【doc】雌二醇和孕酮对去势小鼠淋巴结T细胞和B细胞的调节

【doc】雌二醇和孕酮对去势小鼠淋巴结T细胞和B细胞的调节 雌二醇和孕酮对去势小鼠淋巴结T细胞和B 细胞的调节 180解剖学研究2006年第28卷第3期AnatRes.2006,Vol28,No.3 ? 论着? 雌二醇和孕酮对去势小鼠淋巴结T细胞和 B细胞的调节 时淑娟智建生任学军1李云生 (天津医科大学解剖学教研室,天津300070) 【摘要】目的观察苯甲酸雌二醇,己酸羟孕酮以及二者联用替代疗法对卵巢切除小鼠淋巴结T,B淋巴细胞数量, 形态的影响,从而探讨苯甲酸雌二醇,己酸羟孕酮对机体免疫系统的影响.方法雌性昆明小鼠6o只随机分成5组,小鼠 35d时选取4组切除卵巢,术后5d开始,分别注射生理剂量的苯甲酸雌二醇,己酸羟孕酮或二者联用及麻油,每5d注 射一次,共150d.剩余的1组为保留卵巢空白对照组,不给予药物.应用MIAS.2000系统分别测定淋巴结内T,B淋巴细 胞在特定居住区内的细胞密度.电镜下观察淋巴结的副皮质区内T,B细胞超微结构的改变.结果苯甲酸雌二醇或苯甲 酸雌二醇与己酸羟孕酮联用对淋巴结T淋巴细胞增殖,活化有抑制 作用,但是可以刺激淋巴结B淋巴细胞增殖(P< 0.05).己酸羟孕酮单独使用可以刺激淋巴结T淋巴细胞增殖,活化,抑 制淋巴结B细胞增殖(P<O.O5).结论苯甲酸雌 二醇可以增强体液免疫而抑制细胞免疫,己酸羟孕酮可以增强细胞 免疫而抑制体液免疫. 【关键词】苯甲酸雌二醇;己酸羟孕酮;淋巴细胞;小鼠 TheregulationofTcellandBcellinmicewithovariectomybyestradiolandprogesteroneSHIShu-juan.ZHIJian— sheng,RENXIl~-jun,LIYun-sheng.DepartmentofAnatomy,TianjinMedwdUn&e~,Tianjin300020China 【Abstract】ObjectiveToevaluateforlymphocytecountandmorph01o舀 calchangesinlymphaticnode.Methods Kunmingovariectomizedfemalemice36intotalweretreatedwitIIestradiolbenzoate(EB),hydroxypmgestemne(HPC),and themixtureofthematthenormaldoserespectively.Another12ovarieetomizedfemalemicewitIIsesameoilascontrastfovx). Therewere12asaintactnormalgroup(INT)asthecontro1.Injectionsofhormonewereperformedat5-dayintervalsfrom4oto 190daysofage.whichwere30timestotally.CelldensityofTandBlymphocyteinlymphnodeweredetectedwitIIMIAS- 2000.Theultrastructureofthemwereobservedunderanelectronicmicroscope(EM).ResultsBothEBandthecombinationof EBandHPCCaninhibittheproliferationofTlymphocyteandstimulatethepmIifemtionofBlymphocyteinthelymphnodeof themice(P<O.05).However,HPCactsonthembytheoppositemanner(P<O.05).ConclusionEstradiolbenzoateCanboost humoralimmunityandsuppresscellularimmunitywhilehydroxypmgestemnecaproatehasanoppositeeffect. 【Keywords】 Estradiolbenzoate;Hydmxypmgesteronecaproate;Lymphocyte;Mouse 近年来,临床上常用雌激素替代疗法(hormone replacementtherapy,HRT)治疗因雌激素缺乏引起 的阿尔茨海默病,骨质疏松等疾病.但是HRT的 不良反应也引起了广泛的关注.有研究发现,长期 应用雌激素替代治疗的妇女,其发生子宫内膜癌, 乳腺癌和卵巢肿瘤的几率大大增加[?.这说明雌 激素与免疫系统之间存在着某种关系.因此.有关 性激素与免疫系统之间的关系研究也成为国内外 学者颇为关注的焦点[:.本研究旨在观察苯甲酸 雌二醇(EB),己酸羟孕酮(HPC)以及两者联用替 基金项目:天津医科大学重点科研基金(2004XK34)资助项目 1.天津中医学院基础医学实验中心.天津300193 ?通讯作者:Tel:022—23542535;E—mail:Liyunsheng@tujmu.edu.cn 代疗法对卵巢切除小鼠淋巴结T,B淋巴细胞数 量,形态的影响,从而探讨雌二醇,孕酮对机体免 疫系统的调节. 1材料与方法 1.1实验动物 健康雌性昆明小鼠60只28d断乳,体重17, 18g,随机分成5组,每组12只.每组动物分别放 入塑料鼠笼(24cmx15cmx15cm)饲养.实验室 室温控制在20?,22?,光照与环境一致.食物和 水自由摄取. 1.2手术和激素治疗 鼠龄在35d时除保留一组为保留卵巢空白 对照组(INT)外,其他4组均在乙醚麻醉下经鼠背 解剖学研究2006年第28卷第3期AnatRes,2006,Vol28.No.3 面双侧切口切除卵巢.术后5d开始去卵巢小鼠 分别接受4种不同治疗:(1)雌二醇组(OVX加 EB),注射苯甲酸雌二醇,8tzg/次混5Ol麻油; (2)孕酮组(ovx加HPC),注射己酸羟孕酮,2 mg/次混于5Ol麻油;(3)雌二醇加孕酮组(OVX 加EB和HPC).注射苯甲酸雌二醇8tzg/次和己 酸羟孕酮2mg/次混于5Ol麻油;(4)麻油组(切 除卵巢对照组,ovx),每次注射5Ol麻油.空白 对照组不给予药物.药物注射从小鼠术后5d开 始,每5d腹腔注射药物一次,共150d. 1.3电镜,光镜标本制备 在治疗结束后的第2天.同时处死5组动物, 迅速取小鼠腹腔淋巴结.每组淋巴结分成两部分 处理:一部分立即以2.5%戊二醛多聚甲醛固定, 1%四氧化锇后固定.乙醇逐级脱水.Epon812环氧 树脂包埋.瑞典LKB.V型超薄切片机半薄切片 (1)定位后,进行超薄切片(厚度5O,70nm).醋 酸铀,柠檬酸铅染色.JEOL.IOOCX透射电镜观察 各组淋巴结的副皮质区内T,B细胞超微结构改 变:另一部分投入10%甲醛溶液中固定24h后, 经冲洗脱水,石蜡包埋,切片后进行苏木精.伊红 (HE)染色,在光镜下进行观察,应用MIAS.2000 系统分别测定淋巴结内T,B淋巴细胞在副皮质 区,淋巴小结等特定居住区内的细胞密度. 1.4统计学分析 淋巴结T,B细胞的密度以均数?差(? 5)示,经SPSS10.0统计软件处理,采用单因素 方差分析.SNK.t检验.显着性水准ct=0.05. 2结果 2.1淋巴结T细胞,B细胞密度的测定 2.1.1T细胞密度测定OVX加EB组与INT组 相比.T细胞密度虽有轻度降低但是不具有统计 学意义(P>O.O5).OVX加EB和HPC与INT组相 比T细胞密度降低(P<O.05).使T细胞密度下降 最明显的是OVX组(尸<O.O5).OVX加HPC组T 细胞密度最高,与其他4组相比,差异有统计学意 义(尸<O.05;表1,图1). 2.1.2B细胞密度测定OVX加EB组与INT组 相比.B细胞密度虽有轻度增高但无统计学意义 (尸>O.05).OVX加HPC组B细胞密度降低,与 其他4组相比,差异有统计学意义(P<O.O5).B 细胞密度最低的是OVX组(尸<O.05).OVX加EB 181 和HPC组是惟一使B细胞密度升高的一组(P< O.01;表1,图2). 表1淋巴结T细胞密度和B细胞密度(蜘) .一与空白对照组相比,P<0.05;P<O.0l 皇 ? ‘磊 皇 U 皇 ? ‘磊 皇 U INTEBNPCEB和HPCOVA ‘与空白对照组相比,P<0.05 图l淋巴结T细胞密度的变化 INTEBNPCEB+HPCOVX 佳i空白对照组相比,P<O.05;mp<O.Ol 图2淋巴结B细胞密度的变化 2.2淋巴结内淋巴细胞超微结构的改变INT组 未见T淋巴细胞活化,细胞表面微绒毛较多,偶 见转化型淋巴细胞,可见幼稚的处女型淋巴细胞 (图3).OVX加EB组少见活化的T淋巴细胞,细 胞胞质突起较少,细胞表面微绒毛较细,较少见 到转化型T细胞,处女型淋巴细胞增多.还可见 凋亡的T细胞,细胞核成高电子密度(图4).此 外,可见B淋巴细胞,突起增多,核大,核内异染 色质较少,成块状或细带状在核被膜处分布,胞 质内有较少而小的线粒体和粗面内质网(图5). OVX加HPC组可见大量活化的T细胞,细胞胞 8765432lO OOOOOOOOO87 65432lO OOOOOOOOO 质突起较多较}乏.Jf包质少,可虬少数线粒体,结构 完好有清晰的嵴.檄少的细管状粗面内质网,游 离核精体较多转化型T细胞多.可见细胞核 及核f一明显增大,胞质少.庄_r淋巴细胞群中有 胞质突起较少的处女型淋巴细胞(图6JOVX加 EB干?HPc组内大部分I.细胞活化程度较低,胞 觯削学研究2(K)6年第28雀帮3刺 lllllies.21~)61283 质突起少见转化型T细胞少见.处女型淋巴细 胞稍多细胞器少.游离拨槠体充满胞浆nf虬B 细胞,核大,胞质突起不规则(图7)|OVX绀T细 胞活化程度较低,细胞有较小的微绒毛.较少有 大的胞质突起,转化的T细胞较少.有较大的核 慢核r:,术见l{细胞(图8 图3iI-常埘照组.T淋巴胞(T1.巨噬细袍fM),未她T细胞晒 化,Mx75(1(I 图4蚍_I醇组,I’淋巴llI咆).捌亡T淋巴细胞(deadTJ.少活化的T细 胞,l可捌T绑匏.1EM×7500 图5雌__醇鲥.I淋巴纲胞l,B淋巴细融(1).噬绑匏{M),少见活化的T细胞.可见l{纲幢M×7500 图6孕阿可蹦,I淋巴胞(_rJ.噬卦玎胞(M).可见大量活化的T细胞.亿Mx75tX) 图7魄酵力?孕酮,’r淋巴细胞(1’),B巴细胞fl?.噬细胞(M】,活化的I,细融很少.可I细胞.TEMx7501) 图8晰汕组r淋巴l胞(r1T细胞活化程度较假.未她B细胞Mx75IH] 3讨论 淋结作为外心免疫器官,别机体的免疫反 应起着匦玺的捌节作J异物或抗原随着淋巴管 道进人淋巴结后,可分别刺激r细胞或者B细 胞,进行细胞免疫或体液免疫应答..同种类的激 素作用厂去势小鼠后.可以影响T,B细胞的数量 和组织结构,增强或减弱小同类别的免疫功能.. 在OVX加EB,r)VX仃不EB和HI1c组可以看 到._r细胞降低较为明l{细胞数增加最多 结粜显给去势小鼠补充外源性雌激素时.?r以 得到和雌二醇与孕酮联合使用时辑I近的散果,孕 酮的存往JJll强了雌激素的作川效果.雌二醇抑制 淋巴结r细胞是通过抑制T淋细胞表耐白细胞 介素2(IL-2)受伴的表达.使c1)4/(2D8+的比值降 低,T细胞活性下降雌二一醇促进I{细胞增殖和活 化是由于.雌_二醇作J驰丁辅助性.I细胞(_rJ纲胞. CD4).嗣节初蛤CD4细胞的分化向.抑制THl 细胞和增强TH2细胞的功能.rh2分泌II2,十 扰素(IFN一)和淋巴毒素等细胞T-,通过活化细 胞毒性T淋细胞而促进细胞免疫应答:Th2分 泌IL一4,11,.5,IL,6,II—l0和1113等细胞因子,通 过产生特异’抗体促进体液免疫应眷Th2功能 增强产生的大量l{细胞E}乇闲予和B细胞活化 因子,诱导rB细胞成熟.孕酮在与雌二醇联合 使用过程中JJI1强J雌二醇的怍用的敏感性盲文 献报道,雌二醇,孕酮选择性影响同的细胞因 子.在孕期共同维持Th2型细胞子优势+从而 JJJ1强体液免疫.抑制细胞免疫J.?c~inni等也 发现在小剂量孕酮作用下发育的T细胞细胞膜 解剖学研究2006年第28卷第3期AnatRes,2006,Vol28,No.3 CD30分子增多.CD30表达水平与CD8~T细胞分 泌IL.4,IL-5的呈正相关,有利于CD4细胞向Th2 分化[.而且孕酮可以诱导Thl细胞凋亡及抑制Thl 细胞分化,而Th2可以逃脱孕酮的毒性效应[, Th22的增多促进了B淋巴细胞的活化. 孕酮应用于去势小鼠时,可以刺激T细胞的 增殖,活化,使细胞合成蛋白质的过程活跃,功能 增强.孕酮与受体结合可以使细胞内钙离子浓度 升高,从而激活钙调磷酸酶.转录因子NFAT (nuclearfactorofactivatedTceHs)在钙调磷酸酶 催化下,脱磷酸并进人核内,结合在IL.2启动基 因序列的结合位点上.另外,胞浆内的激素受体与 激素结合形成的复合物可以诱导c.f0s基因转录, 该基因编码的FOS蛋白与JUN蛋白结合.形成的 转录因子AP.1也结合在IL.2启动基因序列的相 应位点上,从而诱导IL.2基因的编码,促进IL.2 的生成[.IL.2可以促进细胞活化,活化的TH 细胞又分泌IL.2,分泌的IL.2与TH上的IL.2受 体结合,使细胞达到完全活化阶段,此时卟细 胞开始大量增殖,致使CD4细胞密度增高,初始 CD4细胞的分化向着增强Thl细胞和抑制Th2细 胞功能的方向调节,从而T细胞数目增多.体外实 验中孕酮作用于T淋巴细胞,可以增强T淋巴细 胞的活化[引.曾经有报道,孕酮可以加强CD4及 CD8+细胞活性[引.Bruland等[-o】研究也发现生理浓 度的孕酮可以诱导剂量依赖性CD8+的增殖[n】.而 CD8+活性增加分泌B细胞抑制因子增多,阻碍了 B细胞的发育,使B细胞的数量减少.孕酮还可以 刺激淋巴细胞释放孕激素诱导阻断因子 (progesterone-inducedblockingfactor,PIBF),PIBF 可以抑制丝裂原诱导的B细胞增殖和NK细胞的 活化,从而降低B细胞数量和活性[n】. 去除小鼠卵巢后,仅给予麻油(OVX)处理,可 以看到去势可以降低T,B细胞数目以及T细胞 活性,细胞免疫和体液免疫均被抑制.虽然去势小 鼠缺乏雌激素可以使细胞因子IL.2产生增多,但 是长期对T细胞的慢性刺激,可以导致IL.2受体 脱落,脱落下来的IL.2受体可与游离的IL.2结合 而干扰IL.2与细胞相互作用.由此T细胞活性受 到抑制[】.此外,当雌激素缺乏时可以促使胸腺T 细胞增生[n】,增生的亚群中Ts细胞也增多.CD8+ 的增生活化会分泌B细胞抑制因子.抑制了B细 胞的增殖. 性激素在免疫调节中的作用是十分复杂的. 该项研究证实雌二醇可以增强体液免疫而抑制细 胞免疫,孕酮可以增强细胞免疫而抑制体液免疫, 当二者联合使用时,孕酮就会协同雌二醇抑制T 细胞增殖,活化,刺激B细胞增殖.老年妇女绝经 后造成雌,孕激素水平同时降低时,细胞免疫和体 液免疫同时受到影响,免疫力下降,患肿瘤等疾病 的几率增加.雌性激素对于免疫系统的作用尚未 完全阐明,而且因为激素用量的不同可能会导致 截然相反的效果.这些问题尚需在今后的实验研 究中进一步深人探讨. 参考文献 1.LaceyIVJr,MinkeJ,LubinJH,eta1.Menopausal hormonereplacementtherapyandriskofovariancancer. JAMA,20o2,28:334. 2.1wataM,EshimaY,KagechikaH.eta1.Theendocrine disruptomnonylphenolandoctylphenolexertdirecteffects ONTcellstosuppressTh1developmentandenhanceTh2 development.ImmunolLett,2004,15,94:135—139. 3.KrishnanL,GibertU,WegmannTG,eta1.T helperlresponseagainstleishmaniamajorinpregnant. C57BL/6miceincreesimplantationfailureandfetal resorptions.Immunology,1996,156:653-662. 4.PiccinniMP,Bel0niL,UviC,eta1.Defectiveproduction ofbothleukemiainhibitoryfactorandtypc2T-helper cytokinesbydecidualTcellsinunexplainedrecurrent abortions.Namcd.1998,4:1020—1024. 5.Vukmanovic-StejicM,VyasB,Gorak.StolinskaP,eta1. HumanTelandTc2厂rcOCD8T.cellclonesdisplay distinctcellsurfaceandfunctionMphenotypes.Blood. 2O0o.95:23I-240. 6.MatsuzakiJ,TsujiT,ImazekiI,eta1.Immunosteroidasa regulatorfor1111/rIl2balance:itspossiblerolein 375. autoinlnlunediseascs.Autoimmunity.2oo5.38:369— 7.BentenWPM.Lieberherr.Estmdiolbindingtocellsurface raisescytosolicfreecalciuminTcel1.FEBSLett.1998. 422:349. 8.孙荭,曾耀英,黄柏炎等.孕酮对人T淋巴细胞体外活 化CD69表达的作用.生殖免疫学,2000,12:675—677. 9.Szekeres,BarthoJ,WegmannTG..Aprogesterone dependentimmuno.modulatoryproteinalterstheTh1/nl2 balance.ReprodImmunol,1996.31:81—95. 10.BmlandT,LavikLA,DaiHY.eta1.Identificationof friendmurineretrovirous.infectedimmunecellsand studiesoftheeffectsofsexandsteroidhormonesinthe earlyphaSeofinfection.AMPIS,20o3.111:878—879. 11.RashupathyR.1111-typeimmunityisincomepatibletIl successfulpregnanc.ImmunolToday,1997,18:478L82. 12.DruckmannR,DruckmannMA.Progesteroneandthe immunologyofpregnancy.SteroidBiochemMolBoil, 2005.97:389-396. 13.LeposavicG,ObradovicS,KosecD,eta1.Invivo modulationofthedistributionofthymocytesubsetsby femaleSeXsteroidhormone.Immunopharmacology,2001, l1:l1-12. (收稿日期:2006-03.03)