后寻求肢端复合组织体
外保存方法以及保存后组织活性的判定
(以细胞体外培养方法)奠定一定的基础.
?因子和CD为血管EC相关抗原哪.国
内在EC鉴定上多采用?因子相关抗原的
检测.而应用1厦因子和c.抗原来鉴定犬
血管EC至今尚未见报道.目前,除猪体外
培养的EC未检测到?因子相关抗原外,
多数哺乳动物EC均可检测到?因子相关
抗原.本实验证实,体外培养的犬血管
EC可以检测到?因子和CD相关抗原.
体外培养的活体细胞与病理常规标本
失活的细胞在膜的通透性上存在一定的差
异,活体细胞膜一般相对较差.该差异给活
体细胞染色带来了一定困难.本实验应用
Triton—x—100弱乳化荆作用活体细胞膜,
增加了细胞膜的通透性,缩小了两者之间
在膜通透性上的差异[s],从而大大提高了
该活体细胞染色的效果,为体外培养的活
体细胞染色提供了经验.
(本实验研究承蒙我院病理科王翠芳主任动精宴
验室张炎老师的鼎力相助,在此一井馥谢)
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(下转第251页)
?243?
第4期闫中政等.AMI后急性下肢静脉血栓形成2倒
胀完垒消退.
讨论急性下肢静脉血栓形成常发生千老
年术后或重症长期卧睐病倒.据报道AMI后1O
,
14天下肢静脉血栓发生率为34,38,而疑
为AMI而后否定诊断的.下肢静脉血栓发生率仅
为7,l0口】血栓形成与局部血管内皮损害,
血禳高凝状态,血流流变学变化及卧睐,心衰等弓I
起的静脉磷血回流缓慢等动力学改变等因素有
关.形成的血栓脱落可引起动脉栓塞].有报道
肺动脉栓塞在肺血管病变中占首位],应引起足
皓重视.
本文2倒老年男患,大面积AM’i合并重度心
衰且均于心梗后10日(停用低分子肝索后3日)发
生急性下肢静脉血栓形成,由于及时采取了尿激
酶静脉溶栓.抬高患肢促进回流,制动防止血栓脱
落等治疗措施,分别于血桂形成后3日,2同后下肢
肿胀消退,说明溶栓有效,血栓溶解,阻塞静脉再
通,均未发生肢体破溃,感染及肺栓塞等并发症.
本报道提示,对疑为下肢静脉血栓形成的高
危病例,治疗上应采用积极抗凝疗法,配合被动运
动,以促进静脉回流.预防血栓形成.如发生急
性血栓形成,可采用尿激酶静脉溶栓,并采取措诱
(上接第243页)
防止血栓脱落].
参考文献
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Co]turedofEndothelia】CelIsfromBranchVesseIofCanine,
CircumflexLateralisFemora】inVitro
Jiang,run,TianLijie,ZhanJie,etal
(DepartmentofHandSurgery,AffiliatedCentralHospitalt0ShenyangMedk
alCollege—Shenyang110024)
AbstractObjectiveToexptoreapracticalmethodoncultureofcaninevascularendothelialceil
(EC)inordertolaythefoundationonconservatirerftedthodofArco--eombirmdontissueinvLtroand
judgetheactivityofconservedtissularcells(vascularEC).MethodsCaninearteriacircumflexIater.
atisfemoralwasgotbytheoperations.V~scularECwasdigestedandseparetedbyeversionofblood
vesse1.thenculturedinvitro.TheantigenCDandthefaetor?
werecheckedbyS-Pimmunohis-
tochemicalstsin/ng.ResultsThesurvivalrateofseparetedceUswas99.3N.After24hoursthecells
begantOgrow~dhesively.Andafter3daythecellspxollferatedandappearednuclearfission.After7
dayswecouldfindthesinglecellofsubc~llcolondgroupproliferatedlikeacycleandthecellsofexpand
groupgrowlikespreadingstone.ConclusionExpressionoffactor?
andCDispositive.Wecanget
effectiveisolationofECwitho.20Typsin-EDTA.Factor?
andantenCDa.areexaminedinco1.
turedendothellalcellsofcaninevesse1.
Keywordsca~ne;vascularendothelialcell;culturedinvitrotfactor?1CDu
?251?