谷胱甘肽中文概述

谷胱甘肽1谷胱甘肽（GSH）结构与功能1.1GSH的结构特征1.2GSH的生理功能和应用1.3总谷胱甘肽测定方法2几种谷胱甘肽的方法2.1比色法2.2荧光法2.3高效液相色谱法（HPLC）2.4DTNB法2.5碘量法3几种谷胱甘肽的制备方法3.1　溶剂提取法3.1.1　谷胱甘肽的提取3.1.2　谷胱甘肽的分离纯化3.2　化学合成法3.3　酶合成法3.4　发酵法谷胱甘肽（Glutathione）1谷胱甘肽（GSH）结构与功能1.1GSH的结构特征GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键形成，分子中有一特殊的γ-肽键，即由谷氨酸的γ-COOH与半胱氨酸的α-NH2缩合成的肽键，它不同于蛋白质分子中的普通肽键。GSH为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。2分子GSH脱氢后以二硫键相连形成氧化型谷胱甘肽（GSSG），又称谷胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶于水的白色晶体。胱甘肽的相对分子质量为307.33;熔点为189～193℃(分解);溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺,不溶于醇、醚和丙酮;谷胱甘肽固体较为稳定,水溶液在空气中则易被氧化[5]。两分子GSH的活泼巯基氧化脱氢转变为一分子GSSG,但只有GSH才具有生理活性。1.2GSH的生理功能和应用GSH分子含有γ-谷氨酰基和活性巯基，是GSH许多重要生理功能的结构基础。GSH在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。GSH还广泛存在于其它正常细胞中，有很强的亲和力，能与多种化学物质及其代谢物结合，清除体内氧自由基及其它自由基，具有保护肝细胞膜、促进肝酶活性、抗氧化、解毒等作用，是人体细胞内的主要代谢调节物质。GSH还在蛋白质和DNA合成、物质运输、酶活性、新陈代谢及细胞保护等生物学功能中起着直接或间接的作用。它还是许多酶反应的辅基，可作为抗氧化剂保护生物分子蛋白的巯基，清除体内过多的自由基，参与体内三羧酸循环及糖代谢，具有解毒、预防糖尿病、癌症及消除疲劳等作用GSH广泛应用于食品领域，如加入酸奶和婴儿食品起类似维生素C的稳定作用；防止水果罐头水果褐变在面制品中起还原和强化氨基酸作用；缩短面包混揉时间GSH在与谷氨酸钠、核酸系呈味物质或其混合物共存时具有肉类风味；GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品的核酸分解，1.3总谷胱甘肽测定方法(营养学报)NADP2GSHDTNB↑↑GR↓↓H++NADP(NADPH)GSSG2TNB+2H+NADP(NADPH):氧化型（还原型）辅酶IGR:谷胱甘肽还原酶在次反应中，NADPH量逐渐减少，TNB量逐渐增加，TNB在412nm吸收增加的速率与总GSH量呈正比。由于GSH和GSSG循环交替，周而复始总量不变，故称此为循环法。2几种谷胱甘肽的检测方法2.1比色法郭黎平等[6]{郭黎平，刘国良，张卓勇，等.铜（Ⅱ）-新铜试剂-谷胱甘肽乙醇体系显色反应研究[J].光谱学与光谱分析，2000，20（30）：412-414.}在测定大豆提取液中谷胱甘肽的含量时，发现在铜（Ⅱ）-新铜试剂-谷胱甘肽-乙醇体系中测定谷胱甘肽的含量，乙醇具有明显的增敏作用。采用CuSO4溶液和新铜试剂混合液[Cu2+-新铜试剂（1：2.5，摩尔比）]作为显色剂，检测波长为456nm，检测限为2.0ug/ml，线性范围为2.0~24ug/ml,回收率为99.54%，RSD为0.76%。赵旭东等[2]{赵旭东，魏东芝，万群，等，谷胱甘肽的简便测定法[J].药物分析杂志，2000，20（1）：34-37}根据甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应速度的不同，提出了在含有其它巯基物质溶液中测定谷胱甘肽含量的方法，通过控制两个相同供试品和甲醛的不同反应时间，测定两者在波长为412nm时的吸收度，根据两者不同的吸收度值得出谷胱甘肽的含量。线性范围为0.19~0.95g/L,回收率为96.7%,方法的结果误差小于0.5%。该方法实验成本低，分析快速、简单，适于测定生物合成反应液中谷胱甘肽的含量。2.2荧光法曹新志等[7]{曹新志，陈彦.荧光法测定黄瓜中的谷胱甘肽[J].资源开发与市场，2000，16（5）：272-273。}采用邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde,OPT）作为络合剂，在磷酸缓冲液（pH8.0)中，应用荧光分光光度计来测定黄瓜中谷胱甘肽的含量。检测限为0.1ug/ml，线性范围为0.1~40ug/ml,回收率为99.73%，RSD为1.24%。Hissin等[8]选用OPT作荧光剂，采用偏磷酸-磷酸钠-EDTA缓冲溶液（pH8.0），用以测定哺乳动物心脏和肝脏中谷胱甘肽的含量，谷胱甘肽的检测限为0.05umol，线性范围为0.05~0.8umol,RSD为4%。张建莹等[9]{张建莹，齐剑英等，锌离子增强荧光光谱法测定谷胱甘肽[J].暨南大学学报，2004，25（1）：88-91}探讨了金属离子对还原型谷胱甘肽（GSH）-邻苯二甲醛（OPA）体系荧光信号的影响，实验结果表明Zn2+对体系的荧光信号有增强作用，而且Zn2+能够提高GSH-OPA体系的稳定性，据此建立了一种以Zn2+作为荧光增强剂，快速简便测定还原型谷胱甘肽的新方法。GSH在1.3×10-8~1.4×10-6mol/L的范围内其浓度与体系相对荧光强度有良好的性关系，检出限为1.1×10-8mol/L.本实验方法比较适合生物样品中还原型谷胱甘肽浓度的测定。2.3高效液相色谱法（HPLC）HPLC是近年测定复杂生物样本中各种巯基物的最好主法。HPLC过程是溶质在固定相和流动相之间由于分配系数、吸附能力、亲和力、分子大小不同，进行连续分离的过程。HPLC法优点是可以区分开GSH、GSSG及20多种含巯基氨基酸衍生物。其不足是灵敏度不高，样本中GSH含量不得低于50umol/L；且样本的前处理过程耗时，测定大样本时不方便，所用的柱特殊[5]{攀跃平，于健春等，谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、，中国临床营养杂志，2003，11（2）：136-139}。A.Rodrigueuz-Ariza等[10]ArizaAR,ToribioF,BareaJL.RapiddeterminationofglutathionestatusinfishLiverusinghigh-performanceliquidchromatographyandelectrochemicaldedection[J].JournalofChromatographyB,1994,656:311-318介绍了一种结合电化学法快速测定谷胱甘肽水平的方法。该法应用一套双通道电化学测定仪,可同时测定GSH、GSSG还可测定PSSG(蛋白结合谷胱甘肽),具有高灵敏度、高选择性、高效的优点。Chung-shiYang等介绍了一种将HPLC与微透析机联机测定谷胱甘肽。此法缩短了分析测定时间，简化了样本的准备过程，并提供了连续的监测[5]{攀跃平，于健春等，谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价，中国临床营养杂志，2003，11（2）：136-139}程敬君等采用KCI溶液-HCI溶液-甲醇-EDTA为流动相，电化学检测器（工作电极为玻碳电极，参比电极为Ag/AgCI,工作电压为0.9V），测定鼠脑微透析液中谷胱甘肽的含量，检测限为10nmol/L,回收率为87.3%,RSD为1.8%。Brent等用甲醇和乙酸钠溶液（pH7）作为流动相，对苯二醛（Orthophthalaldehyde，OPA）和谷胱甘肽络合生成一种高荧光的三元环衍生物，荧光检测器，检测限为0.1pmol，线性范围0.1~200pmol,谷胱甘肽的回收率为99.2%，RSD为1.2%。该方法线性范围较宽,而且稳定性较高，适于测定混合组分中谷胱甘肽含量[11]{杨培慧，齐剑英，冯德雄，蔡继业.谷胱甘肽的应用及其检测方法[J].中国生化药物杂志，2002，23（1）：52-54}2.4DTNB法GSH和DTNB反应生成黄色的5-硫代-2硝基苯甲酸，在412nm波长有最大吸收峰。方法：样品1式2份，pH8.0条件下分别和甲醛反应2min和60min，各取1mL加入5mLDTNB溶液，25℃反应5min后分别测定在波长412nm的吸光度，算出2者的差值△A，代入曲线计算得出谷胱甘肽含量。得到谷胱甘肽浓度在0.19~0.95gL-1之间线性关系良好，回归方程为：Y=0.7154X-0.0004，r=0.9999，最大误差不超过6%。本方法成本低廉，简单易行，特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析[2]{赵旭东，魏东芝，万群等，谷胱甘肽的简便测定法}。DTNB法中，反应显色后30min以内光密度未见降低，显色稳定。相对误差可以控制在2%以内，相对标准偏差可以控制在4%以内，说明这种方法的准确度和精密度较高，且半胱氨酸不干扰测定结果。刘娟等[15]{刘娟，王雅琴等.发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定方法的改进及其比较[J].北京化工大学学报，2004，31（3）：35-38}对此方法应用于发酵液中还原型谷胱甘肽的测定稍作改进如下：将分样品0.5mL加入1.5mL0.15mol/LNaOH溶液中，摇匀，加入体积分数φ=0.03，甲醛0.5mL，摇匀，静置2min。加入2.5mLDTNB分析溶液，摇匀，在25℃水浴保温5min，测定在波长412nm处的吸光度A，通过计算或从标准曲线上得出相应GSH浓度。DTNB法经改进后，其灵敏度比原先提高了三倍。另外，蓝金贵等报道了一种快速、简便和廉价的谷胱甘肽（GSH）含量测定的新方法。利用GSH的还原性将磷钼杂多酸还原成磷钼杂多蓝，在710nm最大吸收波长处测其吸光度，吸光度与GSH的浓度在3.3×10-7-1.3×10-4mol/L范围内呈线性关系，相关系数r=0.9982,方法检测限为1.6×10-7mol/L，相对标准偏差RSD=1.1%（n=6），回收率为97.1%-103.5%。该法应用于药品中GSH含量的直接测定，结果满意。2.5碘量法2.5.1原理:本法是利用GSH的还原性与碘酸钾反应,当GSH全部反应完时,碘酸钾将碘化钾氧化为碘,碘使淀粉指示剂变为蓝色,即为滴定终点。碘酸钾消耗量与GSH的含量成正相关,由此制作标准曲线。再用碘酸钾滴定以不同方法提取的被测样品,根据所消耗碘酸钾的量(mL),从曲线上找出相应的GSH质量浓度(g/L),计算每g干酵母中GSH的质量分数。2.5.2制作GSH标准曲线:首先配制1g/L的GSH标准溶液,然后取GSH标准溶液于250mL锥形瓶内,加入5mL质量分数2%的偏磷酸溶液、1mL质量分数5%的碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂,用0.0001mol/L的碘酸钾溶液滴定至溶液由无色变为蓝色止,记录碘酸钾体积(如表2所示)。重复2次,取平均值,以GSH质量浓度(g/L)为横坐标,碘酸钾消耗量(mL)为纵坐标,制作标准曲线,3　几种谷胱甘肽的制备方法由于谷胱甘肽具有重要的生理功能和广泛的市场前景,因此,谷胱甘肽的工业化生产越来越受到关注。日本早在20世纪50年代就开始研制,90年代已投入生产,中国对谷胱甘肽的研究还处于起步阶段,还没有批量生产能力。谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂提取法、化学合成法、酶合成法和发酵法。3.1　溶剂提取法溶剂提取法主要是以富含谷胱甘肽的小麦胚芽和酵母等为原料,通过添加适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶处理,再经分离纯化后精制而成。溶剂提取法生产谷胱甘肽早已工业化,但该法生产工艺比较落后,生产规模小且产量低,而且产品质量不高。因此,未来研究的重点应该放在提高提取效率以及选择适宜的纯化方法以提高产品的质量和产量。3.1.1　谷胱甘肽的提取溶剂提取法生产谷胱甘肽使用的溶剂主要有水、稀醇和有机酸溶剂等,其中以热水提取的方法最为理想,其特点是操作简单、抽提液中谷胱甘肽质量浓度高、经济且无污染。刘国琴等[20]以脱脂小麦胚芽粉为研究对象,用热水、甲酸和乙醇浸提溶剂提取谷胱甘肽,结果表明热水浸提是最理想的方法。安贤惠[21]以安琪活性干酵母为研究对象,用热水抽提、甲酸抽提、乙醇抽提、低温抽提方法提取谷胱甘肽,结果表明热水抽提法的提取效率最高。3.1.2　谷胱甘肽的分离纯化要制取高纯度的谷胱甘肽还需进一步在提取法中组合离子交换层析和吸附层析等方法进行纯化。周惠明等[22]采用离子交换分离法,对经膜分离后得到的小麦胚芽水溶性提取物透过液中的谷胱甘肽进行了纯化和富集,谷胱甘肽浓度提高近2倍;邱雁临等[23]以壳聚糖作为吸附剂,通过吸附层析法从啤酒废酵母泥抽提液中分离纯化谷胱甘肽,在最适吸附条件下,回收率为79.55%。3.2　化学合成法化学合成法是以谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸等为原料合成谷胱甘肽的方法。目前谷胱甘肽的化学合成生产工艺已较成熟,但它存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂等缺点,更重要的是通过化学合成法得到的谷胱甘肽是左旋体和右旋体的混合物,需要进行光学拆分,分离十分困难,由此造成了产品纯度不高,并且存在着环境污染等问题,因此限制了其应用[8]3.3　酶合成法酶合成法是以L2谷氨酸、L2半胱氨酸及甘氨酸为底物,利用生物体内的天然谷胱甘肽合成酶,并添加少量ATP来合成谷胱甘肽的方法[24]。谷胱甘肽合成酶大多取自酵母菌和大肠杆菌。肖强等[25]以通过特定诱变筛选的能高产含GSH2I和GSH2II的CGMCC1231菌株为酶源,以L2谷氨酸、L2半胱氨酸、甘氨酸为底物,并加入葡萄糖和硫酸镁,酶促合成生产谷胱甘肽,分离纯化的产品收率为45%～58%,谷胱甘肽含量质量分数≥98%。吴梧桐等[26]筛选出具有高产谷胱甘肽的菌株(CGMCCNo.1917),通过固定化细胞技术,酶法合成谷胱甘肽,总收率以半胱氨酸计为85%以上,产品纯度质量分数在98%以上。酶转化法生产谷胱甘肽工艺明确,产品纯度较高,但是操作较复杂,而且需要底物氨基酸和昂贵的ATP,因此成本较高,目前还在实验研究阶段。3.4　发酵法发酵法是以廉价的糖类为原料,利用特定微生物体内物质的代谢将廉价原料转化为谷胱甘肽的方法。发酵法生产谷胱甘肽的微生物大多是酵母和大肠杆菌。发酵法与以上3种方法相比具有明显优势,如反应条件温和、成本低、生产速率快等。但是由于谷胱甘肽是胞内产物,含量不高,因此,发酵法生产谷胱甘肽的关键技术在于如何提高细胞密度及胞内谷胱甘肽含量[27]。目前发酵法已成为生产谷胱甘肽最普遍的方法。刘娟等[15]{刘娟，王雅琴等.发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定方法的改进及其比较[J].北京化工大学学报，2004，31（3）：35-38}对此方法应用于发酵液中还原型谷胱甘肽的测定稍作改进如下：将分样品0.5mL加入1.5mL0.15mol/LNaOH溶液中，摇匀，加入体积分数φ=0.03，甲醛0.5mL，摇匀，静置2min。加入2.5mLDTNB分析溶液，摇匀，在25℃水浴保温5min，测定在波长412nm处的吸光度A，通过计算或从标准曲线上得出相应GSH浓度。DTNB法经改进后，其灵敏度比原先提高了三倍。