文章编号: 0253- 3626( 2005) 02- 0187- 04
ACEI对风湿性心脏病心房颤动患者心房
ACE、ERK 表达和纤维化改变的影响
张 � 安 , 殷跃辉
(重庆医科大学第二临床学院心内科, 重庆 � 400010)
�摘 � 要� 目的:研究风湿性心脏病(风心病)心房颤动(房颤, AF)患者用血管紧张素转换酶抑制剂( ACEI)时心房组织血管紧
张素转换酶( ACE)、细胞外信号调节激酶( ERK)表达与心房纤维化改变。方法: 35 例风心病二尖瓣狭窄接受外科手术患者,
手术时取右心耳处心房组织 400mg ,通过逆转录 � 聚合酶链反应技术, 以 GAPDH 为内参照,测量 ACE, ERK2 mRNA 变化, 用
Western Blotting观察 ACE、磷酸化 ERK( pERK)在蛋白水平表达的差异, 经 Masson 染色研究胶原纤维容积分数( CVF)改变情
况。结果: 与窦性节律患者比较,慢性房颤患者在 mRNA 水平上 ACE、ERK2 表达上调, 在蛋白水平上 ACE、pERK 表达上调
( P < 0. 01 或 P< 0. 05) , CVF 也显著增加(P < 0. 01) ; 与未应用 ACEI组比较,用 ACEI 组 ERK2 mRNA、pERK 蛋白表达下调
( P < 0. 05) , ACE 表达无差异, CVF 虽有减少趋势,但无统计学意义( P > 0. 05)。结论:风心病慢性房颤患者较窦性节律患者
ACE、ERK 表达增加,纤维化加重; 而在应用 ACEI 的慢性房颤患者, ERK2, pERK 表达有显著下降,纤维化减轻,说明在房颤
时,局部激活的肾素 � 血管紧张素系统( RAS)经 ERK 途径介导了心房纤维化, ACEI 在一定程度上减轻心房的纤维化。
�关键词� 心房颤动;血管紧张素转换酶; 血管紧张素转换酶抑制剂; 细胞外信号调节激酶;胶原纤维容积分数
�中国图书分类法分类号� R541. 202� � � � �文献标识码� A � � � � �收稿日期� 2004- 06- 22
Effects of ACEI on the expression of ACE and ERK and
the changes of atrial fibrosis in patients with atrial fibrillation
ZH ANG An , et al
( Depar tment of Car diology , The Second Col lege of Cl inical Medicine, Chongqing Medical Univer si ty )
�Abstract� Obj ective: To study the expression of angiotensin - converting enzyme ( ACE) , ex tracellular signal - r egulated kinase
( ERK) , and the changes of atrial fibr osis in patients with rheumatic heart disease( RHD) and atr ial fibrillation( AF) treated w ith an-
g iotensin- converting enzyme inhibitor( ACEI) . Methods : Atrial tissues were obtained from the r ight appendage during open surgery
in 35 patients with RHD. T he mRNA of ACE and ERK2 w ere semi- qualified by reverse transcr iption- ploymerase chain reaction
( RT- PCR) and normalized to the glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase( GAPDH) . Western blotting analysis was employed to
examine the expressions of ACE and phosphory lated ERK ( pERK) . Atrial collag en volume fraction( CVF) was detected by Masson� s
stain. Results : The mRNA of ACE and ERK2 or the protein of ACE and pERK were significantly increased, and CVF was significant-
ly increased in patients with chronic atrial fibr illation( CAF) compared with sinus rhythm g roup( SR) ( P < 0. 01 or P < 0. 05) . Com-
pared with CAF patients treated w ithout ACEI, the mRNA of ERK2 and protein of pERK were significantly decreased in CAF patients treated
w ith ACEI( P< 0. 05) , but there w as no differ ence in ACE, and decrease in CVF was not statistically significant( P> 0. 05) . Conclu-
sion: The expressions of ACE, ERK2 and pERK increase, and fibrosis is more severe in RHD patients with CAF as compared w ith those
w ith SR. Compared with CAF patients treated without ACEI, the expressions of ERK2 and pERK significantly decrease( P< 0. 05) and de-
crease in CVF is detected( P > 0. 05) in CAF pat ients tr eated with ACEI. This suggests that the incr easing expression o f ERK2 and
pERK resulting from local renal ang iotensin- converting enzyme system activation mediates the development of atr ial fibrosis, and A-
CEI may contribute to lesser atrial fibrosis in RHD patients wit h AF .
�Key words� Atr ial fibrillat ion; Angio tensin - converting enzyme; Ang iotensin- converting enzyme inhibitor; Extr acellular signal-
r egulated kinase; Collag en volume fraction
作者简介:张 � 安( 1970- � ) ,男,主治医师,硕士,
主要研究方向:心律失常。
基金项目:重庆市科委科研基金项目( 03- 8010)。
�187�重庆医科大学学报 2005年第 30卷第 2期 ( Journal of Chongqing Medical University 2005. Vol. 30 No. 2)
� � 房颤是最常见的心律失常, 随着年龄的增长其
发病率逐渐增加。房颤的发生机制复杂, 至今尚未
完全阐明。以心房间质纤维化改变为特征的组织学
重构在房颤的发生、发展和持续过程中有重要作用。
心房肌局部的肾素 � 血管紧张素系统 ( RAS)激活,
经丝裂原活化蛋白激酶( MAPK)途径介导组织学改
变是一重要机制,也是多种促增殖信号转导途径的
细胞外终点。基础和临床研究已证实 ACEI可改善
或逆转房颤时心房局部电与组织学重构。本文通过
研究房颤患者心房 ACE、ERK2和 pERK 表达与纤
维化改变, 以及 ACEI 对其表达的影响, 对进一步明
确房颤组织学重构的机制及 ACEI 逆转组织学重构
的机理将是很有帮助的。
1 � 资料与方法
1. 1 � 病例选择与分组
35 例均为 2002 年 11 月~ 2003 年 12 月住院接受开胸
换瓣手术的风心病二尖瓣狭窄患者,其中男 19 例, 女 16 例,
年龄 33 ~ 60 岁。将其分为 3 组: A 组 9 例, 为窦性节律患
者; B 组(未用 AECI) 14 例,为慢性房颤患者 (房颤持续时间
> 6 月) ,病程中未用过或间断服用 ACEI, 但术前 6 月未服
用; C 组(用 AECI ) 12例, 为慢性房颤患者(房颤持续时间> 6
月) , 病程中使用且术前 6 月内仍坚持服用 ACEI。所有患者
术前作常规心电图、超声心动图检查, 心功能均为 �~ �级
( NYHA
)。三组患者在年龄、左右房直径、右房压、二尖
瓣口面积及左室射血分数( LVEF )方面, 组间无显著性差异
( P > 0. 05)。
1. 2 � 标本采集及保存
外科手术时,于体外循环插管前, 打开右心房后立即取
右心耳组织, 取 200mg 放入甲醛中, 备 Masson 染色用, 余下
组织立即放入液氮中保存备用。
1. 3 � 心房组织总 RNA提取及逆转录 � 聚合酶链反应
( 1)总 RNA提取: 取组织 100mg, 用 T r izol试剂(上海生
物工程公司提供)提取右心耳组织总 RNA,经紫外分光光度仪
分析OD260/ OD280,所有标本OD260/ OD280比值均> 1. 8。( 2)
引物序列及设计(上海生物工程公司) :见表 1。( 3) cDNA 合
成与基因扩增: 取总 RNA 产物 5�g 作 GAPDH、ACE、ERK2
等
的浓度和循环梯度周期曲线, 确定反应体系 50�l, 包
括 10 � buffer 5�l, 10mmol/ L dNT P 4�l, 25mmol/ LMgCl2 3�l,
T aq 酶 2. 5u, cDNA 4�l(约 0. 5�g) , 引物量 25pmo l。反应条
件为 94 � 预变性 5min, 随即进入 PCR 循环, 即 94� 变性
30s,退火 30s,各目标基因退火温度分别为 65 � ( ACE)、60�
( ERK2) , 72 � 延伸 60s, 共 38 个循环, 72� 再延伸 5min。阴
性对照:反应体系中未加入模板总 RNA, 代之以去离子水,
其他均相同。( 4)电泳及图象扫描: 取扩增产物 10�l, 于 2%
琼脂糖上电泳(电压 90V ,时间 30min) , 然后于 Gel Doc 2000
凝胶成像系统( Bio- RAD)扫描, 分别测目标基因和 GAPDH
条带的 OD值比,后者代表目的基因的相对表达含量。
表 1 � 目标基因及内参照引物序列设计
基因 方向 引物序列
ACE( 297bp) 上游 5� - ACTGGTGGTATCTTCGAACC- 3�
下游 5� - GACCATGTCCTTCAGCACC- 3�
ERK2( 218bp) 上游 5� - CATCGCCGAAGCACCATTCAAG- 3�
下游 5� - GATAAGCCAAGACGGGCTGGAG- 3�
GAPDH( 376bp) 上游 5� - TCCATGACAACTTTGGCATCGTGG- 3�
下游 5� - GTTGCTGTTGAAGT CACAGGAGAC- 3�
1. 4� Western Blotting
( 1)总蛋白提取与含量测定:加入组织裂解液进行匀浆,
离心, 取上清液,以比色法进行定量。( 2)聚丙烯酰胺凝胶电
泳( SDS- PAGE) : 积层胶浓度为 5% , 分离胶浓度为 5%、
10%。蛋白质样品经稀释并煮沸后, 取同样浓度等体积的蛋
白质样品加入到样品孔中 (样品 2�l及上样 buffer2�l) , 80V
电泳至分离胶, 100V 电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。( 3)
转膜:制作好三明治, 于 4� , 电流 90mA, 电转移过夜。 ( 4)
免疫学检测: PVDF 膜经 5% (W / V )脱脂奶粉封闭后加入以
封闭液稀释的第一抗体: 鼠抗 ACE 单克隆抗体( Novocastra
Laboratories Ltd, Unided K ingdom) 1�30, 兔抗 pERK 多克隆
抗体( Santa Cruz, CA ) 1�400, 再加入辣根过氧化物标记的二
抗,经 DAB 显色, 待蛋白条带清晰后以自来水冲洗, 照相。
( 5) 结果分析: 结果用 Gel Doc 2000 凝胶成像系统 ( Bio -
RAD, 美国)对目的条带进行密度分析,蛋白含量以相对光密
度( ROD) � 面积表示。
1. 5� 统计学分析
各组数据以 �x � s 表示, 组间比较用 q检验, P < 0. 05 有
统计学意义, 使用 SPSS 软件分析。
2 � 结 � 果
2. 1 � ERK2、ACE、GAPDH 的 mRNA转录
以 100bp plus ladder 为 Marker, 3个基因的 RT
- PCR产物电泳条带的位置与理论值相符 (见图
1)。
2. 2 � 心房组织 ACE、ERK2 mRNA 相对表达量的
改变(见表 2)
与 A 组比较, B、C 两组 ACE、ERK2 显著上调
( P< 0. 01或P< 0. 05) ;与B组比较, C组ERK2有显
著下调( P< 0.05) ,而ACE无显著性差异( P> 0.05)。
2. 3 � 心房肌 pERK ( pERK1/ 2)、ACE 蛋白印迹图
(见图 2)
�188� 重庆医科大学学报 2005年第 30卷第 2期 ( Journal of Chongqing Medical University 2005. Vol. 30 No. 2)
表 2� 房颤患者心房肌 ERK2、ACE mRNA水平变化( �x � s)
组别 ACE ERK2
A组( n= 9) 0. 49� 0. 19 1. 03 � 0. 24
B 组( n = 14) 0. 67� 0. 21* 1. 39 � 0. 28* * #
C 组( n = 12) 0. 70� 0. 18* 1. 21 � 0. 27*
� � 注:与 A 组比较, * P< 0. 05; 与 A 组比较, * * P< 0. 01;
与 C 组比较, # P< 0. 05
图 1� 心房 ACE、ERK2和 GAPDH mRNA 转录水平
1、4分别为 A 组的ACE, ERK2电泳条带, 2、5 分别为B 组的
ACE, ERK2 电泳条带, 3、6 分别为 C 组的 ACE, ERK2 电泳
条带, 7 为 GAPDH
图 2 � 抗ACE 单克隆抗体和抗 pERK 多克隆抗体免疫印迹图
从左到右, 1、2为 A组, 3、4为 B组, 5、6 为 C组
图 3� ACE 和 P- ERK 相对蛋白含量
� � 注:与 A 组比较, * P< 0. 05; 与 A 组比较, * * P< 0. 01;
与 C 组比较, # P< 005
2. 4 � 心房肌 pERK( pERK1/ 2)、ACE 蛋白相对含
量(见图 3)
与A 组比较, B、C 两组 ACE、pERK 显著上调
( P< 0. 01或 P< 0.05) ;与 B组比较, C组 pERK有显
著下调( P< 0. 05) ,而ACE无显著性差异( P> 0. 05)。
2. 5 � 心房纤维化指标 CVF 的改变(见表 3)
与 A组比较, B、C两组 CVF 均显著升高( P<
0. 01) ;与 B组比较, C 组降低, 但无统计学意义( P
> 0. 05)。
表 3� 房颤患者心房 CVF( �x � s)
组别 CVF (% )
A组( n= 9) 9. 36� 1. 91
B 组( n= 14) 16. 49� 2. 01*
C 组( n = 12) 15. 71� 2. 23*
� � 注: 与 A组比较, * P < 0. 05
3 � 讨 � 论
在 RAS中, 血管紧张素 �( Ang�)是最为重要
的效应分子, Ang �的生成有三条途径: ACE 途径
(经典途径)、糜酶途径和非 ACE 非胃促胰酶途径。
据研究,在人体完整的心脏中, 血管紧张素 � ( Ang
� )的转化有 80%是经 ACE途径完成的,说明 ACE
仍是 Ang �生成的限速因素[ 1]。但在心房心室的
ACE和糜酶活性是有差异的, 右心房 ACE 活性是
左心室的 3- 4倍,右心室 ACE 活性是左心室的 2
倍,相反,心室糜酶活性是心房的 2 倍, 而左右心室
则相似[ 2] , 故对心房而言, Ang �的生成仍是以 ACE
经典途径为主。心房 ACE的表达对局部 RAS 一系
列病理生理效应有重要的影响。本研究提示,慢性
房颤患者心房 ACE 表达在 mRNA、蛋白水平升高,
与文献报道一致[ 3, 4] , 而慢性房颤时心房局部 RAS
中由于 ACE表达的增加,导致 Ang�在心房局部生
成增加,与伍炜锋等[ 4]的报道一致, 说明慢性房颤
时存在局部 RAS 的激活, 而不论循环或局部的
RAS,通过 Ang �与 AT 1 受体( AT 1R)结合, 经受体
偶联的 G蛋白途径而产生效应。Ang �与AT 1R结
合后,主要通过 Gq型 G蛋白激活磷脂酶 C激活,从
而激活相关信号通路。
本研究还发现, 慢性房颤患者心房 ERK2 在
mRNA水平以及 pERK 在蛋白水平上表达明显上
调,与有关文献报道一致[ 2, 5]。已如前述, 慢性房颤
患者心房局部生成增加的 Ang�与心房成纤维细胞
膜上 AT 1R结合后,相应生理效应增强。其间通过
了 MAPK多级信号转导, 已知 ERK 是 MAPK 途径
主要的和经典的通路, 本研究结果说明慢性房颤患
者心房局部存在 ERK 途径的激活。增加的 pERK
移位至细胞核,催化转录因子磷酸化、活化,增加调
节基因的表达和开放, 导致细胞活化, 相应功能增
�189�重庆医科大学学报 2005年第 30卷第 2期 ( Journal of Chongqing Medical University 2005. Vol. 30 No. 2)
强,如成纤维细胞分泌胶原增加,同时其分泌生长因
子,如转化生长因子- �1 ( TGF - �1 ) 也增加。而
T GF- �1 可减少基质金属蛋白酶- 1( MMP- 1)的
合成,并促进 MMP- 1的抑制物( T IMP- 1) 的合
成,从而抑制胶原降解, 促进纤维化的发生[ 6] , TGF
- �1 还可增加纤维连接蛋白和胶原在细胞外基质
的沉积[ 7] ,导致心房间质纤维化。
在纤维化方面, 也观察到慢性房颤患者 CVF 较
窦性节律组明显增加,同时,在慢性房颤患者,用 A-
CEI组较未用 ACEI组其心房 ERK2、pERK表达明
显下调,可能与 ACEI 减少局部 Ang �的生成, 减弱
后者在局部的效应, 表现为信号通路(如 MAPK 途
径)中 ERK2、pERK 表达下调, 进一步证实了慢性
房颤时心房局部 RAS 的激活, 经 MAPK 途径介导
了组织学重构。在纤维化指标方面, 用 ACEI 组较
未用ACEI组 CVF 有下降趋势, 但无统计学意义,
这可能与以下几个方面有关: � 本研究样本数量有
限; � 心房局部 Ang �的生成除了 ACE 经典途径
外,还有糜酶途径的存在,单用 ACEI只能部分抑制
其生成; � 房颤持续时间不一, ACE I只是对新的胶
原沉积、基质增加有影响,应用后对已沉积的胶原和
增加的基质影响不大,并且部分未用 ACEI 组患者,
在其病程中亦曾间断服用 ACEI。
房颤时心房间质纤维化所涉及的信号通路较为
复杂, ERK信号通路是迄今研究得最为透彻的一条
MAPK 信号通路。本研究也发现风心病房颤患者
心房 ERK 途径中 ERK2、pERK 表达和相应的纤维
化指标的增加, Ang�与 AT 1R结合后,除了经 ERK
途径产生效应外, 还可能通过其它信号转导途径。
相信通过对这些途径的深入研究, 可以进一步明确
其在房颤心房组织学重构中的作用。
参 � 考 � 文 � 献
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