手性化合物的微生物转化终

手性化合物的微生物转化人：张楠王佳宁杨广磊01一、手性分子及手性化合物的合成手性（chirality）是三维物体的基本特性。如果一个物体不能与其镜像重合，该物体就称为手性物体，这两种互成镜像的形态被称为对映体。手性分子(chiralmolecules)的立体构型即为对映体结构。手性是自然界的本质属性之一，分子手性识别在研究生命活动和生命物质产生中都起着极为重要的作用。一、手性分子及手性化合物的合成1.概念**1815年布劳特发现樟脑、月桂油等具有旋光性，建立liot-savart定律。第一个研究旋光性的人1848年巴斯德通过缓慢蒸发结晶外消旋酒石酸钾氨溶液得到两种对映体。后来，通过化学法和微生物拆分了对映异构体。Fischer发明了氢氰酸和糖的反应，得到了不同比例的氢羟化物异构体。2001年诺尔斯、夏普雷斯和野依良治获得诺贝尔化学奖他们发现了某些手性分子可用作某些化学反应的催化剂，为合成对人类有用的重要化学物开辟了一个全新的研究领域2.研究历史非生物法不对称合成法制备手性化合物手性源合成选择吸附拆分法结晶法拆分化学拆分法动力学拆分色谱分离生物法利用水解酶类微生物或酶直接转合成方法3.不对称合成反应过程不对称合成前手性原料目的产物手性中间体3.不对称合成反应过程产物手性化合物水or有机溶剂底物潜手性化合物生物催化法:是利用生物细胞的提取物也就是各种生物酶或者是直接利用活性生物细胞催化反应的方法，它的产生是由于生命科学的巨大进步和生物技术的迅速发展。生物催化的活性物质是酶，酶几乎都是具有单一催化活性的蛋白质，少数属于核酸类物质，能够催化多种反应4.目的意义充分利用生物催化技术的优点、特点更多更普遍地应用生物催化不对称合成技术制备手性化合物建立生物催化不对称合成手性化合物或其中间体的技术平台对手性化合物或其中间体的平台技术进行深入的应用基础研究揭示生物催化不对称合成反应的规律合成一系列新的手性化合物或重要中间体。5.生物催化不对称合成研究的问题★应用不够★缺少技术平台缺少高立体选择性的生物催化剂反应类型有限，底物结构有限反应的对映选择性不尽理想对生物催化反应过程缺乏了解6.生产单一对映体手性化合物的方法生物催化与手性技术7.难点底物/产物抑制的解除辅酶依赖与辅酶再生立体专一性生物催化剂发现与改造酶的来源02手性化合物的微生物转化一微生物种类所用的微生物种类包括酵母菌，细菌、霉菌等，也有用植物细胞催化前手性化合物获得手性化合物的。面包酵母廉价易得，年世界总产量达60万吨。同时，它的培养和分离也比较简单，反应时无需灭菌，只要将底物与细胞混合，在室温即可反应，对反应选择性也比较专一。面包酵母获得容易，无污染，含有的酶系多，底物广泛等。因而得到广泛的应用。细菌菌落霉菌菌落面包酵母菌落二微生物不对称合成的优势微生物中含有多种多样的酶不需要进行酶的提纯、添加辅酶等通过微生物整细胞内的酶系进行转化，不需要对酶进行提纯，也不需额外添加昂贵的辅酶，因而减少工序并降低成本。用糖作为能量供体保持辅酶再生循环氧化还原酶辅酶再生的解决办法水-溶剂双相体系解除底物抑制非水相生物催化利于产物的分离和提取底物抑制与溶解度问题羰基还原酶催化不对称还原反应水-溶剂双相体系解除底物抑制立体选择性微生物转化反应属于酶的催化反应,保持了酶催化反应所具有的高度立体选择性它不仅对结构有化学选择性和非对映异构体选择性,并且有严格的区域选择性和对映异构体选择性。对手性药物合成来说,具有严格的立体结构选择性非常重要。三提高微生物立体选择性的方法催化剂最重要的性质不是它的活性，而是其选择性，然后是稳定性生物催化剂的最大优势在于它们无以比拟的选择性，尤其是其对映异构体选择性筛选高立体选择性的生物催化剂对产酶微生物细胞进行预处理控制微生物细胞的生理状态固定化微生物细胞筛选适宜的底物添加共底物或抑制剂选择合适的反应体系不同种类的生物催化剂（酶或其细胞）作用于同一种底物可产生不同对映体的产物可用于还原羰基化合物的微生物种类很多，包括各种细菌，放线菌，酵母，霉菌应该根据不同产物要求筛选不同的产酶菌株筛选高立体选择性的生物催化剂筛选得到的产酶菌株往往对映异构选择性不能满足要求有时可以用加热、调pH、添加表面活性剂等方法进行预处理改善其对映异构选择性对产酶微生物细胞进行预处理微生物的生理状态不同在催化不对称还原时的产物手性醇构型有可能不一样调节细胞的生理状态有可能获得理想构型的产物AllanC.Dahl等人曾报道：厌氧发酵状态的酵母在高底物浓度时可将3-氧-酯还原为D-型3-羟-酯，有氧状态下生长的酵母在低底物浓度时可将3-氧-酯还原为L-型3-羟-酯控制微生物细胞的生理状态固定化微生物细胞固定化微生物也会影响不对称还原反应的立体选择性如:KaoruNakamura等人报道游离面包酵母还原β-酮酯生成D-羟酯，而固定在藻酸镁中的面包酵母还原β-酮酯则生成L-羟酯潘冰峰等人采用二甲基硅橡胶包埋白地霉菌体与游离菌体转化β-羰基苯丙酸乙酯生成(R)-β-羟基苯丙酸乙酯对比时，固定化后产物的对映体过剩值从49%提高到81%ee。底物分子结构中前手性碳原子周围的基团不同，对产物的手性构型有很大影响产物手性的构型主要取决于羰基酯基团中烷基链的长短，当烷基链很短(<2个C)时，产生S-型醇，当烷基链长一些(>5个C)时产生R-型醇筛选适宜的底物在反应体系中添加不同的共底物，有时会对产物的构型引起变化如AllanC.等人报道用面包酵母还原羰基酯时，以蔗糖为共底物产物为R-型醇，以葡萄糖为共底物产物为S-型醇可选用的共底物还有甘油，甲醇，乙醇，2-丙醇，,正丁醇，葡萄糖酸内酯等在反应体系中加入某些抑制剂可抑制某一种构型酶(R-型或S-型酶)的活力，使产物的另一种对映体大量生成不对称还原所使用的抑制剂有烯丙基醇，烯丙基溴，α,β不饱和羰基化合物，金属盐(氯化镁)，氯乙酰乙酯，五羟黄酮等添加共底物或抑制剂选择合适的反应体系相同酶在不同有机溶剂体系反应所得产物的构型相反生物催化的不对称性（Stereochemistry）早有报道不同的有机溶剂体系中会产生不同构型的手性产物选取合适有机溶剂有可能改变产物构型，或提高产物光学纯度03手性化合物微生物转化的应用微生物催化不对称还原反应的工业应用微生物转化法通过微生物细胞内的酶系进行转化,不需要对酶进行提纯,也不需额外添加昂贵的辅酶,因而减少了工序并降低了成本,但发酵终产物较为复杂,副产物相对增加。优点(1)有利于提高酶的稳定性,延长催化剂的使用寿命(2)可以降低生产成本。(3)简化工艺;(4)对于较复杂的反应,微生物可利用其体内精巧的酶系进行催化,避免副产物的形成;(5)由于微生物细胞内含有辅助因子,其优点更为明显。微生物催化不对称还原反应的转化方法微生物催化不对称还原反应的工业应用生物催化不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯江南大学研究了水/有机溶剂两相体系中整细胞催化不对称还原，在没有添加辅酶和葡萄糖脱氢酶的条件下，产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在单一水相系中的浓度20.3g/l。在两相体系中，有机相产物浓度达到了56.8g/l，摩尔转化率为94.8%，产物光学纯度均大于97%e.e.手性卤代羟基酯链接：美国环保局（EPA）鉴定一项绿色化学研发课题，降低胆固醇药物Lipitor用关键手性砌块[(R)-4-氰基-3-羟基腈(HN)]的酶法制备工艺，该项目由美国Codexis公司、Merck公司和哥伦比亚州Missouri大学共同开发。微生物催化不对称还原反应在手性合成中的研究实例1微生物转化合成苯乙醇苯乙酮还原反应原理面包酵母细胞中存在氧化还原酶和脱氢酶，在辅酶NAD(P)H的参与下，面包酵母通过这两种酶可以实现对各种前手性酮分子中羰基的还原，形成相应的手性醇分子得到的手性苯乙醇以S-型构型为主，且反应的转化率最高大约为35%；产物e.e.值比较高，基本保持在95%以上，反应立体选择性高面包酵母还原苯乙酮反应曲线2微生物转化合成(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯摩尔转化率达到89.7%，总的产物达到26.9g/L,对映体纯度85.6%e.e,重结晶产物的e.e.值可达到97.3%添加树脂耦合转化工艺时间曲线(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯是单胺氧化酶-A抑制剂贝氟沙通（Befloxatone）的手性中间体3羰基还原酶催化不对称还原反应制备(R)-硫辛酸α-硫辛酸被称为“万能抗氧化剂”。在医药、保健食品与食品添加剂、化妆品及其它方面有广泛应用。●R-硫辛酸是人体内硫辛酸的天然形式S-硫辛酸在人体内不具有活性目前混旋硫辛酸的市场报价在250元/公斤，而R-硫辛酸达到2000-3000元/公斤●在R型硫辛酸关键手性中间体的反应之中主要可以采用三种方法进行,即全细胞转化法、纯化酶转化法及基因工程菌转化法。4微生物转化法制备(RM-)-扁桃酸甲酯微生物法不对称还原制备(R)-(-)-扁桃酸甲酯水/有机溶剂两相体系:利用该体系进行生物转化反应能有效地解决底物在水相中溶解度低,底物浓度高对细胞毒性和酶的抑制等问题水/机溶剂两相体系中B5微生物细胞催化苯甲酰甲酸甲酯生成(R)-(-)-扁桃酸甲酯不对称还原反应的最大摩尔转化率和产物(R)-(-)-扁桃酸甲酯的光学纯度分别达到了60.8%和100%讨论和建议有专家认为国外在手性化合物（药物）的开发与研究方面已取得了可喜成绩，但我国目前还没有一个真正属于自己创新的手性药物进入临床和生产阶段。建议●首先要提高手性制备技术，研究实用的手性合成方法，特别是发展生物催化制备技术。●建议将研究及开发手性催化剂、手性骨架、手性中间体等作为重点。●另外，研究及开发理想的光学结晶剂、不对称化学触媒、手性辅料性溶剂、手性醇、手性酸、手性碱等，有重要前景。能以较低的生产成本，大量生产商品化手性化合物。前景与展望关于手性生物催化平台技术的研究已取得突破性进展许多微生物新酶的发现、表征，及酶分离、稳定化与应用方法不断增加；重组技术为生物催化剂改造和应用提供了简单而方便的技术手段；生物催化体系已经扩展到非水相，使许多有机化合物从不溶变为可溶，或者使一些合成反应从不可能变为可能；手性生物催化平台技术的更进一步发展将有待于有机化学、化学、生物化学、分子生物学、微生物学和工程学等众多领域的交叉结合，手性生物催化平台技术的应用将会呈现更美好的前景。Thankyou！**