北科大微生物实验1、细菌的形态结构观察和染色

实验一细菌的形态结构观察和染色目的观察细菌菌落的特征。掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤。在油镜下观察细菌个体的形态。了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽孢、荚膜及鞭毛染色。了解环境微生物的检查。安全事项微生物酒精灯灭菌锅玻璃器皿超净台（紫外线）电器（电炉、微波炉…）……奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜镜筒物镜转换器载物台载物台调节钮粗调节器细调节器电源光强调节钮孔径光阑视场光阑双筒目镜摄像头物镜镜座镜臂荧光发射装置奥林帕斯生物显微镜的使用方法接通电源。打开主开关。转动光强调节钮，使亮度适中。把标本固定在载物台上。用低倍物镜，旋转粗调和微调来进行对焦。调节双目镜筒间距和视度差。再适当调节照明度。使焦点正确地对准标本。调节孔径光阑。依次用低、中、高倍镜观察。油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看清物象为止。换片：另换新片，必须从第9条开始操作。观察完毕，下降载物台，取下载物台上的载玻片，将4×的目镜对准载物台，再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾取少量乙醇/水擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。用毕复原：先将电压调节旋钮复原，关闭主开关，切断电源。显微镜保养和使用中的注意事项不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤害，并且无法进行图像采集。观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同时聚焦。观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物像更加清晰。基本原理(一)简单染色法原理(二)革兰氏染色法原理(三)抗酸染色原理(四)芽孢染色原理(五)荚膜染色原理(六)鞭毛染色原理染色剂和染色原理微生物染色常用染料如下表：实验内容（简单染色的方法和步骤）涂片自然干燥微火固定染色lmin冲洗吸干镜检实验内容（革兰氏染色的方法和步骤）涂片，干燥、固定草酸铵结晶紫染液染色lmin，用水冲洗用革氏碘液媒染lmin，用水冲去碘液用95％乙醇脱色10-30s，至乙醇液不呈现紫色蕃红染液复染lmin，用水冲洗吸干并镜检一、基本原理　　革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。　　革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。实验内容（了解抗酸染色的方法和步骤）1．制片将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80℃恒温水浴3h杀死菌体。取菌悬液涂片，自然干燥。2．染色滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出现，不断补充染液，加热8～10min，弃染液。3．脱色用3％盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。4．水洗滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。5．复染加美蓝染液染lmin。6．水洗后自然干燥、镜检草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成蓝色。抗酸染色原理:分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。   步骤:萋纳石炭酸复红染色,加温促使菌体着色;3%盐酸乙醇脱色;吕氏美蓝复染,未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌,脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。实验内容（了解芽孢染色的方法和步骤）孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀，制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈现红色。原理是芽胞壁较厚，通透性低而不易着色，但芽胞一旦着色就很难被脱色。因此，先用着色能力强的染液（如孔雀绿或石炭酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽胞，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽胞中的染料仍保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽胞仍为原来的颜色，这样两者区别开来。实验内容（了解荚膜染色的方法和步骤）1．制片加一滴6％葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合，再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干燥。2．固定滴加l～2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。3．染色，冲洗滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。 荚膜是包围在细菌细胞外的一层黏液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽 。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水、易在用水冲洗时被除去。所以通常用负染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。 1、实验材料 ①荚膜染色液。 ②菌种。有荚膜的细菌。 ③其他。玻片、接种环、吸管等。2、注意事项 ①荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。 ②玻片必须洁净无油迹，以免涂片时混合液不能均匀散开。 实验内容（了解鞭毛染色的方法和步骤）1．载片的清洗：将载片洗净浸泡在95％乙醇中备用。2．实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上(斜面下部要有少量冷凝水)，连续移种3～4次，每次培养12～18h，最后一次培养12～16h。3．制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水滴中片刻，将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，可再返转一次使菌液流经面积扩大，然后放平，自然干燥。4．染色（利夫森氏染色法）：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜及染液冲洗干净，自然干燥。镜检镜检时应在涂片上按顺序进行观察，经常是在部分涂片区的菌体染出鞭毛，菌体及鞭毛均为红色。鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛的数目和附着于细菌的位置是细菌的一项重要形态特征。细菌的鞭毛很纤细。除了很少数形成鞭毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛的存在外，多数细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。     鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。 1、实验材料 ①鞭毛染色液。 ②菌种。有鞭毛的细菌。 ③其他。玻片、接种环、吸管等。2、注意事项 ①良好的培养物是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用陈旧培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 ②玻片应光滑、洁净，不可带油迹。不洁净的载玻片可经含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出后用清水充分洗净，沥干水后置95%酒精中处理，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 ③挑取菌时，尽可能不带培养基。 ④配制合格的染色剂（尤其是B液 ）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是鞭毛染色成败的关键。实验材料Ⅰ(一)菌种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。(二)染液简单染色：草酸铵结晶紫染液。革兰氏染色：草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液。实验材料Ⅱ(三)标本细菌三型、四联球菌、荚膜、芽孢。(四)其他物品无菌水、显微镜、载片、盖玻片、酒精灯、吸水纸、香柏油、擦镜纸、接种环。肉膏蛋白胨培养基平板。实验内容(一)成片观察(1)观察细菌三型涂片，比较球菌、杆菌和螺旋菌的形态。(2)观察四联球菌的形态及排列方式。(3)观察苏云金芽孢杆菌的芽孢，褐球固氮菌的荚膜的形态。实验内容(二)观察平板上的细菌菌落，识别大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。注意菌落的形状、高度、大小、颜色，是否湿润、光泽、透明度、边缘状况等等。实验内容(三)革兰氏染色法：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（必做），枯草芽孢杆菌（选做）(四)环境微生物检查，使用肉膏蛋白胨培养基检查环境中无处不在的微生物。实验内容(一)画表描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征。(二)绘图：画出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形态图。(三)记录革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或阴性菌。如果染色结果不理想，请原因。微生物名称形状大小含水程度菌落颜色透明度与培养基结合程度嗅味大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌思考题(1)为什么必须用培养24h以内的菌体进行革兰氏染色？(2)要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤？为什么？(3)根据你所用的培养条件，请你分析所检测的环境微生物将会有什么主要特点？（细菌/真菌，好氧/厌氧…?）