一氧化氮对肿瘤的作用.doc - 山东大学医学院

一氧化氮对肿瘤的作用.doc - 山东大学医学院 1 肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病 之一。抗肿瘤药一直是科学家们研究的热点。 生物治疗被称为治疗肿瘤的第四种治疗手段。生物治疗研究范围非常广泛, 主要包括基因治疗、免疫治疗 (过继免疫治疗、疫苗治疗、分子抗体治疗、细胞因子治疗等 )、抗血管生成治疗、干细胞治疗、诱导分化及凋亡、内分泌治疗等, 其中分子靶向治疗是近年来生物 治疗发展较快的治疗方法。 分子靶向药物是在分子生物学、分子遗传学理论基础上出现的新药, 相对于传统化疗药物有很多优势, 形成了一门治疗肿瘤的新领域，为肿瘤的治疗提供了一种副作用较小的方 法。近20年来，人类对肿瘤细胞生物学和遗传学的认识有了较大的发展, 对癌基因、抑癌基因、细胞凋亡、肿瘤血管形成等的研究也由细胞生物学水平转变到分子生物学水平, 许多新的概念包括信号传导、细胞周期、DNA修复等已经得到临床验证。因此, 大量以肿瘤细胞水平表达为靶点的新的抗肿瘤药物不断问世，并逐渐走向临床, 主要包括细胞信号转导分子抑 制剂、新生血管抑制剂、靶向端粒酶抑制剂以及针对肿瘤耐药的逆转剂。 NO 是近年来发现的生物体内重要的生物活性小分子,其参与体内细胞间信息传递和许 多生理、病理过程,尤其是NO 与肿瘤生长、转移、细胞凋亡及肿瘤杀伤、肿瘤治疗等方面的 关系倍受关注,成为近年来NO 研究的热点。 近来研究发现，肿瘤组织中NO 对肿瘤细胞的作用是双向性的,并且有NO 剂量依赖性。高浓度的NO(nmol 水平) 具有细胞毒性作用,可抑制肿瘤生长,杀伤肿瘤细胞,但适宜持续的较低浓度的NO (fmol 或pmol水平) 可增加肿瘤组织血供,促进肿瘤生长、新生血管形成。 1）NO与肿瘤细胞凋亡 NO及其在细胞内产生的过氧亚硝酸根ONOO- 均为性质活泼的化学物质, 可造成DNA 的损伤和突变,此可引起P53 抑癌基因的激活应答,介导损伤DNA 的修复或细胞凋亡。在研究中曾发现NO 介导了巨噬细胞对P815 肿瘤细胞的杀伤作用并且表现为肿瘤 细胞的凋亡,其作用可被NOS 抑制剂L - NAME 抑制。有研究表明:NO 可诱导肿瘤细胞的凋亡,且呈剂量、时间依赖性,NO引起细胞凋亡时有P53 基因mRNA 和P53 蛋白合成的增加,NO诱导肿瘤细胞凋亡与P53 蓄积有关,抑癌基因P53 介导了NO引起的肿瘤细胞凋亡。 2）NO与肿瘤生长及肿瘤血管形成 通常肿瘤细胞产生适度较低量的NO促进肿瘤组织血管形成。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF )是重要的血管形因子, 肿瘤患者血清中VEGF 多有升高, 手术切除瘤体后降至正常, 实体瘤中也有升高VEGF 表达。VEGF 与内皮细胞表面的相应受体结合,通过细胞内钙调蛋白和磷酸肌醇信号传 导途径增强细胞内NOS 的表达,使NO成增多,若用Ca 2 + 螯合剂和钙调蛋白拮抗剂BAPTA 或Calmidazolium 以及蛋白酪氨酸激酶抑制剂三羟异黄酮可阻断VEGF 增加NO生成。NO可激活血管内皮细胞中的鸟苷酸环化酶,使细胞内cGMP 浓度升高,通过cGMP 信号传导通路在VEGF 调节血管形成的过程中发挥作用,可使微血管扩张,内皮细胞移动、增生,促进新血管形成,用NOS 抑制剂L -NAME 可阻断VEGF 促血管形成的作用。 另有少数研究NO 可抑制血管形成。Pipili Synetos认为NO是内源性血管形成抑制剂。有报道NO可抑制VEGF增强子活性,从而抑制VEGF 基因表达。NO对血管形成的双重作用依赖于NO浓度、细胞内微环境及细胞类型。NO抑制肿瘤血管形成的作用可能是由于NO的毒性作用直接抑制内皮细胞增殖或诱导其凋亡,也可能通过调节或介导其他血管形成相关因子来抑 制血管形成。 本实验通过体外给予肿瘤小鼠模型不同浓度的NO供体亚硝基乙酰青霉胺（SNAP），使其在体内代谢生成NO,进而探讨NO对肿瘤细胞凋亡的作用和验证NO对肿瘤血管（抑制或促进血管生成）的作用，从而验证其对肿瘤的综合作用，为临床给药提供参考。 2 1. 王小华，张平，李国亮，张忠山，王铲 TNP一470联合CTX对小鼠LA795 肺腺癌皮下移植瘤生长的影响 湘南学院学报(医学版)2008年12月第10卷第4期 2. 王玮琴,周慧君 肿瘤血管生成抑制药的研究进展 医药导报2004年4月第23卷第4期 3. 顾觉奋，张少华 抗肿瘤血管生成抑制剂TNP一470的研究进展 药学与临床研究 2007年第15卷第4期 4. 张永莉 肿瘤新生血管生成抑制剂的研究进展 中国药房2008年第19卷第31期 5. 赵鑫，冯永波，王启文 血管生成抑制剂TNP一470抑制肺腺癌生长的研究 中国误诊学杂志2008年12月第8卷第36期 6. 王洪武 肿瘤分子靶向药物治疗进展（1）-药物分类 7. 乐红琴, 欧希龙, 杭 程, 陈慧娟, 关云艳, 孙为豪 血管内皮生长因子165基因对人胃癌细胞体外侵袭转移的 影响 世界华人消化杂志 2008年12月28日; 16(36): 4036-4040 8. 姚阳， 李崇杰血管内皮生长因子对血管内皮细胞αv 整合素表达的影响 实用手外科杂志2008 年12 月第22 卷第4 期 9. 陈 彬,李 丽,吴士明,邹 密 ,李景华1 小鼠实验性肿瘤NO 含量与微血管密度的相关性研究 西南国防医药2005 年第15 卷第1 期 10．潘 昊 ，蔡松良 NO 与肿瘤血供 国外医学泌尿系统分册2001年第21卷增刊 11．李正贤1 ,刘庚勋2 ,颜美荣1 ,刘阳云 iNOS、CD34在喉鳞状细胞癌组织中的表达与血 管形成的关系 临床军医杂志2008年12月第36卷第6期 12．马玉玲 郭子林 李士玉 NO与肿瘤研究进展 济宁医学院学报 2002年3月第25卷第1 期 13. Nitric oxide delivery to cancer: why and how? Sonveaux P, Jordan BF, Gallez B, Feron O. Eur J Cancer. 2009 May;45(8):1352-69. Epub 2009 Jan 17. Review 14. NITRIC OXIDE IN CANCER AND CHEMOPREVENTION LORNE J. HOFSETH,* S. PERWEZ HUSSAIN,* GERALD N. WOGAN,† and CURTIS C. HARRIS* (Received 25 July 2002; Revised 30 September 2002; Accepted 2 October 2002) 15.Role of nitric oxide in carcinogenesisand tumour progression. Peeyush K Lala and Chandan Chakraborty Lancet Oncol 2001; 3: 149–56 16. Inhibition of Nitric Oxide Synthase Induces a Selective Reduction in Tumor Blood Flow That Is Reversible with L-Arginine'Gillian M. Tozer,2 Vivien E. Prise, and David J. ChaplinTumour Microcirculation Group. Gray Laboratory Cancer Research Trust, Mount Vernon Hospital. Northwood, Middlesex HA6 2JR. United Kingdom. 小鼠110只，鼠龄4-5周，均重20 g左右，及LA795肺腺癌荷瘤鼠2只，生理盐水，抗CD34抗体，石蜡，10％的中性甲醛溶液 显微镜，离心机，匀浆机，切片机，表面皿，剪刀，360目铜网。注射器 （均由山东大学医学院机能学实验室提供） 3 断颈处死2只荷瘤鼠，无菌条件下剥离瘤块，按l g肿瘤组织加4ml生理盐水放入表面皿中，用剪刀剪碎肿瘤，然后移入匀浆机中研磨成匀浆液，过360目铜网，生 6成肿瘤细胞悬液，倒入离心管中，加入生理盐水，显微镜下调节细胞浓度为2×10／ml，然后于每只小鼠右后腿根部外侧皮下注射0．2 ml肿瘤细胞悬液，形成小鼠皮下肿瘤动物模型。 实验小鼠皮下移植处均成瘤，并随机将其分成6组，每组10只。?对照组(给 -4 -5 -6 予生理盐水)；?给予10mol/L SNAP；?给予10mol/L SNAP；?给予10mol/L SNAP；? -7-8给予10mol/L SNAP;?给予10mol/L SNAP。用药均为等量液体皮下注射。肿瘤移植4 d后开始给药，隔日1次，共7次。用药期间每2 d测量小鼠皮下肿瘤。肿瘤接种24 d后处死全部小鼠，剥离皮下移植瘤，称瘤重，然后浸入10％的中性甲醛溶液固定，石蜡包理、组织切片(4微米)，进行免疫组化染色及凋亡检测. 按下列公式计算肿瘤体积和抑瘤率（2J：V=a×b2／2，V代表肿瘤体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。抑瘤率=1一[ET／EC](EC：对照组肿瘤体积或瘤重，ET：用药组肿瘤体积或瘤重) 显微镜下观察，以细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性细胞，5个高倍镜视野下各计数200个细胞，结果以阳性细胞所占百分数计算。取其均值。 采用免疫组化(SABC法)观察，根据DAB显色间接显示肿瘤微 血管密度(MVD)，肿瘤微血管密度测量应用Weidner报道的方法；在40倍光镜下找到高血管密 度区域，再在200倍光镜下记录被抗CD34抗体染成棕黑色的血管管形数，以3个200倍光镜下测蜃的微m管平均数表示。 表1 各组小鼠皮下肿瘤生长情况(i?s,mm3) 抑瘤3瘤体积（mm)/ 作用时间 率（%） 组别 瘤重(g) 4d 8d 12d 16d 20d 24d ?对 照组 组 组 组 组 组 4 表2 各组小鼠肿瘤细胞凋亡率 ?对照组 组 组 组 组 组 凋亡率 根据以上的实验结果，求出SNAP的IC。 50 实验小鼠皮下移植处均成瘤，并随机将其分成5组，每组10只. ?对照组(给予生理盐水)；?给予浓度为ICSNAP；?给予浓度为IC /2 SNAP；?给予浓度为IC/4SNAP；50 5050 ?给予浓度为IC/8SNAP。用药均为等量液体皮下注射。肿瘤移植4 d后开始给药，隔日1次，50 共7次。肿瘤接种24 d后处死全部小鼠，剥离皮下移植瘤，称瘤重，然后浸入10％的中性甲醛溶液固定，石蜡包理、组织切片(4微米)，进行免疫组化染色，测量各组肿瘤中的MVD表达。 表3 各组小鼠肿瘤细胞MVD的表达 ?对照组 组 组 组 组 组 瘤重（g） MVD 5 接种后，各组皮下移植瘤的体积逐渐增大，肿瘤接种后的第1～4 d，移植瘤生长基本相同；18～24d，对照组移植瘤生长明显快于其他 给药组；给药组随着给药浓度的升高，移植瘤体积呈减小趋势，且抑瘤率呈增大趋势。 2. HE染色，镜下凋亡细胞表现为细胞体积缩小或变形，核浓 染及丧失亚形态结构。核染色质边聚，呈凋亡小体。随着给药浓度增加，凋亡率升高。 SNAP在体内通过代谢产生NO，从而发挥抗肿瘤作用。 对照组移植瘤最重，给药组移植瘤重量呈先升后降趋势，在 某一浓度是重量达最高值。 所有肿瘤组织内MVD均阳性表达，内皮细胞被染成棕黄色，微血 管的大小形态差异较大，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇，有的细胞不明显或形态不规 则。与对照组相比，给予较低浓度药物时MVD表达较高；给予较高浓度药物时MVD表达较低。给药组随着给药浓度的降低，MVD表达呈先减后增的趋势，在某一浓度MVD表达最高。 SNAP在体内通过代谢产生NO，在较低浓度时促进肿瘤血管的生成，从而加快肿瘤生长； 在较高浓度时能够抑制血管生成，从而与其促进肿瘤细胞凋亡的作用协同起到抗肿瘤的效 果。 NO 可与Fe - S 中心的Fe 结合,形成铁- 亚硝酰基复合物使细胞内含铁硫基团的有关酶如三羧酸循环中的顺乌头酸酶、呼吸链中的NADH - 辅酶Q 还原酶和琥珀酸- 辅酶Q 还原酶活性丧失, 导致肿瘤细胞能量代谢障碍。核糖核苷酸还原酶含有 Fe- S 中心也可与NO 结合而丧失活性,导致核糖核苷酸不能还原为脱氧核糖核苷酸,抑制DNA 的合成。NO 可与细胞内超氧阴离子O 2- (superoxide) 进行快速非酶促反应, 生成过氧亚硝酸根ONOO -(peroxynit rite) ,其具有很强的氧化性,可造成肿瘤细胞多方面损伤如脂 质过氧化、抑制顺乌头酸酶、损伤DNA 和RNA 及蛋白质。NO 造成DNA 损伤后可激活多聚ADP - 核糖合成酶,导致细胞能量耗空(energy depletion) 引起细胞死。 NO 及其在细胞内产生的过氧亚硝酸根ONOO- 均为性质活泼的化学物质, 可造成DNA 的 损伤和突变,此可引起P53 抑癌基因的激活应答,介导损伤DNA 的修复或细胞凋亡。 ?通过NO/ cGMP 途径介导VEGF的血管形成。VEGF 可能通过磷脂酰肌醇32激酶2Akt激酶途径激活内皮细胞NOS 诱导NO 合成,NO 在细胞内激活可溶性鸟苷 酸环化酶,升高细胞内cGMP 水平,cGMP 为NO主要效应分子,可刺激新生血管形成。?NO 也可介导TNF ,PAF 诱导的血管形成。?NO 可通过NOS-NO-VEGF 通路介导血管形成。NO 作用于低氧反应原件(HRE) ,增加低氧诱生因子21α(HIF21α) 蛋白水平及活性,激活人VEGF 启动子活性。 NO 抑制肿瘤血管形成的作用可能是由于NO 的毒性作用直接抑制内皮细胞增殖或诱导其凋亡,也可能通过调节或介导其他血管形成相关因子来抑制血管 形成。 6 SNAP在体内可以代谢产生NO，对肿瘤生长起双向作用。表现在：促进肿瘤细胞凋亡；但是对肿瘤中血管生成的作用具有剂量依赖性，低浓度时促进血管生成，高浓度时抑制血管生 成。临床中应避免给予该促进血管生成的药物浓度，以期最大限度的发挥药物的抗肿瘤作用。 7