铅镉联合暴露对大鼠肾脏的氧化损伤

　　收稿日期 :2008212204 　　基金项目 :江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人培养对象 基金资助项目 (2006) 　　作者简介 :卞建春 (19652) ,男 ,副教授 ,博士。 　　3 通讯作者 铅镉联合暴露对大鼠肾脏的氧化损伤 卞建春 ,王 　林 ,陈大伟 ,刘学忠 ,顾建红 ,卓丽玲 ,刘宗平 3 　(扬州大学 兽医学院 ,江苏 扬州 225009) 摘要 :采用饮水对大鼠进行铅 ( Pb) 300 mg/ L 、镉 (Cd) 50 mg/ L 单独和联合 ( Pb + Cd) 300 mg/ L + 50 mg/ L 染毒 8 周 ,通过检测肾脏皮质组织抗氧化指标和超微结构的变化来探讨铅镉对大鼠肾脏的毒性损伤及其机理。结果 明 ,Pb、Cd 单独或联合染毒使肾脏皮质组织超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH2Px) 活性和还原型 谷胱甘肽 ( GSH)含量显著或极显著低于对照组 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ,以铅镉联合组降低幅度最大 ( P < 0. 01) ;3 个染毒组丙二醛 (MDA)含量显著或极显著高于对照组 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ,联合组升高幅度最大而极显著高于 单独染毒组 ( P < 0. 01) 。超微结构发现 ,铅镉染毒导致线粒体肿胀、膜损伤、嵴断裂或消失 ,联合组损伤程度重于单 独染毒组。表明氧化损伤是 Pb、Cd 肾脏毒性的机制之一 ,其联合毒性表现为协同效应。 关键词 :铅 ;镉 ;氧化损伤 ;肾脏 ;线粒体 中图分类号 :S85619 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :100524545 (2009) 1221617203 Effects of exposure to lead and cadmium on the oxidative damage of kidney in rats Bian J ian2chun ,WAN G Lin ,CH EN Da2wei ,L IU Xue2zhong , GU Jian2hong ,ZHUO Li2ling ,L IU Zong2 ping 3 　( Col lege of V eteri nary Medici ne , Yan gz hou U ni versi t y , Yan gz hou , J i angsu 225009 , Chi na) 　　Abstract :Lead acetate (300 mg/ L) and/ or cadmium chloride (50 mg/ L) were administered as drinking water to rat s for eight weeks. Antioxidant indices and ult rast ructural findings in the renal cortex were detected to investigate the toxicological effect s of the heavy metals on the kidney of rat s. It indicated that activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase ( GSH2Px) ,content s of reduced glutathione ( GSH) in the exposed group s were significantly lower than those in the coadminist rated group ( P < 0. 05 or P < 0. 01) and the most remarkable changes occurred in the coadminist rated group ( P < 0. 01) . Meanwhile ,content s of malondialdehyde (MDA) in these exposed group s increased remarkably ( P < 0. 05 or P < 0. 01) ,which content in the combined group was markedly higher than that in the single group ( Pb or Cd) ,respectively ( P < 0. 01) . Ult rast ructurally ,mitochondria damaged with swelling , vacuole2like changes ,lesions of mitochondrial membrane ,disappearance and f ragmentation of carina following the ex2 posure of lead and/ or cadmium were observed. Also ,the lesion of the ( Pb + Cd) group was severer than that in the single ( Pb or Cd) group . Thus it can be seen that oxidative damage is one of Pb/ Cd2induced nephrotoxicity and syn2 ergistic effect lied in the coadminist ration. 　　Key words :lead ;cadmium ;oxidative damage ;kidney ;mitochondria3 Corres ponding author 　　铅 ( Pb) 、镉 (Cd)为广泛存在于自然界中的慢性 蓄积性毒物 ,主要通过职业性接触和环境污染对人 类和动物健康造成威胁。近代工业的发展和人类的 各种活动使生存环境受到了广泛 Pb、Cd 单独或联 合污染 ,小剂量持续进入机体可引起多种组织器官 损伤[ 1 ] 。肾脏是 Pb、Cd 毒性损伤的主要靶器官之 一 ,近年来关于铅、镉单独对动物肾脏毒性损伤的报 道较多[ 225 ] ,但其联合对肾脏毒性的研究较少。研究 表明 ,铅镉肾毒性的联合效应存在品种和年龄的差 异 ,对山羊和哺乳期乳鼠的肾脏表现为拮抗效 应[627 ] ,对青年大鼠肾脏则为协同毒性效应[ 8 ] 。关于 毒性损伤机理 ,多数研究表明 Pb、Cd 毒性损伤与氧 化应激密切相关 ,通过破坏自由基代谢平衡和抗氧 化系统的功能 ,铅、镉使机体发生脂质过氧化反应而 导致氧化损伤[2 ,5 ,9210 ] ;但关于铅镉联合对肾脏损伤 的毒性机制尚未完全阐明。本研究采用 Pb、Cd 单 独和联合对 SD 大鼠进行亚慢性饮水染毒 ,通过检 7161　中 国 兽 医 学 报 　2009 年 12 月 　第 29 卷 　第 12 期 　Chin J V et S ci 　Dec. 2009 　Vol. 29 　No. 12 　 测肾脏皮质抗氧化功能和超微结构的变化来探讨铅 镉对大鼠肾脏的毒性损伤 ,为揭示铅镉对肾脏的联 合毒性作用机理提供依据。 1 　与方法 1. 1 　实验动物及处理 　40 日龄 SPF 级雌性 SD 大 鼠 24 只 (扬州大学比较医学中心提供) ,体质量 (110 ±5. 5) g ,随机分为 4 组 ,每组 6 只 ,分别为对照组 , 镉染毒组 (50 mg/ L) ,铅染毒组 (300 mg/ L ) 和铅镉 联合染毒组 ( 50 mg/ L + 300 mg/ L ) 。将醋酸铅 (PbAC2 )和氯化镉 (CdCl2 ) (Sigma 产品)用超纯水 (电 阻率为 18. 2 mΩ/ cm)配制 ,自由饮水染毒 ,对照组自 由饮用超纯水。试验前进行适应性分笼饲养 1 周 ,试 验动物自由采食常规饲料 ,室温 (22 ±2) ℃。每天记 录饮水量 ,每周称体质量 1 次 ,连续染毒 8 周。 1. 2 　样品采集 　染毒结束 ,将大鼠处死 ;摘取肾脏 , 剥离被膜后 ,准确称取 0. 2 g 左右的肾脏皮质 ,加入 0. 1 mol/ L 磷酸盐缓冲液 ,置冰浴用高速电动匀浆 机制备 10 %组织匀浆 ,待测。 1. 3 　检测指标与方法 1 . 3 . 1 　肾脏皮质匀浆指标 　主要检测超氧化物歧 化酶 (SOD) (黄嘌呤氧化酶法) 、谷胱甘肽过氧化物 酶 ( GSH2Px) (D TNB 比色法) 、丙二醛 ( MDA) (硫 代巴比妥酸比色法) 、还原型谷胱甘肽 ( GSH) (D T2 NB 比色法) ,试剂盒由南京建成生物工程研究所提 供。 1 . 3 . 2 　线粒体超微结构的观察 　迅速采集刚处死 大鼠的肾脏皮质组织 (切成约 1 mm3 小块) ,用新鲜 配制的 25 g/ L 戊二醛溶液固定后 ,按常规制备超薄 切片 ,在 J EM2100CX Ⅱ型透射电镜下观察并拍照。 1. 4 　统计 　所有数据采用 x— ±sx—表示 ,采用 SPSS13. 0 软件进行单因素方差分析。 2 　结果 2. 1 　肾脏皮质 SOD、GSH2Px 活性与 GSH、MDA 含 量 　结果见表 1。与对照组比较 , Cd、Pb 组 SOD、 GSH2Px 活性和 GSH 含量均显著或极显著降低 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) , MDA 含量显著升高 ( P < 0105) ;联合染毒组 4 项指标均与对照组有极显著差 异 ( P < 0. 01) 。其中 ,Cd 组、Pb 组和联合组 SOD 活 性分别低于对照组 10. 3 %、8. 6 %和 16. 6 % ; GSH2 Px 活性分别低于对照组 30. 4 %、29. 9 %和 45. 5 % ; GSH 含量分别低于对照组 34. 8 %、29. 9 % 和 4216 % ;MDA 含量分别高于对照组 47. 9 %、49. 6 % 和 100. 8 %。由此可见 ,染毒后 ,联合组的变化幅度 最显著 ; 各项指标中 , MDA 含量升高幅度最大 , GSH2Px 活性降低幅度次之 , GSH2Px 与 GSH 的变 化趋势一致。 表 1 　染毒后肾脏皮质组织生化指标 ( x—±sx— , n = 6) 组别 SOD/ (U ·mg - 1) GSH2Px/ (U ·mg - 1) MDA/ (mmol ·kg - 1) GSH/ (mg ·g - 1) Cont rol 115. 73 ±5. 71 25. 47 ±3. 71 1. 214 ±0. 118 48. 01 ±7. 58 Pb 105. 76 ±4. 24 3 17. 86 ±3. 48 3 3 1. 810 ±0. 249A 3 33. 66 ±2. 72 3 3 Cd 103. 83 ±6. 26 3 17. 72 ±2. 09 3 3 1. 786 ±0. 291A 3 31. 32 ±3. 23 3 3 Pb + Cd 96. 462 ±5. 99 3 3 13. 87 ±3. 45 3 3 2. 428 ±0. 301 3 3 27. 55 ±5. 56 3 3 　　注 :与对照组比较 , 3 表示 P < 0. 05 , 3 3 表示 P < 0. 01 ;铅、镉单独染毒组与联合组比较 ,A 表示 P < 0. 01 2. 2 　肾脏皮质线粒体超微结构的变化 　与对照组 相比 ,铅、镉单独染毒后 ,部分线粒体肿胀、嵴断裂 , 严重者嵴消失而线粒体内部结构模糊 ;铅镉联合染 毒后 ,线粒体损伤程度重于单独染毒 ,大部分线粒体 不完整 ,内部结构模糊 ,嵴排列紊乱 (图 1) 。 3 　讨论 氧化应激被认为是 Pb、Cd 致肾毒性的一个重 要机制 ,它们引起的器官损伤与脂质过氧化密切相 关[2 ,5 ,11 ] 。研究表明 ,Pb、Cd 进入机体后可诱导氧自 由基的过量产生而对机体造成氧化损伤[ 11212 ] ,同时 Pb、Cd 在体内可与还原性巯基 (2SH) 结合以拮抗富 含巯基的 SOD、GSH2Px、还原型谷胱甘肽 ( GSH) 等 ,从而削弱机体对脂质产物的氧化代谢能力 ,导致脂质过氧化作用增强[3 ,12 ] 。GSH 是巯基化合物中最重要的抗氧化剂 ,它首先与进入机体的 Pb、Cd 离子结合形成复合物以保护细胞膜及细胞内的巯基蛋白质和巯基酶免受氧化损伤 ;同时 GSH 还可以与自由基直接作用 ,发生单电子反应 ,形成 GS ,进而形成GSSG ,阻断自由基反应[12 ] 。GSH 缺乏会引起GSH/ GSSG比例发生变化 ,这样就导致了氧自由基的过量产生[13 ] 。因此 ,细胞内的 GSH 是防止铅、镉毒性损伤的第一道防线[3 ] 。本研究发现 ,铅镉单独或联合染毒 8 周 ,大鼠肾脏皮质匀浆中 GSH 含量均极显著低于对照组 ( P < 0. 01) ;联合染毒组 GSH 含量下降幅度最大 ,其含量仅为对照组的 57. 4 % , GSH 8161 　中 国 兽 医 学 报 　2009 年 12 月 　第 29 卷 　第 12 期 　Chin J V et Sci 　Dec. 2009 　Vol. 29 　No. 12 　 图 1 　透射电镜观察结果 　A. 对照组 ;B. 铅组 ;C. 镉组 ;D. 铅镉联合组 ;a. 线粒体肿胀 ;b. 线粒体嵴断裂 ; c. 线粒体嵴消失 过多耗竭可能是铅镉联合毒性损伤加重的原因之 一。同时 ,Pb、Cd 染毒后肾脏皮质组织中抗氧化酶 SOD、GSH2Px 活性均显著或极显著降低 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ,且以联合染毒组降低幅度最大 ( P < 0. 01) ,表明 Pb、Cd 染毒后机体不能及时清除产生 的自由基毒性产物而导致其蓄积。MDA 为脂质过 氧化反应的分解产物 ,可以间接反映脂质过氧化程 度 ;其含量高低是衡量细胞膜磷脂氧化损伤程度的 生物标志物[14 ] 。本研究中铅镉染毒后毒性产物 MDA 含量显著或极显著高于对照组 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ,进一步表明铅镉的肾毒性与脂质氧化损 伤密切相关 ,这与相关报道一致[2 ,5 ,11 ,13 ] 。 细胞能量合成障碍往往是细胞损伤及坏死的重 要原因 ,而线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化作 用生成 A TP ,供给组织细胞所需要的能量[15 ] ;同时 线粒体也是氧自由基产生和消除的重要部位[16 ] 。 在正常情况下 ,线粒体能够依赖自身的氧自由基酶 系统清除过量产生的自由基而维持氧化代谢平 衡[16217 ] 。在病理条件下 ,过量产生的自由基不能被 抗氧化酶有效清除而容易引起富含不饱和脂肪酸的 线粒体膜发生过氧化反应造成膜损伤 ;增加的过氧 化脂质直接导致线粒体膜电位降低、线粒体解耦联 和线粒体肿胀等线粒体膜功能的改变[17219 ] 。因此 , 线粒体是组织细胞对外界毒物反应最敏感的细胞 器 ,也是决定细胞损伤程度及显示损伤能否可逆的 关键细胞器[20221 ] 。近曲小管主要分布于肾脏皮质组 织且富含线粒体 ,而线粒体功能紊乱直接参与多种 外源性化学毒物引起的肾脏毒性[22 ] 。因此 ,本试验 重点研究了铅、镉单独和联合染毒对肾脏皮质组织 中线粒体超微结构的影响 ,发现线粒体肿胀 ,嵴断 裂、排列紊乱 ,严重者内部结构模糊和线粒体膜损 伤 ;结合本研究结果 ,表明铅镉染毒引起的肾脏组织 脂质过氧化反应可能是导致线粒体损伤的主要原因 之一。对比各染毒组的线粒体超微结构 ,发现联合 染毒对线粒体的损伤程度重于单独染毒 ,进一步证 实铅镉联合染毒的协同毒性效应。体外研究表明铅 镉染毒会抑制线粒体电子传递链和引起膜电位降低 影响线粒体呼吸功能 ,从而进一步诱导活性氧的产 生而加重氧化损伤[23224 ] ,线粒体呼吸功能变化是否 与铅镉肾毒性损伤直接相关需要进一步探讨。 参考文献 : [ 1 ] 　刘宗平. 动物中毒病学[ M] . 北京 :中国农业出版社 ,2006 :3942 402. 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