阳春砂愈伤组织诱导与植株再生

阳春砂愈伤组织诱导与植株再生 广州中医药大学66JournalofGuaIl8zh?UniversityofTraditionalChineseMedicine2OO7年1月第24卷第1期 January2007,Vo1.24.No.1 文章编号:1007—3213(2007)01—0066—03 阳春砂愈伤组织诱导与植株再生 ,周联,曹柳英,王培训 张雅明,董燕 (广州中医药大学临床药理研究所,广州510405) 摘要:【目的】通过愈伤组织的诱导与植株再生,建立阳春砂的离体再生系统.【方法】以1g,/L升汞和1.84kg:,/L~浓硫酸 分别处理阳春砂种子;取阳春砂无菌幼苗的叶片及茎切段为外植体,接种于以MS为基本培养基,分别添加了不同生长素, 细胞分裂素的培养基中,进行愈伤组织诱导和再生培养.观察:?不同处理方法对种子萌发的影响;?不同培养基诱导阳 春砂愈伤组织的优劣;?不同剂量AgNO3对愈伤组织分化的影响;?不同培养基对芽分化的影响.【结果】?以升汞消毒 的种子均未观察到萌发,而经浓硫酸处理的种子萌发率迭8.4%.?幼苗叶片不能形成愈伤组织,茎切段能有效诱导愈伤 组织;添加0.5mg/L2,4一二氯苯氧乙酸(2,4-D),0.5mg/L萘乙酸(M)和1.0mg/L6-苄基腺嘌呤(6BA)的培养基 适合愈伤组织的诱导.?在该培养基中添加6mg/LAgNth可使诱导的愈伤组织更易于再分化.?添加0.1mg/LNAA和2.0 mg/L6-BA,再分别添加0.5mg/L呋喃氨基嘌呤(KT)或0.1mg/LN'-苯基.N'-1,2,3-噻二唑.5.脲(TDZ)可诱导愈伤组织的 芽分化,丛生芽移至Ms培养基上可自然生根.【结论】以阳春砂种子萌发后幼苗的茎切段作为外植体,在一定培养条件下 可实现愈伤组织的诱导与再生,建立其离体再生系统. 关键词:砂仁/生长和发育;中药培育 中围分类号:S567文献标识码:A 砂仁(Amomumvillosum)是中国着名的"四大 南药"之一,主要以成熟干燥果实入药,具有化湿 开胃,温脾止泄,理气安胎等功效…1,是重要的常 用药材之一.砂仁主产于广东,云南,广西等省 区,尤以广东省阳春县产的阳春砂仁最为地道,但 其在种植过程中病虫害较为严重,直接影响结果率 和质量_2J.本文通过阳春砂的无菌播种发芽和胚性 愈伤组织的诱导与再生初步建立了离体再生系统, 为进一步的种质优化研究打下基础. l材料与方法 1.1材料阳春砂果实,于8月中旬采集于广东 省阳春县. 1.2植物激素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D);.萘 乙酸(NAA);6-苄基腺瞟呤(6-BA);呋喃氨基嘌 呤(KT);N.苯基.N.1,2,3.噻二唑.5.脲(?)均 购于广州威佳生物技术公司. 1.3培养基基本培养基为MS,试验中根据具体 要求在基本培养基中添加不同的植物激素,pH值 为5.5,6.0. 1.4无菌播种砂仁鲜果剥弃果皮后,加等量细 收稿日期:2OO6—07—14 作者简介:张雅明(1982一),男,硕士研究生 基金项目:广东省自然科学基金资助项目(编号:4300450,5004272) 沙擦去假种皮,擦薄种皮至有砂仁香气,取出种 子,晾干,分两种方法处理:?种子以1L升汞 消毒9min,无菌水洗6次;?种子用1.84kg/L浓 硫酸经无菌操作浸泡3min,无菌水洗至中性.将 分别处理后的种子接种于MS培养基,培养温度 25cI=,28cI=,光照14h/d,光照度2000Lx(勒克 斯). 1.5愈伤组织诱导与再生取生长至2cm高,1 , 2叶的幼苗,经无菌操作切割其茎为0.5cm小 段,叶片切割为0.5cm见方,接种于添加不同生 长素,细胞分裂素组合的MS培养基上(添加剂量 见表1),于14d和21d分别记录愈伤组织诱导率. 取诱导14d的新鲜胚性愈伤组织接种于不同激素 配比的分化培养基上培养,14d和28d分别记录芽 分化率.培养温度25cI=一28cI=,光照1411/d,光 照度20o0l?. 2结果 2.1种子萌发经浓硫酸处理的种子在MS培养 基上萌发率为8.4%,萌发期为25,65d.以升汞 消毒的种子均未观察到萌发.砂仁幼苗见图1. 第1期张雅明,等.阳春砂愈伤组织诱导与植株再生67 2.2激素与愈伤组织诱导以MS为基本培养基, 添加不同种类和浓度的激素对砂仁幼苗的茎切段和 叶片进行愈伤组织的诱导(见表1),结果叶片不 能形成愈伤组织,而茎切段在2,3周可观察到有 膨大的愈伤组织形成.同时观察到单独使用生长素 2,4.D虽能有效诱导砂仁幼苗切段形成愈伤组织, 但愈伤组织呈现水渍状;降低2,4.D的浓度至O.5 rrL,再添加0.5n1g/LNAA,愈伤组织水渍状况 减轻,但仍松软;生长素与细胞分裂素O.5nL NAA和0.5HL6.BA组合中诱导率低且愈伤组织 较少;将0.5mg/L2,4.D,0.5HLNAA和1.0 n1g/L6.BA组合添加时则获得结构松脆的愈伤组 织. 2.3AgNo3对愈伤组织的影响本研究在上述Ms. 3培养基中分别添加2rrL和6mg/L的A,结 果在含6,w/LA03的培养基中形成的愈伤组织呈 淡黄色,且松脆,在芽分化实验中易于诱导出芽. 2.4激素对芽分化的影响将添加6mg/LAgN03 的MS.3培养基中诱导的愈伤组织转入含不同激素 表1不同种类和浓度激素对砂仁愈伤组织诱导的影响 Table1Effectofdifferentkindsandconcentrationsof hormonesoncallusforrnationofAV 注;MS-1添加了1.0?lg/L2,4-D;M_s-2添加了O.5?lg/LNKA和 O.5HL2,4-D;lV~S-3添加了O.5mg/LNAA,O.5mg/L2,4-D,和 1.0HL6-BA;MS,4添加了O.5mc/LNAA和O.5"lg几6-BA 衰2激素对愈伤组织芽分化的影响 Table2EffectofhormonesonsproutingofAVcallus 注:MS-5添加了O.1,w/LNAA,2.0HL6-BA和O.5HLKT; lV~S-6添加了O.1mg/LNAA,2.0rIlg/L6-BA和0.1mg/LTDZ 图1砂仁种子萌发的幼苗 Figure1SeedlingofAV 的MS培养基中(见表2),其中添加0.5mg/LN从 和1.0HLNAA培养基中愈伤组织褐变,添加0.5 nlg/LNAA+O.5mg/L6-BA,0.5rrlg/LNAA+2.0 mg/L6.BA培养基中愈伤组织出现水渍状,无芽的 分化.而MS.5,MS-6培养基可诱导芽分化(见表 2),约I周愈伤组织呈现淡绿色,培养至2周,可 观察N/J,芽萌发,芽长0.3O.6cm(见图2).第 4周记录诱导率.结果说明,添加细胞分裂素KT 或TDZ有利于芽的分化. 2.5植株再生与扩繁在芽分化培养基上诱导出 芽后,继续培养4周,芽的数量增多,形成丛生 芽,移入MS培养基中培养I周可见生根,培养lO d根生长健壮(见图3).将丛生芽分离为分生苗, 在MS培养基上扩繁,砂仁苗生长良好. 3讨论 有研究报道,对阳春砂根茎上的顶芽进行离体 培养可获得再生植株[,而通过愈伤组织诱导与再 分化获得砂仁再生植株尚未见报道.本研究组曾从 图2愈伤组织的芽分化 Figure2SproutingofAVcallus 图3丛生芽生根 Figure3RootingofaxillarybudsofAV 68广州中医药大学20O7年第24卷 大田成熟植株上取不同外植体诱导愈伤组织均未获 成功,因此,本研究通过无菌播种获得砂仁幼苗作 为外植体来源.由于砂仁的种皮坚硬,有角质层, 并轻度木质化[4l,需沙擦将种皮磨薄再进行发芽实 验,实验中发现经沙擦的种子以升汞消毒经培养后 未萌发,原因可能在于砂仁种胚对升汞敏感,而以 浓硫酸处理,可进一步破坏种皮,并起到消毒作 用,种子可萌发.砂仁无菌播种萌发条件尚需进一 步优化. 不同材料部位与愈伤组织的产生有密切关系, 本研究显示砂仁幼苗的茎切段易形成愈伤组织.生 长素2,4一D,NAA和细胞分裂素6BA,KT等都是 常用的诱导愈伤组织的植物激素,且在很多情况下 单独使用2,4D可以成功诱导愈伤组织.而诱导和 保持愈伤组织生长所需植物生长调节物质的种类和 浓度与外植体供体植物种类,生理状态等密切相 关.由于Ag可竞争性结合于细胞膜上的乙烯受体 蛋白而起到抑制乙烯活性的作用,在培养基中加入 适量AgN03对多种植物如小麦,玉米,向日葵等 都能起到促进愈伤组织器官发生的作用.本研究中 2,4一D诱导的愈伤组织呈水渍状,不易再分化,而 0.5珥r/L2,4一D,0.5mg/LNAA和1.0mg/L6.BA组 合,添加6mg/LAgNO3可诱导形成易于再分化, 即胚性较好的愈伤组织. 砂仁的种质优化对提高其产量和质量具有重要 意义,组织培养条件的研究将为其基因工程育种研 究奠定基础.本文研究了阳春砂仁的组织培养条 件,通过愈伤组织的诱导与植株再生,初步建立了 离体再生系统,为进一步进行种质优化和基因工程 育种研究打下基础. 参考文献: [1]胡玉兰,张忠义,林敬明.中药砂仁的化学成分和药理活性研 究进展[J].中药材,2005,28(1):72. 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CallusInductionandPlantletsRegenerationfromAmomumvillosum ZHANGYarning,DONGYan,ZHOULian,CAOng,WANGPeixun (ClinicalPharmacologicalinstitute,GuangzhouUniversityofTCM.Guangzhou510405,C hina) Abstract:【Objective】 TosetuptheplantletregenerationsystemofAmormunvillosum(AV)bytheproliferationand differentiationofcallus.【Methods】 1heseedsofAVweretreatedwith1g/Lmercuricchlorideand1.84kg/L concentratedsulfuricacid.ThedifferentsterilesegnentsofseedlingusedasexplantswereculturedinMSmediumwith differentsomatotropinsandcytokininstoinducecallusandplantletsregeneration.Theinfluencesofpre-treatingmethods onthesproutingofseeds,MSmediumoncallusinduction,variousdosagesofAgNO3oncalhsdifferentiation,andMS onbuddifferentiationwereobserved.【Results】 ThesproutingrateofseedssterilizedbymercuricchlorideWaszero whilethatoftheseedssterilizedbyconcentratedsulfuricacidWas8.4%.Theleavesofseedlingcannotdevelopinto calluswhilestemsegmentsCandevelopintocallus.MSmediumaddedwith0.5mg/L2,4一 dichlomphenoxyaceticacid (2,4一D),0.5mg/L—naphthaleneaceticacid(NAA)and1.0mg/L6一 benzyladenine(6-BA)Wassuitableforthe callusinduction.Moreover,6mg/LAgNOaddedintotheaboveculturemediumCanpromotethedffferentiationof callus.Whenaddedwith0.5mg/Lkinetin(KT)or0.1mg/Lthidiazuron(TDZ),MSmediumincluding0.1mg/L NAAand2.0mg/L6一 BAwassuitableforthesproutingdifferentiationofcallusandnaturalrootsCanformfromthe axillarybudswhenculturedinMSmedium.【Conclusion】 withstemsegmentsofseedlingastheexplants,callus formationandplantletregenerationCanbeachievedundercertainculturedconditionsandain-vitroregenerationsystem Canbeestablished. Keywords:AMOMUMVILLOSUM/growth&development;MEDICINALHERB ANIMALRAISING