新生兔机械通气肺损伤MMP-9与白细胞相关性的研究

新生兔机械通气肺损伤MMP-9与白细胞相关性的研究 新生兔机械通气肺损伤MMP-9与白细胞相 关性的研究 2BaskarJF,FumariB,HuangES.Demonstration0fdevelopmentala. nomaliesinnIc吡sefetusesbytransferofmurineeytomegalovlrusDNA— injectedeggstosurrogatemothemJInfectDis,1993,167(6): 1288 3艾继辉,罗丽兰,刘文清et排卵前成熟卵泡液对卵母细胞体 外成熟的影响.广州医学院,2003,31:27 4王听荣,陈素华,乔福元et金银花抗豚鼠巨细胞病毒的体外 实验研究.中国妇幼保健,2005,20(17):2241 5Boisol,MartiM,SantaloJ.eta/.Aconfonalmicroscopyanalysisof thespindleandchromosomeconfigurationsofhumanoecytescryopre- servedatthegerminalvesicleandmetaphaseIIstag~HumReprod, 2002,17(7):1885 6王听荣,陈素华,乔福元小鼠巨细胞病毒对小鼠未成熟卵 中国妇幼保健2Oo7年第22卷 母细胞体外成熟的影响.中国优生与遗传杂志,2004,12(3): 101 7LiesardCA,RevelantP,EenlertY.甜d,Ismatchingbetweenwomen anddondrsfeasibletoavoidcytomegalovirusinfectioninartificiallinsem- inatinnwithdonorsemen.HumReprod,1998,13:25 8TsutsuiY.Murinecytomegalovil-ilsfortheanimalmodelsofcongenital eytomegalovirusinfectioninhuman.NipponRimho,1998,56(1): 9O 9TheAmericanFertilitySociety.Guidelinesforgametedonation.Fertll Steril,1993,59:1 10TebourbiL,TestartJ,CeruttlI,eta/,Failuretoinfectembryosafter viresinjectioninmolls~zygatesHumReprod,2O02,17(3)760 (2oo6.11-o9收稿)[编校邹庆红] 新生兔机械通气肺损伤MMP一9与白细胞相关性的研究? 花少栋杜江唐雯安胜利?杨丽华封志纯 南方医科大学珠江医院儿科(广东广州)510282 中国图书分类号l玎25.6文献标识码A文章编号10014411f2007)34.4916-05 【摘要】目的:研究新生兔机械通气肺损伤中基质金属蛋白酶与灌洗液中自细胞相关关系及机械通气肺损伤的发生机 制.:对生后日龄1—5天的新生兔72只,按2×2×3析因设计,随机分配在高浓度氧,低浓度氧两组,每组又分为高吸气 峰压,低吸气峰压共4组进行机械通气,通气中选取1h,3h,6h3个时间点活杀取肺,左肺灌洗液细胞计数,沉渣涂片细胞 分类,测湿干比,并结合病理片.ELISA法检测肺组织匀浆中MMP一9的浓度.结果:MMP一9与白细胞总数,单核巨噬细 胞正相关,与湿干比呈正相关,与淋巴细胞,分叶核细胞不相关.结论:新生兔机械通气肺损伤,巨噬细胞可能是MMP一9的 主要来源,巨噬细胞通过分泌MMP一9参与肺损伤的发生. 【关键词】新生兔机械通气肺损伤MMP一9白细胞 Thecorrelativityresearchbetweenmatrixmetalloproteinase一9andwhitebloodcell inventiintor—-inducedlungsinjuryofnewbornrabbits HUAShoo—Dong,DU—fiang,Tang一ren,eta1.DepartmentofPediatrics,ZhufiangHospitalofSouthernMedicalU- nivershy,Guangzhou510282,Guangdong,China (AbstractJObjective:Toinvestigatethecorrelativitybetweenmatrixmetalloproteinase一9andwhitebloodcellinventilator—in— ducedlungsinjuryofnewbomrabbits,andlungsinjurymechanisminducedbymechanicalve ntilation.Methods:72newbornrabbitsaged1 — 5dayswereas册gedrandomlytotwogroupsby2— 2~3factorialdesign,accordingtohighconcentrationoxygenandlowconcentrationox— ygen.Therabbitsofeachgroupweredividedintotwoparts:highpeakinspiratorypressure(PIP)andlowPIP.Allrabbitsweredoneby mechanicalventilationandkilledtoobtainlungtissueatlh,3h,6hairierteat.CellsinleftBronchoalvenarlavagefluidwerecountedandthe. percentageofWBCwereclassifiedinsedimentfilm.DetectingtheconcentrationofMMP一 9inlungtissuebomogenatebyELISA,atthe SgEo_etimedetectingtheratioofwettodryandanalyzingpathologicalsection.Results:MMP-9wasdirectcorrelationwiththetotalofwhite bloodcells.mononuelearmacmphageandtheratioofwettodry,butitwasnocorrelationwithlymphocytesegmentedcells.Conclusion: MacrophageismainsourceforMMP-9anditparticipatesinlunginjurybysecretingMMP一 9inventilator—reducedlungsinjuryofnew. bomrabbits [Keywords]Newbornrabbit;Mechanicalventilation;Lungsinjury;Matrixmetalloproteinase;Whitebloodcell 早产儿慢性肺疾病(chroniclungdisease,CLD)是目前 ?基金项目:广东省科技计划项目基金资助,项目编号:B30502 ?基础部统计教研室 摆在儿科医生面前的一大难题,无论何种原因所致的肺损伤, 在损伤修复的同时,若修复不当,最终导致成纤维细胞增生, ECM沉积.肺组织纤维化?,CLD的发生.基质金属蛋白酶 (Matrixmetalloproteinase;MMPs)与呼吸系统疾病密切相 花少栋等新生兔机械通气肺损伤MMP一9与白细胞相关性的研究?第34期 关0,作为ECM的主要降解酶之一MMPs在CLD的发生中 占有重要地位.在各种病因所致急性肺损伤的发生中,肺内 过度,失控的炎症反应是其根本原因H.中性粒细胞是造成 其过度性炎症反应的元凶,两者在肺损伤中的关系如何, 本文从MMP一9的定量角度阐述与白细胞的相关性,旨在研 究新生儿机械通气肺损伤的发生机制. 1材料与方法 1.1动物模型的制备对日龄1,5天的新西兰兔72只(由 南方医科大学动物实验中心提供),体重均数为(53.89? 15.19)g,各组间均数经单因素方差分析均无差异.按2X2 X3析因设计,随机分配在高浓度氧(100%),低浓度氧 (45%)两组,每组内又分为高吸气峰压(PIP=25cmH:O) 和低PIP(10cmH:O)两组,在西门子900C呼吸机上进行 机械通气,选取1,3,6h3个时间点,每个时间点6只,共 观察12组72只兔.麻醉采用10%水和氯醛0.03ml/10g体 重口服.通过预实验后决定:?从喉结下切开气管,插入1.3 X25mm号静脉留置针管,深度为1.5,2cm,根据通气后兔 胸廓起伏是否对称作适当调整以免肺不张.?采用定压模式, PEEP2cmH:O,呼吸频率(R)50~/min,吸气时间(IT) 0.33s固定不变. 1.2肺损伤指标检测上述时间点通气结束,切断颈总动脉 放血处死动物.开胸取肺,游离左支气管,取下左肺,轻擦 干表面,立即称重计为肺湿重(w),然后以4?生理盐水1 rIll行左肺支气管肺泡灌洗,反复灌洗3次后回收,准确记录 回收量,回收率达90%,支气管肺泡灌洗液(BALF)2000 r/min离心10min,沉渣用4%的冰醋酸2001摇匀处理红细 胞后,镜下作白细胞计数,之后涂片,瑞氏染色,油镜下计 数300个细胞,记录各个细胞的百分比.灌洗后左肺置入7O ?的烤箱内,48h后称重计为肺干重(D),计算W/D;右肺 ? 49l7? 下叶用4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋,5切片,苏木素 一 伊红(HE)染色,光镜下检查肺组织病理变化. 1.3肺组织MMP一9的测定右肺中叶在电子天平上称重, 所有实验动物均称取0.12g肺组织,置于一7O.冰箱冻存,双 抗夹心ELISA法测MMP一9的浓度.ELISA试剂盒购自美国 RB公司,操作严格按照书进行.BIO—RAD—Model一 550型酶标仪上测450nm处的OD值;扣除标准品稀释液造 成的本底后,以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线,由曲线拟合得到曲线方程,由OD值可得到 MMP一9的浓度. 1.4统计学处理统计学处理由SPSS11.0统计软件完成. 数据以(?s)表示,采用析因设计的方差分析,独立 样本的t检验和单向方差分析,相关分析采用双变量Pearson 相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1病理全部动物实验结束,有3只动物死亡,1只为高 氧高压1h,另2只为低氧高压6h,体重较大.在66g左右. 大体标本:6只兔出现不同程度的肺不张.肺淤血,其中低压 力组4例.同正常肺相比,通气组均有肺表面有不同程度的 出血.光镜:共性特征是不同程度炎性细胞的浸润,以淋巴 细胞和中性粒细胞为主,巨噬细胞增高明显,肺间质和肺泡 弥漫性水肿,肺泡破裂并融合,肺泡壁及肺泡腔内出血.低 压力组肺泡通气不均一,肺泡壁厚度及肺泡腔大小不一较明 显,同时也伴有肺泡壁破裂. 2.2新生兔肺湿干比(W/D)见表1. 2.3肺泡灌洗液中白细胞计数,淋巴细胞,单核巨噬细胞, 中性分叶核细胞计数见表2,3,4. 2.4肺组织匀浆中MMP一9的浓度见表6. 表1新生兔肺湿干比(W/D) 表2灌洗液中自细胞计数的变化?(×10') ? 4918? 表3灌洗液细胞分类中分叶核细胞计数的变化%(i?) 中国妇幼保健2007年第22卷 表4灌洗液细胞分类中巨噬细胞计数的变化%(?) 表5灌洗液细胞分类中淋巴细胞计数的变化%(?) 表6MMP-9的含量变化(单位:ng/m1) ?与组相比,有显着性意义.P<Q05,?与高氧高压1h,高氧低压1h相比,有显着性 意义,P<Q05 2.5相关性研究对以上5组资料进行Pearson相关分析发 现,MMP一9与白细胞的相关性如下:与白细胞计数正相关, r=0.522,P=0.000,与单核巨噬细胞正相关,r:0.35,P= o.003,MMP一9与湿干比呈正相关,r=0.420,P=0.000, 与淋巴细胞不相关r=一0.189,P=0.112,与分叶核细胞不 相关,r=一0.122,P=0.309,检验水准P<0.01.湿干比与 灌洗液中自细胞计数呈正相关,r=0.356,P=0.002,与分叶 核计数呈负相关,r;0.247,P=0.036,检验水准P<0.05; 与巨噬细胞,淋巴细胞不相关. 3讨论 在正常肺组织中,正常稳定细胞不产生MMP一9,或产生 极微量的MMP一9,但是在各种不同的刺激作用下,MMP一9 主要由炎性细胞产生,包括分叶中性粒细胞,单核细胞,巨 噬细胞,肥大细胞,NK细胞,嗜酸粒细胞和淋巴细胞,同时 支气管上皮细胞,肺泡?型细胞,纤维母细胞,平滑肌细胞 以及内皮细胞都能产生MMP一9.肺组织的中性粒细胞在骨髓 的成熟期合成MMP一9,迅速释放后就贮存在特殊颗粒中. MMP一9的主要功能为降解除多糖以外的全部细胞外基质成 分,它可在多种酶作用下相继激活,形成瀑布效应,具有重 要的生理和病理意义,先以无活性的酶原形式分泌到细胞外, 在体内经纤溶酶,激肽释放酶等切断N:末端而活化,通常在 中性条件下发挥活性.MMPs在体内主要参与ECM的降解, 其底物包括明胶,?,?,V,?,X型胶原,层粘连蛋白, 弹性蛋白,纤粘蛋白及神经微管相关蛋白一2(MMP一2)等. 在组织损伤的同时,机体的抗损伤修复也在同时进行,包括 基质重建和受损细胞的修复.在机械通气肺损伤的急性炎症 阶段,基底膜受损,伴有临时ECM的沉积,同时MMPs释放 花少栋等额生兔机械通气肺损伤MMP一9与自细胞相关性的研究第34期 增加,以降解临时沉积的ECM,若MMPs释放适量,适时, ECM的降解和合成趋向平衡,临时沉积的ECM被正常的ECM 所取代,ECM重塑成功,基底膜恢复正常. 机械通气时,肺泡细胞受到过度的牵拉,从而形成了对 肺泡细胞的一种周期性的机械应力,这种应力可通过细胞表 面的相应受体介导细胞功能的改变,如压力受体在受到机械 性伤害刺激后,可以向细胞内转导这些伤害性刺激信号,使 正常中正常细胞活动的调控发生异常,导致肺损伤.有研究 表明MMP一9在内皮细胞,炎症细胞的迁移中也起作用'. 最近发现给正常人静脉给予LPS,其血液中中性粒细胞向血浆 释放MMP一9增加.这些研究提示MMP一9参与急性炎症 过程.本实验中不同的通气模式引起MMP一9产生的浓度不 同,结合病理所见,说明MMPs介导的炎症反应,可能是机械 通气肺损伤的机制之一.肺损伤过程包括肺组织的炎性损伤, 组织结构破坏以及随后伴有肺间质细胞积聚的组织修复过程. 在此过程中,肺炎症细胞(主要为单核巨噬细胞,中性粒细 胞),肺泡上皮细胞,肥大细胞,内皮细胞和肺间质细胞(如 成纤维细胞,肌纤维母细胞)多种细胞共同构成了一个复杂 的肺细胞网络,彼此相互影响通过分泌细胞因子,炎性介质 等生物活性物质,发挥直接或间接的作用.肺泡巨噬细胞, 中性粒细胞能合成和释放大量的具有多种生物活性的细胞因 子,前炎介质,趋化因子及蛋白酶类等,在肺炎症发生发展 过程中发挥极其重要的作用.本实验中不同的通气模式,肺 灌洗液中自细胞分类的不同变化,以及病理切片所见肺泡壁 增厚,炎性细胞的浸润可能是机械通气肺损伤所致CLD的早 期事件.机械作用力及氧气的吸人可直接作用于肺泡膜引起 肺损伤以及炎性介质的作用使肺泡上皮和毛细血管内皮通透 性增高,引起渗透性肺水肿:另外,MMP一9是内源性蛋白水 解酶,MMP一9除了可以通过降解细胞外基质蛋白,引起微血 管通透性增加外,还能水解维持正常内皮屏障的紧密连接蛋 白,粘附蛋白等,直接引起血管通透性增加,导致肺水肿, 本组实验结果显示MMP一9与反应肺水肿程度的湿干比成正 相关,灌洗液中自细胞总数与湿干比成正相关支持这一观点. 说明MMP一9在机械通气诱导的急性弥漫性肺泡损伤的发病 机制中发挥重要的作用. 本研究通过相关分析发现:MMP一9与自细胞总数正相 关,与单核细胞正相关,MMP一9与淋巴细胞,分叶核细胞不 相关说明机械通气肺损伤MMP一9可能来源巨噬细胞而不是 中性分叶核细胞,淋巴细胞与分叶核细胞的移行不需MMP一9 的参与,同在小鼠的体外和体内实验中,发现与中性粒细胞 移行均不需MMP一9参与"叫相一致,虽然中性粒细胞依赖性 的肺内过度性,失控性炎症反应是导致各种病因所致急性肺 损伤的根本原因,但也有非依赖性急性肺损伤,对其发病 机制研究提示单核/巨噬细胞可能具有重要作用".体外试验 应用LPS刺激可使人类肺泡巨噬细胞释放MMP一9增加【】. 但也有研究还发现中性粒细胞与MMP一9有密切关系,在普 通性间质性肺炎(UIP)患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中, MMP一9的活性与中性粒细胞百分比增高有关,也有发现 用堋Ps的合成抑制剂batimastat可以阻止支气管肺泡灌洗液中 ? 4919? 巨噬细胞和淋巴细胞的增加,可以有效地降低MMP一9的活 性?,临床调查发现,在特发性肺间质纤维化患者的肺泡灌 洗液内有显着高水平的胶原酶MMP一9及MMP一2以及与这 些酶水平增高相关的中性粒细胞及淋巴细胞数量的增多, Gushimat【I"等将小猪暴露于80%的氧中诱导急性肺损伤模型 中发现BALF中的MMP一9肺湿/干重比,BALF中的中性粒细 胞计数明显相关,说明可能来源中性粒细胞的MMP一9在高 氧诱导的急性弥漫性肺泡损伤的发病机制中发挥重要的作用. 这些矛盾的结果其原因可能是?研究对象不同,新生动物免 疫机制不成熟,氧化应激反应不能够很快的建立,能使中性 粒细胞激活的趋化因子和炎症介质的表达延迟,?新生动物 肺,造血器官的发育与成年动物不同?不同条件的刺激对 MMP一9等细胞因子的激活通路不同,本组除吸氧浓度因素 外,还有机械压力的因素.上述现象需要进一步研究,以了 解MMP一9对中性粒细胞,单核巨噬细胞的确切作用. 4参考文献 1HelenChristou,DamBrodsky.LungInjuryandBronchopulmonaryDys— plasiainNewbornInfantsJ,tntensiveCareMed,2005,20:76 2OhbayashiH.Matrixmetallopmteinasesinlungdiseases.CurtProtein PeptSc1.20o2,3:409 3ToriiK.lidaK.MiyazakiYet以Higherconcentrationofmatrixmetal— loproteinasesinbronchoalveolarlavagefluidofvatientswithadultrespira— torydistresssyndrome.AmJResCritCareMed,1997,155:43 4泽方与方摘.急性肺损伤研究的最新进展.13本医学介绍,2003, 24(1O):467 5阎锡新,郭丽萍.中性粒细胞在急性肺损伤中的作用.国外医学 呼吸系统分册,2002,22(4):194 6CorbelM,BoichotE,lagenteV.RoleofgelatinaseMMP一2and MMP一9intissueremodelingfolltm-lngacutelunginjury.BrazlMed BiolRes,2000,33(7):749 7LegrandC,GillesC,ZahmJMetaLAirwayepithelialcellmigration dynamics:MMP一9roleincellextraceilularmatrixremodeling.JCell B;ol,1999;146:517 8PusinJ,WidmerMC,Kos.~doSetaLHumanneutrophilssecretege— latinaseBinvitroandinvlvoinresponsetoendotoxinandproinflamma— torymediators.AmJRespirCellMolBiol,1999;20:458 9AlexanderJS,ElroW.Extraeellularmatrix,junctionalintegrityand matrixmetalloproteinaseinteractionsinendothelialpermeabilityregula— tion.JAnat,2002.200(6):561 10BetsuyakuT,ShipleyJM,"uZeta1.Neutrophilemigrationinthe lungs,peritoneum,andskindoesnotrequiregelafinaseB.AmJRe— spirCellMolBiol,1999,20:1303 11ShamesBD,ZallenGS,MelntyreRCeta1.Chemokinesa8mediatorsof diseasesrelatedtosurgicalconditions.Shock,2000,14(1):1 12ShapiroSD.CampbellEJ.KobayashiDKetaLDexamethasonese— leotivelymodulatesbasalandlipopolysaceharide--inducedmetallopro-- teinaseproductionbyhumanalveolarmaero0hages.jlmmunol,1991, 146:2724 13SugaM,lyonagaK,OkamotoTeta/.Characteristicelevationofma— ? 4920? trixnmtalloprotein~eactivityinidiopathicinterstitialpneumonias.Am JRespirGritCareMed,2000,162(5):1949 14CorbelM,Caulet—MaugendreS,GermainNetaLInhibitionotbleo-16 mycin—-inducedpulmonaryfibrosisinmicebythematrixmetalloprotei. nasein.hibitotbatimastaLJPathol,2001,193C4):538 15suM,lyonagaK,OkamotoTeta/.Elevationofmatrixmetalloprotei. 中国妇幼保健2007年第22卷 naseactivityinidiopathicinterstitialpneumonias.AmJRespirCr/tCare Med,2000,162:1949 GushimaY,lehikadoK.SugaMa1.Expressionofmatrixmeta1]o- proteinasesinpigswithhyperoxia--inducedaeutelunginjury.EurRe. spirJ,2001,18(5):827 (2007-02-25修回)[编校徐强] IL一4变异体表达载体的构建及其在真核细胞BHK一21的表达 王桂兰广东省中山市博爱医院儿内科528403 鲁继荣?吉林大学第一医院儿内一科 中国圈书分类号I盯2S.6文献标识码B文章编号1001-4411IZ007)34-4920-03 【摘要】目的:构建具有拮抗IL一4作用的IL一4变异体(IL一4RA)的真核表 达载体,并通过真核细胞表达变异蛋 白.方法:设计突变粤I物,从小鼠的PBMC细胞提取总RNA,RT—PCR方法扩增目 的片断,将该片断构建在真核表达载体上, 并在真核细胞BHK一2l中表达,通过Elisa方法检测IL一4变异体蛋白的表达. 结果:通过测序分析及限制性酶切鉴定,采用 RT—PCR成功的完成了IL一4RA的扩增和表达载体的构建,重组载体转染真核 细胞后在上清中检测到IL一4RA的表达.结论: 经构建含有目的基因(IL一4RA)的逆转录病毒载体,能够成功的在真核细胞BHK 一21中表达出IL一4RA. 【关键词】IL一4RA逆转录病毒载体逆转录聚合酶反应基因重组真核表达 Constructionofrecombinantvectorcontaining也一4RAanditsexpressioninBHK 一 21cells. 4?GGui— Lan.DepartmentofPaediaticu,ZhongshanBoaiHospital,Zhongshan528403,Guangdong, China LUJi— Rong.DepartmentofPaediaticu,theFirstHospitaloflinUniversity,Changchun13oo21,埘in,China [Abstract]Objective:ToconstructthecomplementaryDNA(eDNA)ofIL一4RAbygeneengineeringandexpressinBHK一 21.Methods:ThetotalRNAextractedfrommousePBMCandIL一4RAwasamplifiedbyRT —PCI乙TheproductW88theninsertedinto PLNCandPIRESvector~TherecombinantvectorWSStransfectedintoBHK一21cellsfollowedthedetectionoftheexpressionofIL一4RAby FAisa.Results:TheeDNAofIL一4RAWaSidentifiedcorrectlybyendonueleasescleavageandsequencing.TherecombinantI L一4RAwas obtainedbydetectionofIL一4RAfromthesupematantofBHK-21.Conclusion:Theconstructionofrecombinantvectoris afeasiblewayto expressIL-4Rinvitro. [Keywords]FactorIL4RA;Recombinantvector;Transeril~ltasepolymeresechainreaction ;Generecombination;Geneexpress 支气管哮喘是一种儿童时期常见的呼吸系统慢性炎症性 疾病,其主要病理生理特征是气道炎症和气道重构,其中包 括炎症细胞浸润,表皮下ECM沉积,平滑肌细胞肥大增生以 及弹性纤维片段的折叠等.目前的治疗主要以激素及支气管 扩张剂为主,但长期用糖皮质激素有很多的副作用.特别是 10%一20%的患者存在抵抗现象,迫切需要一种新的免疫抑 制药物弥补它的不足.在哮喘的发病过程中T和T磁细胞 调节失衡是主要原因,其中TH.,细胞分泌的细胞因子lFN— Y,IL一2可以减轻气道的炎症反应,而Tm细胞的分泌的细 胞因子IL一4,IL一13和IL一5可以促进B细胞分化并产生 IgE和IgG.并且促进嗜酸细胞的趋化,促进炎症的发展.本 研究主要是针对IL一4和lL一13的受体,使用RT—PCR,基 因诱变,基因克隆技术构建一种能够拮抗IL一4和IL一13的 IL一4的变异体IL一4RA,该变异体的结构在116和119位点 ?通讯作者 的氨基酸用基因诱变的方法进行替换,使得其能够与IL一4 和IL,13的共同受体结合,但没有细胞内传导的作用,最终 起到拮抗IL一4和IL一13的作用,达到抑制哮喘的目的.本 试验部分主要是进行该变异体基因的真核表达载体的构建, 以达到其在真核细胞的表达. 1材料与方法 1.1RNA提取和质量鉴定采用小鼠脾细胞培养,脾细胞 培养液中以5/ml的浓度加入PHA,刺激72h便于IL一4 的生成.RNA提取采用RNAgentsTotalRNAisolationKit(Pro- mega),RNA定性采用醛变性凝胶电泳法,通过观察28S与 18S的比值确定RNA是否发生降解. 1.2引物设计采用PrimoPro3.4软件,前后分别加入了 EcoRI和NmI的酶切位点.IL一4BA—FS'一GAATrCatgggtet, 经NCBI数据库比对,与其他基因无序列相似性者作为引物.