【doc】补肾活血与泻下及开窍活血方药对老龄大鼠脑缺血再灌注神经肽的影响

【doc】补肾活血与泻下及开窍活血方药对老龄大鼠脑缺血再灌注神经肽的影响 补肾活血与泻下及开窍活血方药对老龄大 鼠脑缺血再灌注神经肽的影响 方药研究 TCM.June.2002.Vo1.43.NO.6 补肾活血与泻下及开窍活血方药对老龄大鼠 脑缺血再灌注神经肽的影响 李建生赵晶王浩赵君玫郭胜典张卫红 摘要从内皮素(ET),降钙素基因相关肽(CGRP),神经肽Y (NPY),神经降压素(NT)的变化方面研究益元活血丹与大黄 及血栓心脉宁对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤防护作用的机制. 结果明,与老龄模型组比较,尼莫地平组和益元活血丹小剂 量组血浆中CGRP水平和老龄对照组,益元活血丹大小剂量组 脑组织中CGRP均增高.老龄模型组血和脑组织中ET高于老 龄对照组,益元活血丹大剂量组与血栓心脉宁组及大黄组血中 ET,尼莫地平组和血栓心脉宁组脑组织ET均较老龄模型组降 低.与老龄模型组比较,对照组,大黄组,益元活血丹大剂量组 及尼莫地平组脑组织中NPY均降低;大黄组和血栓心脉宁组 脑组织NT降低,而益元活血丹大剂量组和尼莫地平组增高. 提示脑缺血再灌注老龄大鼠脑组织损伤与血浆和脑组织以ET 占优势的CGRP与ET平衡失调和脑组织NPY与NT间以 NPY占优势的平衡失调有关.各组药物通过调节CGRP与ET 间和NPY与NT间平衡失调而保护脑组织,其中以益元活血 丹和血栓心脉宁对CGRP与ET间平衡的作用和尼莫地平和 益元活血丹改善NPY与NT间的平衡效果较全面. 主题词脑缺血/中医药疗法再灌注神经肽类/代谢 脑梗塞病理生理的研究日益受到重视,其中神经 肽类内皮素(ET),降钙素基因相关肽(CGRP),神经 肽Y(NPY),神经降压素(NT)起着重要作用【】].本 研究在中医药理论指导下,以老龄大鼠为研究对象,观 察补肾活血(益元活血丹),泻下(3v黄)及开窍活血(血 栓心脉宁)方药对老龄大鼠脑缺血再灌注时血浆和脑 组织神经肽的影响,为指导中药防治老龄缺血性脑血 管疾病的应用和探讨作用机制提供依据. 1材料与 1.1材料与试剂:SD老年大鼠70只,20,22月龄, 雌雄兼半,由上海西普尔一必凯实验动物有限公司提 供(沪动合证字152号).放免试剂盒内皮素(ET),神 经肽Y(NPY),神经降压素(NT),降钙素基因相关肽 (CGRP)由北京东亚放免研究所提供.SN一682型放 免仪(上海核福光电仪器有限公司),尼莫地平片剂(山 基金项目:河南省杰出青年基金项目(1999—05) *河南中医学院老年医学研究室,郑州市金水大道东段1号 (450003) 收稿日期:2O0O—O4—21;修回日期:2000一O528 东新华制药股份有限公司提供,批号9712089),生大 黄粉(购于河南省药材公司,经河南中医学院中药鉴定 教研室鉴定);益元活血丹(河南中医学院第一附属医 院制剂室提供,由何首乌20g,黄精15g,沙苑子1Og, 蒲黄10g,三七10g,葛根10g等组成);血栓心脉宁 (吉林敦化华康药业有限公司提供,由川芎,麝香,牛 黄,蟾酥,水蛭等组成,吉卫药准字1996第630199 号). 1.2动物造模与分组:参照Pulsinelli四血管闭塞 法]制作全脑缺血再灌注模型,将大鼠以20乌拉坦 按0.5ml/100g剂量腹腔注射麻醉,电灼凝固双侧椎 动脉,用套有硅胶的动脉夹夹闭双侧颈总动脉 (CCA),造成全脑缺血,夹闭CCA在30,60秒内昏 迷,翻正反射消失,双侧瞳孔放大,痛反射消失,能自主 呼吸.30分钟后开放CCA灌流60分钟.对照组大鼠 仅分离双侧CCA并穿线,不进行电凝和夹闭处理.实 验中保持大鼠体温37.0?0.5C,未昏迷或缺血后有 癫痫,抽搐等并发症的大鼠均放弃.老年大鼠分为对照 组,模型组,尼莫地平组,益元活血丹大小剂量组,大黄 组,血栓心脉宁组.对照组和模型组处理为造模前2天 灌胃生理盐水,每日1次,夹闭双侧CCA前2小时加 灌1次;尼莫地平组,益元活血丹大小剂量组,大黄粉 组,血栓心脉宁组造模前2天分别灌胃尼莫地平片剂 6mg/kg,益元活血丹1.28g/kg,0.64g/kg,大黄粉 0.45g/kg,血栓心脉宁0.72g/kg,均为每日1次,夹闭 双侧CCA前2小时加灌胃1次.颈动脉取血,迅速分 离血浆,待测ET,NPY,NT,CGRP;取出脑右侧脑组 织,待测ET,NPY,NT,CGRP. 1.3测定指标:颈动脉取血,以109/5EDTA.Na2和 抑肽酶液抗凝,4C3000r/min离心10分钟,分离血 浆,放入一20C保存待测,测定前,置标本于冷水中复 溶,再次4C3000r/min离心5分钟.右侧脑组织,用冷 生理盐水冲洗3遍,除去积血,称重,尽快放入 HAClml中,略做研磨,然后在1O0C水浴中煮沸10 分钟,再次研磨制成匀浆,4'C3000r/min离心15分 钟,取上清,放入一20C保存,测定前用PBS5倍以上 医杂盍O02年6月第43卷第6期 表1各组血浆和脑组织CGRP和ET水平变化比较(?) 表2各组血浆和脑组织NPY和NT变化比较(?5) 与老龄模型组比较,*P<7O.05 稀释,以调节pH.采用放射免疫法测定. 1.4统计学方法:本文的计量资料均应用SPSS8.0 forWindows,采用方差分析的方法,其数据以j?S 表示. 2结果 2.1血浆和脑组织ET和CGRP水平的变化:表1 示.血浆中CGRP水平尼莫地平组和益元活血丹小剂 量组高于老龄模型组(P<0.05),益元活血丹小剂量组 接近老龄对照组(P>0.05).脑组织中CGRP老龄对 照组高于老龄模型组(P<0.05),益元活血丹大小剂量 组均高于老龄模型组(P<0.05),接近老龄对照组(P >0.05). 老龄模型组血中ET高于老龄对照组(P<0.05), 益元活血丹大剂量组和血栓心脉宁组及大黄组低于老 龄模型组(P<0.05,P<0.01,P<0.01),接近老龄对 照组(P>O.05).老龄对照组脑组织ET低于老龄模型 组(P<0.01),尼莫地平组,血栓心脉宁组低于老龄模 型组(P<0.01),接近老龄对照组(P>0.05). 2.2血浆和脑组织NPY和NT的变化:表2示,血浆 中NPY含量,各用药组较老龄模型组差异不显着(P >0.05).脑组织中NPY老龄对照组低于老龄模型组 (P<0.05),大黄组,益元活血丹大剂量组,尼莫地平组 低于老龄模型组(P<0.05).益元活血丹大小剂量组血 浆中NT较老龄模型组有降低趋势,但差异无显着性 (P>0.05).大黄组及血栓心脉宁组脑组织NT低于老 龄模型组(P<O.05),益元活血丹大剂量组和尼莫地平 组高于老龄模型组(P<0.05). 3讨论 脑梗塞是老年人常见病,以老龄大鼠为对象研究 中医药防治老年人多发的缺血性脑血管疾病具有实际 意义.尼莫地平是一种选择性较强的二氢吡啶类有机 钙拮抗剂,对脑缺血再灌注脑组织损伤有明显的拮抗 作用.益元活血丹具有补肾益元,活血化瘀之效,治疗 老年人脑梗塞有明显的效果,能够抑制血小板的活化 和调节TXA一PGI间的平衡,拮抗自由基损伤和脂 质过氧化反应及钙超载等,对大鼠急性脑缺血损伤具 有明显的保护作用[4-6].血栓心脉宁是治疗心脑缺血 性疾病的中成药,具有开窍醒神,活血化瘀的作用.大 黄具有泻下逐瘀的作用,治疗脑梗塞具有明显的疗 效].我们以往的研究结果表明,尼莫地平,大黄,益元 活血丹,血栓心脉宁对脑缺血再灌注脑组织损伤均有 明显的保护作用,以血栓心脉宁组和尼莫地平促进胶 质细胞增多和益元活血丹促进神经细胞增大为显 着].因此,本研究以尼莫地平为对照,在肾虚血瘀,窍 闭血瘀,腑实等为中风病主要病机的理论指导下,观察 具有补肾活血作用的益元活血丹和开窍活血作用的血 栓心脉宁及通腑泻下大黄对老龄大鼠脑缺血再灌注脑 损伤保护作用机制,为中医药防治脑梗塞提供依据. CGRP与ET是两种对血管舒缩功能调控作用完 全相反的神经多肽.它们广泛分布于中枢,外周神经和 全身血管系统,以脑,心血管更加突出.CGRP及受体 结合后激活腺苷酸环化酶,使细胞内cAMP水平增高, 发挥强而久扩血管作用,对缺血再灌注组织起保护作 用.ET收缩血管的作用参与脑缺血损伤的病理过程, 主要与激活细胞膜上反应,使细胞内ca浓度增加有 关,.正常情况下两者保持相对稳定,维持动态平衡. 病理情况时两者平衡失控,相互制约,抑制释放,甚至 引起强烈持久的相互拮抗l_1].脑卒中患者血浆,脑脊 液(CSF)中CGRP,ET活性效应呈同步性变化,反应 敏感活跃,血浆CGRP与ET,CSF中CGRP与ET均 呈负相关.瞄梗塞以ET升高占优势.提示两者间平衡 失控是脑血管舒缩功能紊乱的重要物质基础;同期外 同血CGRP,ET变化显着说明脑卒中脑血循环障碍内 环境紊乱是整体反应的一部分,支持机体整体论点l_1]. 本研究结果显示,脑缺血再灌注使老龄大鼠脑组织 (,GRP含量降低,血浆和脑组织ET含量增高,造成以 ET占优势的CGRP与ET的平衡失调,如此可引起持 续时间长久的脑微血管收缩和低灌注状态l_1,从而更 加缺血,缺氧.ET缩血管作用所激发的自由基,兴奋性 氨基酸毒性,细胞内钙超载以及细胞酸平衡失调等因 素.进一步加重脑组织的损伤.益元活血丹能够明显提 高血浆和脑组织中CGRP含量;益元活血丹大剂量和 血栓心脉宁及大黄降低血浆ET效果显着,尼莫地平 和血栓心脉宁可使脑组织ET水平明显减低.表明4 组药物对调节脑缺血再灌注老龄大鼠脑组织和或血浆 CGRP与ET间的平衡均有一定的效果,其中以益元 活血丹和血栓心脉宁较为全面. NPY与NT是一组生物学作用相拮抗的活性多 肽.存在神经系统和血小板中等.在中枢神经中,NPY 是交感神经的辅递质,与儿茶酚胺共存于交感神经纤 维中.刺激交感神经节不仅可引起NE释放,同时促进 NPY分泌_1.血小板释放的NPY可引起血管收缩,心 叽抑制和血栓形成_1.缺血性脑血管病患者血小板中 NPY含量明显低于对照组,而血浆中NPY增高.提示 在脑梗塞,动脉硬化等病理因素所致的缺血性脑血管 疾病过程中,经常有血管内膜损伤,进而引起血小板聚 积并伴有NPY大量释放入血,致使血浆中NPY增 高一.NT主要生物学效应是强烈舒张血管,降血压.缺 血性脑血管疾病患者中,血小板提取液中NT水平增 高,是由于患者血浆中含有高水平的NPY,为拮抗 NPY强烈的缩血管作用和交感神经兴奋,从而促使血 小板合成分泌NT增多,是血小板中NT增高的重要 原因-25.说明在老化过程中,老龄大鼠血浆和脑组织中 NPY与NT间平衡失调,血浆中以NPY为优势,脑组 JTCM.June.2002,Vo1.43,No.6 织中以NT占优势,老龄大鼠血浆中以NPY占优势的 平衡失调,可促进血管收缩,易导致缺血性脑血管疾病 的发生,但脑组织局部以NT为主的平衡改变对血浆 整体以NPY为主的平衡失调进行了有益的代偿,脑缺 血再灌注使老龄大鼠这种有益的反应减低,破坏了整 体与局部的协调平衡.正如本研究结果所显示,脑缺血 再灌注老龄大鼠脑组织NPY含量明显增高,而NT的 变化不明显,表明脑组织NPY与NT间以NPY占优 势的平衡失调,交感神经兴奋,使老龄各脏器包括脑组 织动脉血管收缩或痉挛,缺血缺氧,导致组织损伤.本 研究结果显示,大黄,益元活血丹,血栓心脉宁及尼莫 地平均在调节脑组织神经肽NPY和NT含量方面均 有一定的作用,其中以尼莫地平和益元活血丹效果较 全面,改善NPY与NT间的平衡,维护血管正常的舒 缩功能,保护缺血再灌注的脑组织. 参考文献 1沈君,陈曼娥,沈吉平,等,CGRP,ET活性病变效应与急性脑卒中关 系的研究.中风与神经疾病杂志,1997,14(3):138140. 2罗南萍,杨道理,陈青,等.缺血性脑血管病患者血浆和血小板提取液 神经肽Y与神经降压素的改变.中国病理生理杂志,1999,15(8); 750—752. 3PulsinelliWA,BrierleyJB.Anewmodelofbilateralhemispheric ischemiaintheunanesthetizedrat.Stroke,1979,10(3):267272. 4李建生.益元活血方对老年腔隙性脑梗塞患者TXB2和6一Keto PGFl.的影响.辽宁中医杂志,1996,23(12);531—532. 5李建生.益元活血方治疗老年人腔隙性梗塞的观察及其对血小板功 能的影响.中国中医急症,1995,4(5):199201. ,等.益元活血丹治疗实验性脑梗塞的药效学 6鲁万强,李建生,赵君玫 实验.河南中医,1998,18(5):285—287. 7李建生.泻下法治疗中风的研究进展.辽宁中医杂志,2000,(增刊): 155—156. 8李建生.补肾活血,泻下及开窍活血方药对老龄大鼠脑缺血再灌注多 器官损伤的保护作用.河南中医,2000,20(3);1316. 1o余颂涛.内皮素——一种新的强效血管收缩肽.心血管病学进展, 1994,(4):208—211. 11BakkenIJ,VincentMB,WhiteLR.Mutualmodificationof vasoactivitybycalcitoningene——relatedpeptideandendothelin——1 inisolatedporcineophthalmicartery.Neuropeptides.1992.23(4): 209—214. 12谭敦勇,张继峰,陈晓彤,等.CGRP拮抗ET生物效应的研究.中国 病理生理杂志,1993;9(5):653. 13WilletteRN,SauermelchC,EzekielM,eta1.Effectofendothelinon corticalmicrovascularperfusioninrats.Stroke,1990,21(3):451— 454. 14成蓓,HaassM,RichardtG,eta1.刺激豚鼠心脏交感神经所致神经 肽Y和去甲肾上腺素释放的突触前调节.中华医学杂志,1991,71: 564—569. 15杨耀芳,杨丽华,施广璞.血小板释放的一种多肽一神经肽Y.国外 医学输血及血液分册,1992,15:197201.